专利名称：用于将物质递送至生物靶标的组合物和方法
技术领域：
本发明提供使用生物正交反电子需求Diels-Alder环加成反应(bioorthogonal inverse electron demand Diel s-Alder cycloaddition reaction)以供‘决速禾口特异生白勺共价递送“负载(payload) ”至结合于生物靶标的配体的组合物和方法。
背景技术：
用于在复杂生物环境下偶联物质的生物正交反应在生物学和医学中倍受关注。 此类反应已成为多种应用包括蛋白质工程、免疫测定开发和细胞表面修饰中的关键组成部分。(Link JA 等，2003，Curr Opin Biotechnol 14 :603-609 ；Wang Q 等，2003，J Am Chem Soc 12 :3192-3193 ；Dimandis EP 等，1991，Clin Chem 37 :625-636 ；Baskin JM 等， 2007, Proc NatlAcadSc. USA 104 :16793-16797 ；Link JA 等，2003，J Am Chem Soc 125 11164-11165)。目前，已报道了一些类型的生物正交反应，最流行的为Maudinger连接和叠氮化物和炔之间的[3+2]环加成“点击(click)”反应。(Prescher JA等，2004，Nature 430(7002) :873-877 ；Rostovtsev VV 等，2002，Angew Chem Int Ed 41(14) :2596-2599)。生物正交“点击”化学在化学生物学中广泛用于大量应用如基于活性的蛋白分析(activity based protein profiling)、蛋白交联、监视细胞增殖、生成新颖的酶抑制剂、监视新形成蛋白的合成、蛋白靶标的鉴定和研究聚糖加工。可能最吸引人的应用涉及使用这些生物正交化学在活系统如活细胞或甚至整个生物的存在下装配分子(Baskin等， 2007, Proc Natl Acad Sci U S A，104，16793-7 ;Laughlin 等，2008，Science，320，664-7 ； Prescher 禾口 Bertozzi，2005，NatChem Biol,1,13-21 ；Neef 禾口 Schultz，2009，Angew Chem Int Ed Engl, 48,1498-500 ;Ning 等，2008, Angewandte Chemie-International Edition, 47,2253-2255)。上述这些应用需要化学作用无毒，并具有允许用微摩尔浓度的试剂在数分钟至数小时的时间范围内发生快速反应的动力学。为了满足这些标准，已报道了多种“不含铜的”点击化学，如张力引发的 (strain-promoted)叠氮化物-炔环加成和Maudinger连接，以与培养中或体内系统如小鼠和斑马鱼(zebrafish)中的活细胞表面的叠氮化物反应O^rescher和Bertozzi，2005， Nat Chem Biol，1，13-21)。然而，迄今为止，在活系统中应用“点击”化学主要限于胞外靶标，且没有技术显示出可靠的特异性标记和成像胞内靶标的能力(Baskin和Bertozzi， 2007, QSAR Comb. Sci.，26，1211-1219)。这可能有几个原因。除了要满足“点击”化学的稳定性、毒性和化学选择性要求之外，胞内活细胞标记需要可方便地穿过生物膜的试剂以及使得哪怕仅靠勉强穿过细胞膜的低浓度试剂也能快速标记的动力学。此外，具有实用性的胞内生物正交偶联方案会需要引入下述机制，即荧光标记在共价反应时荧光增加，以避免显像累积的但非反应性的成像探针(即背景)。这种“开启(turn-on)”会显著地增加信噪比，其与成像活细胞内的靶标特别相关，因为不可能严格地洗尽未反应的探针。前几年已引入了多种优秀的探针，其荧光在叠氮化物-炔环加成或staudinger连接偶联反应之后增加(Sivakumar 等，2004，Org Lett, 6,4603-6 ；Zhou and Fahrni,2004, J Am Chem Soc,126,8862-3 ;Hangauer 禾口 Bertozzi,2008, Angew Chem Int Ed Engl,47, 2394-7 ;Lemieux等，2003，J Am Chem Soc，125，4708-9)。