专利名称：一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法
技术领域：
本发明涉及人组织激肽释放酶的提取，具体地说是一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法。
背景技术：
1930年有人首次在尿及胰腺中发现一种具有特殊功能的蛋白质，并将其称为组织激肽释放酶(kallikrein)。以后在血浆及许多组织中也发现存在着激肽释放系统。此系统除参与炎症反应、致痛等作用外，还具有重要的内源性降压作用，与高血压、肾病等疾病的发病也有联系。上一世纪八十年代，国外就已经注意到kallikrein的多种生理功能，并对其进行了系统的研究。有关其基因位点、组织表达和生理功能等的研究已有诸多报道。
kallikrein是一种丝氨酸蛋白酶，属于以丝氨酸残基为活性中心的丝蛋白酶家族下的一个亚类。kallikrein包括血浆kallikrein和组织kallikrein两种；正常情况下，绝大部分是以无活性的前体形式存在。组织kallkrein广泛存在于肾、胰腺、胃肠道粘膜及中枢神经系统等许多组织中，它以激肽释放酶原的形式在组织中合成，再经胰蛋白酶激活形成组织kallkrein，并可释放至血液循环。在体内组织Kallikrein能特异性的裂解血浆激肽原I，生成活性产物胰激肽，并可进入血浆，经氨基肽酶水解生成缓激肽。激肽与其受体结合，可以产生血管扩张、离子运输、平滑肌松弛或收缩、细胞生长的激发与抑制等多种生物效应；因此kallikrein能够起到维持局部血压、稳定血管畅通、参与血液和电解质平衡等生理调节作用，对酶原的活化、生长因子的活化、激素前体的加工也起着重要的作用。近年来的动物实验结果表明kallikrein可大大减轻试验老鼠的心脏肥大，梗死尺寸和心脏细胞死亡及纤维化。对于患血管硬化病的试验老鼠，kallikrein可以降低气囊诱发的内皮损伤之后的心内膜损伤，其保护作用由β1和β2受体完成。Kallikrein还可以降低和避免药物或盐诱发的肾脏损伤，包括肾小管破裂、肾小球硬化症、蛋白质管状物聚积及发炎。kallikrein还能够降低盐敏感高血压老鼠的撞击死亡率，对于后肢局部缺血的试验老鼠可加快其血流速度，由此可见kallikrein对于高血压、心脏疾病、肾脏疾病等皆有潜在的疗效。
直接进行人体的kallikrein的分离纯化难度较大，四川大学华西医学中心的王正荣等人在基因工程技术生产动物激肽释放酶及其应用方面作过一些有益的工作。美国南卡大学医学院Chao最先采用生物工程的方法将从胎儿肾细胞中得到的人组织kallikrein基因进行克隆，并构建出载有kallikrein基因的重组病毒。2000年深圳市人民医院李体远等人采用类似的方法在国内率先成功克隆出人kallikrein基因，经上海Sangon生物工程公司测序分析，这种新克隆的中国人体组织kallikrein基因与国际报道的基因序列完全一致。最近，武汉大学的研究者将载有人kallikrein基因的重组病毒注射到高血压大鼠的静脉中，可以使大鼠的血压降低到正常水平并保持长时间平稳。为了克服病毒在体内表达的弊端，Chao等采用昆虫细胞系进行表达。这种方法得到的人kallikrein相对安全、可靠，是实现基因工程人组织kallikrein规模化生产的可行方向。
目前实验使用的kallikrein一般采用从人尿液中提取的方法得到，作为药物应用的kallikrein产品几乎全部来源于从动物胰脏提取。从人尿中提取激肽释放酶必须先经过富集处理，并进一步通过膜色谱等方法进行分离纯化。由于kallikrein在活体组织及体液中含量极少，在1000L尿中最多只能提取得到17mgkallikrein，制备成本极高。
从动物组织中提取kallkrein，首先采用组织破碎，进一步采用盐析、色谱分离等方法进行纯化。由于动物激肽释放酶与人激肽释放酶在结构上的差异，糖基化程度不同，因此不同来源的样品，由于其本底组成的差别，分离纯化方法也不尽相同。其不足之处在于盐析、色谱分离是在多步骤操作下完成，十分繁顼，且多步操作损失较大，不适于大规模生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、适于大规模生产的基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法。
