专利名称：增效蛋白在原核生物中的表达及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及在原核生物中表达昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白，含有昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的表达载体，用这种载体转化的大肠杆菌，在大肠杆菌中产生昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白的方法，以及表达的昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白在农林业中的应用。
现在已知，昆虫病毒增效蛋白(enhancin)是由昆虫病毒基因编码能显著提高病毒杀虫活性的一种功能性蛋白质。1998年，美国学者(Zhong J.and R.R.Grandos1998.VIIth International Colloguium on Invertebrate Pathology and Microbial ControlIVth Internatiol Conference on Bacillus thuringensis.Ausgust 23-2865)已将粉纹夜蛾颗粒体病毒(Trichoplusia ni granulosis virus简称TnGV)增效蛋白基因克隆于核型多角体病毒AcNPV，构建了重组病毒工程毒株，并用该毒株与野生型病毒混合使用，可显著提高粉纹夜蛾的杀虫效果。然而，这种工程病毒受到其宿主范围及其毒力的影响，因此在应用上有着局限。
本发明的目的是提供一种新型的含有粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的工程菌株，该菌株的构建方法、用途以及由该菌株生产增效蛋白的方法。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下一种新型的含有昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的工程菌株，含有昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的表达载体，并能在原核生物体内复制和高效表达，该菌种命名为E.coliM15(pQE-TnGVEnCp96)，已于2000年5月17日保藏于湖北省武汉市武汉大学中国典型培养物保藏中心，登记入册号为CCTCCM20007，该载体由下列DNA元件组成(1)粉纹夜蛾昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因；(2)大肠杆菌质粒复制起始点；(3)氨苄青霉素抗性基因；本发明用于构造粉纹夜蛾增效蛋白重组载体的原始材料有如下几种(1)粉纹夜蛾颗粒体病毒(TnGV)，由美国汤姆·杰弗逊大学赠送。
(2)受体大肠杆菌E.coliM15菌株，购自QIA-GEN公司。
(3)pQE载体，购自Promega公司。
(4)六个连续组氨酸编码区。
用来表达粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N端截短蛋白基因的载体通过基因工程方法获得，其构建方法是用SphI/PstI分别双酶切质粒pQE和重组质粒pGEM-T/En，并经0.7％低熔点琼脂糖凝胶电脉纯化回疏目的基因片段，用T4DNA连接酶于16℃水浴连接过夜，；转化感受态细胞E.coli M15(pREP4)，经Amp(氨苄青霉素)和Kan(卡那霉素)双抗平板筛选得到E.coli M15(pQE-TnGVEnCp96)。该工程菌株于2000年5月17日保藏于中国武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，登记号为CCTCC M20007。该工程茵株携带粉纹夜蛾昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的表达载体。