大多数这些策略或者需要紧密附于荧光团的反应基团从而需要合成新的荧光团框架，或者利用基于FRET的激活，其需要附加可充当能量转移剂的额外分子。此外，利用这些常用偶联方案的大多数探针迄今为止无法在活细胞中标记胞内靶标。生物正交的DielS-Alder反应与水性环境相容，并且具有二级速率常数，已知其在水性介质中与有机溶剂相比增强最多至几百倍。(Rideout DC等，1980，J Am Chem Soc 102 :7816-7817 ；Graziano G, 2004, J Phys Org Cheml7 100-101)。多种 Diels-Alder 反应是可逆的，因此，其可能并不适于进行生物标记。(Kwart等，1968，ChemRev 68 :415-447)， 然而，烯烃与四嗪的反电子需求Diels-Alder环加成导致不可逆的偶联，得到二氢哒嗪产物(图幻。在该反应过程中，在逆Diels-Alder步骤中释放双氮(Sauer J等，1965，Chem Ber998 =1435-1445)。在该反应中，已研究了多种四嗪和亲二烯体包括环状和直链烯或炔。 选择适当的反应对象，允许在几个数量级之内调谐(timing)偶联速率。(Balcar J等， 1983，Tet Lett 24 :1481-1484 ；Thalhammer F 等，1990，iTet Lett47 :6851-6854)。亦参见 US 2006/0269942、WO 2007/144200 和 US 2008/0181847。
发明内容
本发明提供基于生物正交反电子需求Diels-Alder环加成反应以供快速和特异性共价递送“负载”至结合于生物靶标的配体的方法和组合物。Diels-Alder反应连接该反应的两个组分，二烯和亲二烯体。二烯和亲二烯体各自在物理上连接于(例如通过接头) 所述负载或结合于所述靶标的配体。该生物正交化学平台可在胞外或胞内，在体内或体外使用。因此，本文中所述的方法和组合物包括使用反电子需求Diels-Alder环加成化学以化学偶联二烯与亲二烯体。在一些实施方案中，所述二烯为含有两个相邻氮原子的芳香杂环系统。在一些实施方案中，所述二烯为取代的四嗪。在一些实施方案中，所述二烯为含有两个相邻氮原子的芳香杂环系统，其中生物缀合释放双氮。在一些实施方案中，所述亲二烯体是烯如乙烯、丙烯或其他直链烯。在一些实施方案中，所述亲二烯体为内炔(internal alkyne)、端炔(terminal alkyne)或环炔如环辛炔。 在一些实施方案中，烯为具张力的烯(strained alkene)如降冰片烯和反式环辛烯。在一些实施方案中，本发明的特征为靶标特异性配体，如具有官能团(如胺、醇、 羧酸或酯)的抗体，其可化学偶联于小有机分子如含有可用于偶联于抗体的反应性模块 (如胺、醇、羧酸或琥珀酰亚胺酯)的反式环辛烯醇，以及可用于在Diels-Alder反应中与四嗪反应的亲二烯体如烯、羰基、亚硝基或亚胺。
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本文中还描述了标记和成像结合于活细胞的配体如小分子、抗体和其他生物分子的方法。这些方法包括使用涉及二烯如四嗪或其他具有至少两个位置彼此相邻的氮的芳香杂环系统与亲二烯体如具张力的烯、降冰片烯或反式环辛烯的反需求Diels-Alder化学。在一个方面，本发明包括用于将试剂(例如，如本文中所述的“负载”，例如，可检测试剂或治疗剂)递送至选定的生物靶标的组合物。所述组合物包括附于对所述生物靶标具有特异性的配体的第一组分；和附于所述试剂的第二组分，其中所述第一和第二组分各自选自二烯或亲二烯体，并为反电子需求Diels-Alder反应的反应物。因此，如果第一组分是二烯，则第二组分是亲二烯体，反之亦然。如本文中使用的术语“附于”包括化学链接，例如，通过反应性基团或接头，以及将所述二烯或亲二烯体掺入所述配体或试剂，例如，作为非天然氨基酸或核苷。在试剂为可检测试剂的实施方案中，所述可检测试剂可选自下组有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质以及造影剂。在一些实施方案中，所述可检测试剂连接于二烯，并在具张力的亲二烯体的存在下发生产生荧光的(fluorogenic)激活(即，其在缺乏所述亲二烯体时为非荧光性或弱荧光性的，并在亲二烯体存在下，当完成所述Diels-Alder反应时，变得具有更强的荧光)。在所述试剂为治疗剂的一些实施方案中，所述治疗剂可为例如小分子、酶抑制剂、 受体蛋白抑制剂、小干扰RNA(SiRNA)、细胞毒素、放射性离子或其他治疗剂。在另一个方面，本发明提供将可检测试剂递送至生物靶标的方法。所述方法包括将生物靶标与配体接触，其中所述配体连接于选自二烯或亲二烯体的第一组分以形成配体-靶标缀合物；将所述配体-靶标缀合物(且其中所述缀合物还连接于可检测试剂)与选自二烯或亲二烯体并参与与所述第一组分的反电子需求Diels-Alder反应的第二组分在使所述第一和第二组分进行反电子需求Diels-Alder反应的充足时间和条件下接触，由此将所述可检测试剂递送至所述靶标。在一些实施方案中，所述可检测试剂选自下组有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质和造影剂。在一些实施方案中，所述方法进一步包括检测所述可检测试剂，例如，使用组织化学、荧光检测、化学发光检测、生物发光检测、磁共振成像、核磁共振成像、X射线成像、X射线计算机断层术、超声成像或光声成像。在一些实施方案中，所述生物靶标在活细胞或死细胞、组织切片或生物之中或之上。在一些实施方案中，所述生物靶标是在体外测定中的。在另一个方面，本发明的特征为用于将治疗剂递送至生物靶标的方法。所述方法包括将生物靶标与配体接触，其中所述配体连接于选自二烯或亲二烯体的第一组分以形成配体-靶标缀合物；将所述配体-靶标缀合物(且其中所述缀合物还连接于治疗剂)与选自二烯或亲二烯体并参与与第一组分的反电子需求Diels-Alder反应的第二组分在使所述第一和第二组分进行反电子需求Diels-Alder反应的充足时间和条件下接触，由此将所述治疗剂递送至所述靶标。在一些实施方案中，所述治疗剂为小分子、酶抑制剂、受体蛋白抑制剂、小干扰RNA(SiRNA)、细胞毒素、放射性离子或其他治疗剂。在一些实施方案中，所述细胞毒素选自下组紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、 1-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美坦木素 (maytansinoids)、和它们的类似物或同源物。在一些实施方案中，所述放射性离子选自下组碘125、碘131、锶89、磷、钯、铯、 铱、磷酸根、钴、钇和镨。在一些实施方案中，所述治疗剂选自下组抗代谢药、烷化剂、蒽环类、抗生素和抗有丝分裂剂。除非另行定义，本文中使用的所有技术和科学术语的含意与本发明所属的领域的一般技术人员所通常理解的含意相同。在本文中描述了用于本发明的方法和材料；也可使用其他本领域中已知的合适的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅为说明性的，并不旨在限制。本文中提及的所有的公开出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他文献通过全文提述并入本文。在有抵触的情况下，以本说明书包括定义为准。本发明的其他特征和优点根据下述详述的描述和附图，以及根据权利要求书会是显而易见的。附图简述
图1显示了其中亲二烯体连接于配体而二烯连接于负载的实施方案，以及其中二烯连接于配体而亲二烯体连接于负载的实施方案。图2显示了使用二烯(取代的四嗪)和亲二烯体(烯或炔)的反电子需求 Diels-Alder 反应。图3显示了反电子需求Diels-Alder环加成物(cycloadduct)、染料-四嗪缀合物和反式环辛烯醇和环加成产物。图4显示在对反式环辛烯醇的环加成之前和之后染料-四嗪缀合物的吸收和发射光谱。图5是反应之前和之后染料光物理性质的列表。图6A显示Taxol 的结构和反式环辛烯紫杉醇类似物的结构。图6B显示紫杉醇、反式环辛烯紫杉醇和DMSO对照在缺乏GTP下聚合微管蛋白的能力的比较。图6C显示在用四嗪-B0DIPYFL处理的反式环辛烯紫杉醇存在下形成的并通过荧光显微术显影的微管束。发明详述本发明涉及用于将“负载”如治疗剂或可检测试剂递送至生物靶标的组合物和方法。