其中的重组质粒pGEM-T/En由下面方法构建根据已报道的粉纹夜蛾病毒(TnGV)增效蛋白基因序列[Hashimoto，Y.et.al1991，J.Gen.Virol72(11)2645-2651]，以TnGV基因组DNA作模板，设计引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATT，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法扩增增效蛋白基因，得到全长约2.9Kb的片段，与pGEM-T载体用T4DNA酶连接后，得到重组质粒pGEM-T/En。
将重组获得的携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M99102单菌落挑到内含100μg/ml的Amp(氨苄青霉素)和25μg/ml Kan(卡那霉素)的LB培养基中(25ml)，37℃，200rpm/min过夜培养，以1∶4比例接种到含上述双抗500ml LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7-0.9时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，常用诱导剂)到终浓度1mM，于37℃，200rpm诱导表达5hr，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法即可获得昆虫病毒增效蛋白质N末端截短蛋白。
利用携带昆虫病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因的大肠杆菌发酵生产的增效蛋白可作为有效成份提高病毒杀虫剂，BT杀虫剂，阿维菌素等生物杀虫剂的杀虫效果或单独用于转基因抗虫棉。
本发明提供了一种增效蛋白工程菌株E.coli M15(pQE-TnGV-EnCP96，该菌株的用途和构建方法，以及由此工程菌株生产昆虫病毒增效蛋白，该菌株含有颗粒体病毒增效蛋白N端截短基因。该增效蛋白可作为有效成份提高病毒杀虫剂，BT杀虫剂，阿维菌素等生物杀虫剂的杀虫效果，可使害虫死亡率明显提高，半数致死时间也明显减少。这种昆虫病毒增效蛋白也可单独以乳剂方式用于转基因抗虫棉。
图1为构建本发明的含TnGV增效蛋白的N端截短蛋白基因的表达载体pQE-TnGVEnCp96示意图；图2为构建重组质粒pGEM-T/En示意图。
以下结合附图和具体的实施方案对本发明的技术方案作进一步的说明，这些实施方案无意于以任何方式限制本发明权利要求所要求的范围。
(一)En-TnGV基因的PCR扩增1.TnGV-DNA的提取取TnGV悬液100μL，加等体积0.04mol/L NaOH碱解液及终浓度为1％的SDS，56℃水浴处理10分钟，待悬液半透明后，用碱性酚，酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1V∶V)混合液，氯仿∶异戊醇(24∶1 V∶V)混合液抽提TnGV-DNA各一次，无水乙醇沉淀DNA，-20℃放置过夜，离心后用75％乙醇洗涤DNA沉淀，自然干燥，将DNA溶于TE(Tris·HCl 10mM，EDTA 1mM pH8.0)缓冲液，于4℃保存。
2.En-TnGV基因的PCR扩增取TnGV-DNA 10μL，作10倍稀释，取2μl，100℃煮6min立即冰浴，按B.M.公司TaqDNA Polymerase试剂(从栖热水生菌YT-1中提纯得到的耐热的DNA多聚酶)操作手册，并参见Sambrook等在“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)的方法，加入(1)10×PCR反应缓冲液10μl，(2)两种引物各2μl，(3)10mmol/LdNTPs2μl，(4)Taq DNA polymerase(5U/μl)1μl，(5)补去离子水至100μl反应体积，(6)加石蜡油覆盖液面，进行PCR扩增。反应条件93.5℃变性60s，50℃退火90s，72.5℃延伸180s，循环30次，最后一次循环在72.5℃延伸7min，经电泳检测，得到单一的长约2.9kb的En-TnGV基因全长DNA片段。
(二)En-TnGV基因DNA片段的克隆1.En-TnGV基因PCR产物的磷酸化按Promega公司的T4噬菌体多核苷酸激酶操作手册并参见Sambrook等在“分子克隆”实验室手册，冷泉港，1989，在灭菌的0.5ml离心管中(1)加入En-TnGV基因PCR产物1μg，(2)激酶10×缓冲液4μl，(3)0.1mM的ATP2μl(4)T4多核苷酸激酶10U，(5)补加去离子水至40μl，37℃水浴30min，加入2μl 0.5M EDTA终止反应。加40μl苯酚∶氯仿∶异戊醇振荡1min，8,000rpm离心2min，再用氯仿∶异戊醇抽提1次，转移上清水相至一干净离心管，加入1/10体积3M乙酸钠，2倍体积无水乙醇，混匀，置于-20℃过夜，12,000rpm离心20min，弃上清，自然干燥，重悬DNA于20μL TE缓冲液。