这些方法包括应用使用生物正交化学的生物缀合如反电子需求Diels-Alder反应以递送负载如治疗或检测化合物，其使用特异性配体如抗体、小分子和其他生物分子。所述特异性配体(任选地通过接头)附于所述Diels-Alder对中的一个组分，而所述负载(也任选地通过接头)附于另一组分。举例而言，如果配体附于二烯，则负载附于亲二烯体；如果配体附于亲二烯体，则负载附于二烯。所述方法和组合物可用于例如体内和体外，胞外或胞内， 以及测定中如不含细胞的测定中。靶标本文中所述的方法和组合物可用于将负载递送至任何针对其存在或可生成特异性配体的生物靶标。所述配体可共价地或非共价地结合于所述靶标。示例性的生物靶标包括生物聚合物，例如蛋白质、核酸或多糖；示例性蛋白质包括酶、受体、离子通道。其他例示性靶标包括小分子，例如脂质、磷脂、糖、肽、激素或神经递质。 在一些实施方案中，所述靶标为组织或细胞类型特异性标记，例如，在选定组织或细胞类型上特异性表达的蛋白质。在一些实施方案中，所述靶标是受体，如质膜受体和核受体，但不限于此；更具体的实例包括配体门控离子通道、G-蛋白偶联受体和生长因子受体。在一个实施方案中，所述受体是表皮生长因子受体(EGFR)。配体配体可为特异性结合于选定靶标，并可通过任选地藉由接头加成二烯或亲二烯体来官能化的任何化合物，如小分子或生物分子(例如，抗体或其抗原结合片段)。抗体本文中使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原结合部分。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F(ab)和F(ab' )2片段，其保留结合抗原的能力。此类片段可市购或使用本领域已知方法获得。举例而言，F(ab) 2片段可通过用酶如胃蛋白酶处理抗体来生成，胃蛋白酶是一种通常产生一个F(ab) 2片段和许多Fc部分的小肽的非特异性内肽酶。所得的F(ab)2片段由两个通过二硫键连接的Fab单元组成。 Fc片段经彻底地降解，且可通过透析、凝胶过滤或离子交换层析从F(ab)2分离。F(ab)片段可使用木瓜蛋白酶生成，木瓜蛋白酶是一种特异性硫醇内肽酶，其在还原剂存在下将IgG 分子消化为三个类似大小的片段两个Fab片段和一个Fc片段。当着眼于Fc片段时，木瓜蛋白酶是优选的酶，因为其生成50，00道尔顿的Fc片段；为了分离F(ab)片段，可例如通过使用蛋白A/G的亲和纯化去除Fc片段。商业上可获得很多试剂盒以供生成F(ab)片段，包括 ImmunoPure IgGlFab 禾口 F(ab' )2Preparation Kit (Pierce Biotechnology, Rockford， IL)。此外，可使用商业上可获得的服务以供生成抗原结合片段，例如Bio Express, West Lebanon, NH0所述抗体可为多克隆、单克隆、重组例如嵌合的、去免疫化(de-immunized)或人源化、完全人的、非人的例如鼠类的、或单链抗体。在一些实施方案中，所述抗体具有效应物功能，并可固定补体。在一些实施方案中，所述抗体具有降低的结合Fc受体的能力或没有结合Fc受体的能力。举例而言，所述抗体可为不支持结合于Fc受体的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如，其具有经诱变或经缺失的Fc受体结合区。除了利用全抗体之外，本发明涵盖使用此类抗体的结合部分。此类结合部分包括 Fab片段、F (ab’)2片段和Fv片段。这些抗体片段可通过常规方法如蛋白水解片段化方法如 J. Goding,Monoclonal Antibodies Principles and Practice,pp. 98-118(N. Y. Academic Press 1983)中所述来制备。对于包括重复施用的应用例如人受试者的治疗处理，需要嵌合、人源化、去免疫化或完全人的抗体。所述抗体还可为单链抗体。单链抗体(scFV)可经工程改造(参见例如 Colcher 等，Ann. N. Y. Acad. Sci. 880 :263-80(1999)；以及 Reiter，Clin. Cancer Res. 2 245-52 (1996)) 0所述单链抗体可经二聚体化或多聚体化以生成对于相同靶蛋白不同表位具有特异性的多价抗体。在一些实施方案中，抗体是单价的，例如如Abbs等，Ther.
8Immunol. 1 (6) :325-31(1994)中所述，其通过提述并入本文。制备合适抗体的方法在本领域是已知的。参见，例如E. Harlow等编Antibodies A Laboratory Manual(1988)。在一些实施方案中，所述抗体特异性结合于肿瘤抗原，或肿瘤存在的组织中存在的抗原。已知多种针对癌症相关抗原的抗体(Ross等，Am J Clin Pathol 119(4) =472-485, 2003)。实例包括阿仑单抗(Alemtuzumab) (Campath)；达克珠单抗(Daclizumab)(赛尼哌 (Zenapax))；禾丨J妥昔单抗(Rituximab) (Rituxan)；曲妥单抗(Trastuzumab) (Herceptin)； 吉姆单抗(Gemtuzumab) (Mylotarg)；替依莫单抗(Ibritumomab) (Zevalin)；依决洛单抗(Edrecolomab) (Panorex)；托西莫单抗(Tositumomab) (Bexxar) ；CeaVac ；依中白珠单 Jtl (Epratuzumab) (LymphoCide) ； 7^ ^ ^ Jfl (Mitumomab)；贝 ifeUft (B evacizumab) (Avastin)；西妥昔单抗(Cetuximab) (C-225 ；Erbitux)；依决洛单抗(Edrecolomab)； 林妥珠单抗(Lintuzumab) (Zamyl) ；MDX-210 ； IGN-IOl ；MDX-010 ；MAb, AME ；ABX-EGF ； EMD 72000 ；Apolizumab ；Labetuzumab ；ior-tl ；MDX-220 ；MRA ；H-IIscFv ；Oregovomab ； huJ591MAb, BZL ；Visilizumab ；TriGem ；TriAb ；R3 ；MT-201 ；未缀合的 G-250 ；ACA-125 ； 0nyvax-105 ；CDP-860 ；BrevaRex MAb ；AR54 ； IMC-ICll ；GlioMAb-H ； ING-I ；抗 LCG 单抗； MT-103 ；KSB-303 ；Therex ；Kff-2871 ；抗 HMI. 24 ；抗 PTHrP ；2C4 抗体；SGN-30 ；TRAIL-RI MAb, CAT ；H22xKi-4 ；ABX-MAl ；Imuteran ；和 Monopharm-C。在其中所述配体对肿瘤抗原或癌组织具有特异性的实施方案中，负载可为治疗剂如细胞毒素、放射性试剂或其他可用于治疗癌症的治疗剂。小分子和生物分子小分子为低分子量有机化合物(低于2000道尔顿)。可用于本文中所述的组合物和方法的小分子以高亲和力结合于生物聚合物，如蛋白质、核酸或多糖，或其他生物靶标。 有用的小分子能够用亲二烯体或二烯官能化。举例而言，小分子可为试剂如紫杉醇，其特异性结合于微管并能够用亲二烯体如反式环辛烯或其他烯官能化。其他的实例包括特异性结合于激素、细胞因子、趋化因子或其他信号传导分子的受体的小分子。生物分子为由活生物产生的有机分子，包括大的聚合物分子如蛋白质、多糖和核酸以及小分子如初级代谢物、次级代谢物和天然产物。具体的小分子实例包括但不限于，雌二醇、睾酮、胆固醇、磷脂酰丝氨酸或磷脂酰胆碱。接头如本文中使用的术语“接头”指一组原子，例如0-500个原子，并可包含原子或基团如碳、氨基、烷基氨基、氧、硫、亚砜、磺酰基、羰基和亚胺，但不限于此。所述接头链还可包含饱和、不饱和或芳香环的一部分，包括多环和芳香杂环，其中所述芳香杂环是含有一至四个杂原子N、0或S的芳基。具体的实例包括但不限于不饱和的烷、聚乙二醇和右旋糖酐 (dextran)聚合物。所述接头决不能干扰配体与靶标的结合，或Diels-Alder反应。Diels-Alder 对本文中所述的组合物和方法包括使用包括二烯和亲二烯体的Diels-Alder对 (Diels-Alder pair)。二烯(例如取代的四嗪)与亲二烯体(例如烯或炔)的反电子需求 Diels-Alder环加成反应产生不稳定的环加成物，其随后发生反-Diels-Alder环加成反应以生成作为副产物的二氮和所需的二氢吡嗪(与烯反应之后)或吡嗪(与炔反应之后)产物(图幻。