2.连接En-TnGV基因PCR产物到pGEM-T质粒按Promega公司的pGEM-T载体操作手册并参见Sambrook等在“分子克隆”，实验窒手册，(冷泉港，1989)，在已灭菌干净的0.5ml离心管中，加入(1)10×T4DNA连接酶缓冲液1μl，(2)50ng/μl的pGEM-T载体，1μl，(3)约50ng的上述处理样品DNA，(4)3Weiss units/μl T4 DNA连接酶1μl，(5)补加去离子水至10μl，混匀后置4℃连接过夜。
3.连接产物转化E.Coli TG1，通过Sal I或BamHI或Kpn I单酶切鉴定其中的重组质粒DNA的正确结构，确定该工程菌株E.Coli TG1(pGEM-T/En)正确建立。
(三)En-TnGV N端截短基因～2.5Kb片段的克隆使用常规技术(参见Sambrook等在“分子克隆”，实验窒手册，冷泉港，1989)，分离提纯质粒pQE和pGEM-T/En。用PstI和SphI双酶切pGEM-T/En，获得～2.5Kb片段，通过低熔点琼脂糖回收该片段。将该片段连接到PstI和SphI双酶切的表达载体pQE中，转化E.ColiTG1，方法如下(1)大肠杆菌M15菌株感受态细胞的制备和转化从37℃培养16-20hr的新鲜LB平板中挑取E.coli M15单菌落，置3mlLB液体培养基试管中，37℃，200rpm培养过夜，再将菌液按1∶100比例接种于适量LB培养基中，37℃剧烈振荡培养约3hr(OD600＝0.3-0.4)，将菌液转入1.5ml无菌离心管，置冰上10min，待培养物预冷至0℃时，4,000rpm离心10min，收集菌体，倒出培养液以0.5ml冰冷的0.1mol/L CaCl2重悬细胞，置冰上半小时后，4,000rpm离心10min，倒出上清，加入100μl冰冷0.1mol/L CaCl2重悬细胞。所制成感受态细胞置4℃，并在12～24hr内使用。
在100μl E.coli M15菌株感受态细胞中加入8uL待转化的连接产物DNA(DNA≤50ng)，轻旋以混匀内容物，置冰上30min，于42℃水浴中热休克90s后，迅速移至冰浴中，待细胞冷却1-2min后，每管加入900μl SOC培养液(蛋白胨20g，酵母粉5g，NaCl0.5g，250mMKCl 10ml，5MnaOH调pH值至7.0，15磅20分钟高压灭菌。临用前加入5ml已灭菌的2MMgCl2，20ml已灭菌的1M葡萄糖溶液)，置37℃，150rpm温育45min，将转化细胞涂布至含100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养12-16小时后观察转化结果。
(2)重组质粒pQE-TnGVCp96的酶切鉴定将小量提取的重组质粒pQE-TnGVCp96用限制性内切酶PstI，EcoRI双酶切和SalI或PstI单酶切消化，用0.7％琼脂糖凝胶电泳，经EB染色后观察，通过与分子量比较DNA片段大小的方法进一步鉴定。
(四)SDS-PAGE电泳分析表达质粒中外源基因的表达1.凝胶的灌制参照参见Sambrook等在“分子克隆”(实验室手册，冷泉港，1989)的方法，配制8％的分离胶溶液15ml，依次混合各成分后加入催化剂TEMED(N，N，N’，N’四甲基乙二胺)，立即混匀并灌胶，封一层0.1％SDS覆盖液面，37℃下聚合30min。聚合完全后排净凝胶上的液体，以同样方法灌浓缩胶，插入梳子，避免产生气泡。
2.蛋白质样品的制备挑含待表达质粒的细菌M15(pREP4)单菌落在100μg/mlAmp，25μg/mlKan的LB培养基中37℃过夜活化，然后以1∶20稀释接种到含100μg/ml Amp，25μg/ml Kan的LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7～0.9时，取出未经诱导的细菌对照。加入IPTG至终浓度1mM，于42℃，200rpm培养30min后，降至37℃继续摇床培养5hr后收获细菌，4,000rpm离心10min，收集菌体沉淀，加入适量去离子水重悬菌体，置-20℃保存备用。