可对二氢吡嗪产物进行另外的氧化步骤以生成相应的吡嗪。生物正交化学使用四嗪和具高度张力的亲二烯体如降冰片烯和反式环辛烯之间的反电子需求 Diels-Alder环加成的生物缀合方法在文献中是已知的，然而使用的四嗪对于水性介质的稳定性有限。(Blackman 等，2008，J Am Chem Soc，1；30，I35I8-9 ;Devaraj 等，2009，Angew Chem Int Ed Engl,48,7013-6 ；Devaraj 等，2008，Bioconjug Chem,19,2297-9 ；Pipkorn 等，2009，J Pept Sci，15，235-41)。为了提高所述四嗪的稳定性，采用了在水和血清中表现出优越稳定性并可与反式环辛烯在37°C以大约IO3M-1Sec-1的速率反应的新颖不对称四嗪 (Devaraj 等，2009，Angew Chem Int Ed Engl, 48, 7013-6) 这种极其快速的速率常数允许以低纳摩尔浓度的四嗪标记剂标记胞外靶标，该浓度足够低以允许对探针积聚进行实时成像。举例而言，可修饰所述生物正交反电子需求Diels-Alder反应以提供使用配体如小分子和其他生物分子在活细胞内用于进行快速、特异性共价标记和成像的直截了当的方法。尽管在将多种选择性化学应用于胞外活细胞标记方面有长足发展，迄今为止，还没有广泛适用于胞内标记的方法。举例而言，本文中描述了一系列“开启”的连接四嗪的荧光探针， 其通过反电子需求Diels-Alder反应与具张力的亲二烯体如反式环辛烯快速反应。在环加成时，荧光强度急剧增加，在某些情况下增加 20倍。这种荧光“开启”显著降低背景信号。 这些用于针对配体如抗体、小分子或其他经具张力的烯修饰的生物分子的用于活细胞成像的新探针可提供用于标记和成像结合于特异性靶标的配体的一般方法。举例而言，可将该生物正交反电子需求Diels-Alder反应应用于不对称四嗪和具张力的烯，其物理偶联于小分子，即反式环辛烯修饰的紫杉醇类似物，并可用于标记和成像结合于胞内管(tubule)的这种小分子。快速的反应速率，与荧光“开启”一同使其成为近乎理想的揭示活细胞内小分子的方法。在一些实施方案中，所述配体例如抗体、小分子或其他生物分子物理附于亲二烯体(图1)。在一些实施方案中，所述配体携带官能团如胺、醇、羧酸或酯，或配体上其他可发生允许附于亲二烯体的化学反应的原子基团。或者，或另外，所述亲二烯体或杂亲二烯体(heterodienophile)(其可为例如烯、炔、亚硝基、羰基或亚胺)具有反应性官能团以供附于配体。因此，配体和/或亲二烯体上的反应性官能团发生化学反应在两者之间形成连接。在一些实施方案中，例如，当所述配体是生物聚合物如核酸、肽或多肽的情况下，配体上的官能团可为非天然核苷或氨基酸，例如，如Xie *khultz，Nat. Rev. Mo 1. Cell Biol. 7 775-782(2006)中所述的；举例而言，所述二烯或亲二烯体可作为侧链掺入非天然氨基酸。 本领域技术人员可方便地合成此类化合物。举例而言，苯丙氨酸或酪氨酸的侧链可用二烯例如四嗪取代；亲二烯体例如反式环辛烯或降冰片烯可取代苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、 亮氨酸或色氨酸的侧链。然后这些新的非天然氨基酸可与已知的非天然氨基酸类似地使用，例如，可在所述新的非天然氨基酸存在下温育细胞，并可产生包含已经掺入蛋白质一级结构的二烯或亲二烯体的蛋白质。在一些实施方案中，所述二烯可为取代的四嗪或其他具有至少两个氮彼此相邻并为反电子需求Diels-Alder反应中的高反应性参与物的芳香杂环系统。所述二烯连接于负载(其可为例如治疗剂、荧光染料或其他可检测试剂)(图幻。在这些实施方案中，所述二烯具有反应基团如胺、醇、羧酸或酯，或者可与负载上的反应性模块发生化学反应以在两者之间形成连接的其他基团。二烯可用于本公开的二烯包括但不限于含有两个相邻氮原子的芳香环系统，例如四嗪、哒嗪、取代或未取代的1，2_ 二嗪。其他1，2_ 二嗪可包括与第二缺乏π电子的芳香环结合的1，2_ 二嗪如吡啶并[3,4-d]哒嗪、哒嗪并[4,5-d]哒嗪(pyridazino[4，5-d] pyridazine)和1，2，4_三嗪。哒嗪也可与五元杂环稠合如咪唑并[4，5_d]哒嗪和1，2，3-三唑并[4，5-d]哒嗪。在一些优选实施方案中，所述二烯为本文中所述的不对称四嗪，例如 3-(对苄基氨基)_1，2，4，5，-四嗪(I)0
权利要求
1.一种用于将试剂递送至选定生物靶标的组合物，所述组合物包含第一组分，其附于对所述生物靶标具有特异性的配体；和第二组分，其附于所述试剂；其中所述第一和第二组分均选自二烯或亲二烯体，且为反电子需求Diels-Alder反应的反应物。
2.权利要求1的组合物，其中所述试剂选自可检测试剂或治疗剂。
3.权利要求2的组合物，其中所述可检测试剂选自下组有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质和造影剂。
4.权利要求2的组合物，其中所述可检测试剂连接于二烯，并在具张力的亲二烯体存在下发生产荧光激活。
5.权利要求2的组合物，其中所述治疗剂为小分子、酶抑制剂、受体蛋白抑制剂、小干扰RNA(SiRNA)、细胞毒素、放射性离子或其他治疗剂。
6.一种将可检测试剂递送至生物靶标的方法，所述方法包括将生物靶标与配体接触，其中所述配体连接于第一组分以形成配体-靶标缀合物，所述第一组分选自二烯或亲二烯体；将还连接于可检测试剂的所述配体-靶标缀合物与选自二烯或亲二烯体并参与与第一组分的反电子需求Diels-Alder反应的第二组分在使所述第一和第二组分进行反电子需求Diels-Alder反应的充足时间和条件下接触，由此将所述可检测试剂递送至所述靶标。
7.权利要求6的方法，其中所述可检测试剂选自下组有机小分子、无机化合物、纳米颗粒、酶或酶底物、荧光物质、发光物质、生物发光物质、放射性物质和造影剂。
8.权利要求6的方法，进一步包括检测所述可检测试剂。
9.权利要求8的方法，其中检测所述可检测试剂包括使用组织化学、荧光检测、化学发光检测、生物发光检测、磁共振成像、或核磁共振成像、X射线成像、X射线计算机断层术、超声成像或光声成像。
10.权利要求6的方法，其中所述生物靶标在活或死细胞、组织切片或生物之中或之上。
11.权利要求5的方法，其中所述生物靶标在体外测定中。
12.—种将治疗剂递送至生物靶标的方法，所述方法包括将生物靶标与配体接触，其中所述配体连接于第一组分以形成配体-靶标缀合物，所述第一组分选自二烯或亲二烯体；将还连接于治疗剂的所述配体-靶标缀合物与选自二烯或亲二烯体并参与与第一组分的反电子需求Diels-Alder反应的第二组分在使所述第一和第二组分进行反电子需求 Diels-Alder反应的充足时间和条件下接触，由此将所述治疗剂递送至所述靶标。
13.权利要求12的方法，其中所述治疗剂是小分子、酶抑制剂、受体蛋白抑制剂、小干扰RNA(SiRNA)、细胞毒素、放射性离子或其他治疗剂。
14.权利要求5的组合物或权利要求13的方法，其中所述细胞毒素选自下组紫杉醇、 细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素(colchicin)、多柔比星、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素、类美坦木素类、和它们的类似物或同源物。
15.权利要求5的组合物或权利要求13的方法，其中所述放射性离子选自下组碘 125、碘131、锶89、磷、钯、铯、铱、磷酸根、钴、钇90、钐153和镨。
16.权利要求5的组合物或权利要求13的方法，其中所述治疗剂选自下组抗代谢药、 烷化剂、蒽环类、抗生素和抗有丝分裂剂。
全文摘要
本发明提供使用生物正交性反电子需求Diels-Alder环加成反应以供快速和特异性共价递送“负载”至结合于生物靶标的配体的组合物和方法。
文档编号A61K49/06GK102271712SQ200980153250
公开日2011年12月7日 申请日期2009年11月2日 优先权日2008年10月31日
发明者尼尔.K.德瓦拉杰, 拉尔夫.韦斯莱德, 斯科特.A.希尔德布兰德 申请人:通用医疗公司