3.上样及电泳在样品中加等体积2×SDS凝胶加样缓冲液，于100℃加热3-5min变性，按顺序加样，最后在所有不用的加样孔中加上等体积的加样缓冲液，以100V电泳至溴酚兰进入分离胶，提高电压至150V，当溴酚兰到达底部前约1cm处结束电泳(约需4hr)。
4.固定，染色和脱色剥胶后以5倍体积染液固定并染色过夜(至少4小时以上)，将凝胶浸泡于脱色液中平缓摇动4hr以上，其间更换脱色液3次，脱色完全后即可进行观察和照相。
(五)纯化表达质粒中目的基因表达产物1.目的基因的表达挑含待表达质粒的细菌M15[pREP4]单菌落在100μg/ml的Amp和25μg/mlKan的25mlLB培养基中37℃，200rpm过夜活化，然后以1∶20比例接种到含100μg/ml Amp和25μg/ml LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7-0.9时，加入IPTG至终浓度1mM，于42℃，200rpm诱导表达30min后，降至37℃，继续培养5hr，收获菌液，4,000rpm离心10min，收集菌体沉淀，保存于-20℃备用。
2.确定目的基因表达产物的形式在细菌沉淀中加入2-5倍体积的声波处理液，反复冻融3次，置于冰中用超声波破碎细菌。置于光学显微镜高倍物镜观察，有大量晶体，然后置于电子显微镜下观察，进一步确定目的基因表达产物以包涵体形式存在。
3.不溶性蛋白的变性纯化把上述处理后的表达产物经30％-60％蔗糖梯度离心，取出包涵体带，洗糖三次，8,000rpm离心10min收集沉淀。每克沉淀重悬于5mlBufferB(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris·Cl，pH8.0)，在室温中搅拌沉淀1hr，10,000rpm离心15min，收集上清，加入8ml 50％Ni-NTA树脂(已在Buffer B中预平衡)，在室温中搅45min，然后小心加到直径为1.6柱中，用120mlBufferB冲洗，至流液A280＜0.01，再用Buffer C(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris·Cl，pH63)冲洗至A280＜0.01，然后用10-20ml BufferD(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01M Tris·Cl，pH5.9)洗脱重组蛋白质，最后用10-20ml BufferE(8M尿素，0.1M磷酸钠，0.01MTris·Cl，pH4.5)洗脱，每3ml收集一管洗脱液，进行SDS-PAGE电泳分析。
(六)表达产物的生物活性测定1.将HaNPV(简称Ha)和初步纯化的表达产物(简称P96)作10倍系列稀释并用血球计数板计数，设计①Ha3即HaNPV1.6×103PIBs/ml(多角体)，②Ha4即HaNPV1.6×104PIBs/ml，③Ha3P96即HaNPV1.6×103PIBs/ml＋P961.6×1060Bs/ml(包涵体)，④Ha4P96即HaNPV1.6×104PIBs/ml＋P961.6×1060Bs/ml四个处理液，另设计单蒸水对照和P961.6×1060Bs/ml对照。室温下将棉铃虫3龄幼虫单头饲养于6孔Costar细胞培养皿中，每孔加适量人工饲料，并加10μl上述各种处理液于人工饲料表面，使其充分吸收，幼虫取食48小时后补加足量新鲜的人工饲料，统计死亡和存活虫数(见下表)P96对HaNPV感染棉铃虫幼虫的增效活性
结果表明尽管P96自身未对幼虫产生致死效应，但可以提高HaNPV对棉铃虫3龄幼虫感染死亡率27.40-34.50％，缩短LT501.9天以上。
2.对Bt增效实施例将Bt菌粉(16000IU/mg)作1∶1000，1∶2000，1∶4000倍比稀释成三个不同浓度，人工饲料添食感染2龄棉铃虫幼虫，每个稀释度30头，2个重复，同时设立正常对照。根据统计结果，求得Bt对2龄棉铃虫幼虫致死中浓度为LC50为0.652g/l，取致死中浓度Bt稀释液与1×102IB/ml(pQE-TnGVEnCp96)复配，人工饲料添食感染2龄棉铃虫幼虫，每个稀释度30头，2个重复，同时设立单独Bt对照，结果试验对照组提高Bt对棉铃虫幼虫死亡率为34.5％。
3.对阿维菌素实施例将阿维菌素(1.8％乳油)作1∶3000，1∶6000，1∶12000倍比稀释成三个不同浓度，人工饲料添食感染4龄棉铃虫幼虫，每个稀释度30头，2个重复，同时设立正常对照。根据统计结果，求得阿维菌素(1.8％乳油)对老龄棉铃虫幼虫致死中浓度为LC50为1∶5800，取致死中浓度阿维菌素稀释液与1×102IB/ml(pQE-TnGVEnCp96)复配，人工饲料添食喂养4龄棉铃虫幼虫，每个稀释度30头，2个重复，同时设立单独阿维菌素对照，结果试验对照组提高阿维菌素对棉铃虫幼虫死亡率为25.6％。
权利要求
1.一种工程茵株，E.coli M15(pQE-TnGVEnCp96)，该工程菌株已提交到中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为CCTCC M20007。
2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于该工程菌株携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因，并能够在原核生物中表达。
3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于所含的重组表达载体由下列DNA元件构成(1).粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白基因；(2).大肠杆菌质粒复制起始点；(3).氨苄青霉素抗性基因。
4.一种构建权利要求1-3所述的工程菌株的方法，其特征在于用SphI/PstI分别双酶切质粒pQE和重组质粒pGEM-T/En，并经0.7％低熔点琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的基因～2.5KbDNA带片段，用T4DNA连接酶于16℃水浴连接过夜，；转化感受态细胞E.coli M15，经氨苄青霉素和卡那霉素双抗平板筛选得到E.coli M15(pQE-TnGVEnCp96)。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述的重组质粒pGEM-T/En由下面方法构建所得以TnGV基因组DNA作模板，设计引物P15’TCCTCCAATGTTGCACGATF，P25’AACTGACTGTTGAACGTTAT，PCR法扩增增效蛋白基因，得到全长约2.9Kb的片段，与pGEM-T载体用T4DNA酶连接后，得到重组质粒pGEM-T/En。
6.一种用权利要求1-3所述的工程菌株生产粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白的方法，其特征在于将重组获得的携带粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白的工程菌株CCTCC M99102单菌落挑到内含100μg/ml的氨苄青霉素和25μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，200rpm/min过夜培养，以1∶4比例接种到含上述双抗500ml LB培养基中继续培养，当其浓度达到OD600＝0.7-0.9时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷至终浓度1mM，于37℃，200rpm诱导表达5hr，收获菌液，4000rpm离心10min，收集菌体沉淀，再按常规方法即可获得粉纹夜蛾颗粒体病毒增效蛋白N末端截短蛋白。
7.权利要求1-3所述的工程菌株与昆虫病毒、苏芸金芽胞杆菌、阿维菌素或其它生物杀虫剂制备成复合生物杀虫剂在农林业用于病虫的生物防治，或单独使用增效工程蛋白用于转基因抗虫棉防治棉铃虫。
全文摘要
本发明公开了一种通过基因工程手段构建工程菌株:CTCC M20007 E.Coli M15(pQE－TnGVEnCp96)、工程菌株的构建方法和工程菌株的用途。该菌株是以TnGV为模板,PCR法产生TnGV增效蛋白基因,并构建含TnGV增效蛋白的N端截短蛋白基因的表达载体,转化E.Coli M15菌体所得。该菌株携带粉纹夜蛾昆虫病毒增效蛋白N端截短蛋白基因,并能够在原核生物中表达,从而获得昆虫病毒增效蛋白,该蛋白可作为有效成份提高病毒杀虫剂,BT杀虫剂,阿维菌素等生物杀虫剂的杀虫效果或单独用于转基因抗虫棉。
文档编号C12N15/33GK1331287SQ0011466
公开日2002年1月16日 申请日期2000年6月30日 优先权日2000年6月30日
发明者孟小林, 徐进平 申请人:武汉大学