为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为本发明的分离纯化方法包括离心、离子交换层析、亲和层析等步骤，具体过程为(1)细胞培养上清液的分离将含有人组织激肽释放酶的培养液离心分离，取上清液备用；(2)离子交换层析分离①首先采用台阶梯度洗脱，以尽可能多地回收培养基中的人组织激肽释放酶；具体为用20～30mM、pH7～8的缓冲液平衡柱子，然后将上清液泵入柱内；用20～30mM pH7～8内含0.1～0.2MNaCl的缓冲液洗脱，待检测值低于0.05以下后换20～30mM pH7～8内含0.3～0.5M NaCl的缓冲液，人组织激肽释放酶此时解吸附，从柱内流出，收集此时的馏分，4℃贮存备用；柱子再生备用；其中缓冲液可以为Tris-HCl、磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液等；NaCl也可以用KCl替代；②采用台阶梯度与线性梯度相结合的方法，尽可能将人组织激肽释放酶与其它杂蛋白分离开；样品预处理所述步骤①中离子交换柱收集的馏分超滤(采用Centriprep10P)截留分子量为10Kda以上的滤器浓缩样品，然后将浓缩后样品重新溶解在10～20mM NaAc pH5.0～6.0的缓冲液中；样品分离先用10～20mM NaAc pH5.0～6.0平衡柱子，然后将处理好的样品载入柱内，用平衡缓冲液继续冲柱，直到A280吸收值降至0.05以下，再用10～20mM NaAcpH5.0～6.0内含0.05～0.1M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分a；然后用10～20mM NaAc pH5.0～6.0内含0.1～0.15M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分b，接着用线性梯度洗脱，洗脱液中盐成分范围为0.1M NaCl至0.5M NaCl，将大量人组织激肽释放酶洗脱下来，收集馏分，4℃保存；在所述馏分a和b中也有少量人组织激肽释放酶洗脱下来，可收集起来重新过柱；NaCl也可以用KCL替代；离子交换层析分离过程中所使用的离子交换剂可以为DEAE-cellulose、DEAE-sephadex或DEAE-spharose等多糖类离子交换剂，也可以采用DEAESepharose CL-6B等交联的琼脂糖类离子交换树脂。一般来讲，弱阴离子交换树脂皆可以用于这一步分离；(3)亲和色谱分离纯化按常规方法操作，得产品。
人组织激肽释放酶属于丝氨酸蛋白酶，可用特异性免疫亲和、苯甲酸胺(PAB)、抑肽酶(Aprotinin)等多种亲和色谱分离介质进行纯化。
Aprotinin-Agrose柱纯化方法a将活性馏分适当浓缩(超滤)后，转移至亲和柱上，用15-25mM Tris-HCl，pH6.5～7.5缓冲液充分洗涤；除去未吸附的蛋白质，至A280吸收值降至基线；然后用0.05～0.15mol/L GIy-HCI，pH2.0～3.0缓冲液洗脱；出现的洗脱峰即为目标产物；立即用0.3～0.5mol/L Tris中和；将中和后溶液对20～25mM磷酸缓冲液透析；冷冻干燥。Aprotinin-Agrose柱纯化方法b先用15～25mM Tris-HCl、pH7.5～8.5内含200～250mM NaCl的缓冲液平衡柱子，将样品载入柱内，用0.1～0.15M甘氨/HCl、pH2.0～3.0吸脱，收集洗脱峰，立即用0.3～0.5mol/L Tris中和，将中和后溶液对20～25mM磷酸缓冲液透析；冷冻干燥。
本发明具有如下优点1.本发明建立了一种离心、离子交换层析、亲和三步分离纯化方法；降低了操作成本，适于大规模生产应用。
2.在离子交换层析步骤中本发明利用弱阴离子交换树脂，采用PH与离子强度梯度结合的方法除去大部分杂蛋白，剩余的杂蛋白含量极低，分离后几乎只剩余两种相关蛋白；其所选条件不影响产物活性。
3.本发明在亲和分离步骤中采用抑肽酶作为分离介质，效果较好，而且可多次反复使用。
4.在亲和色谱步骤中本发明采用Tris-HCl缓冲液和甘氨酸/HCl进行冲洗，其条件缓和，对目标产品及亲和介质均无不良影响。
5.本发明目标产物峰出现后立即用Tris中和，以保持其稳定性。
6.本发明将亲和色谱馏分对磷酸缓冲液透析，进行溶媒置换，利于保存。
图1为含有表达基因工程人组织激肽释放酶细胞培养上清液的线性梯度分离谱图。
图2为台阶梯度条件下的初分离谱图。
图3为大量进样时的分离谱图。
图4为离子交换色谱分离结果的电泳检测谱图。
图5为采用台阶梯度与线性梯度结合的离子交换色谱分离谱图。
图6为凝胶色谱纯化结果谱图。
图7为亲和色谱分离结果谱图。
图8为最终产品的SDS-PAGE谱图。
图9为采用台阶梯度与线性梯度结合的离子交换色谱分离谱图。
图10为产品的SDS-PAGE谱图。
具体实施例方式
实施例1本发明的分离纯化方法包括离心、离子交换层析、亲和层析等步骤；具体过程包括1.细胞培养上清液的分离将细胞培养液置于聚碳酸酯离心管中，用巴氏吸管平衡；于高速离心机中，4℃，2000～000r/min离心20～30min。
将上清液倒入置有滤布的聚丙烯漏斗中滤置聚丙烯容器中，冷藏保存，供进一步离子交换层析用。
2.离子交换层析分离DEAE-Sepharose离子交换层析方法色谱柱16mm×20cm玻璃填充柱；填料DEAE-Sepharose离子交换填料；蠕动泵miniplus3，Gilson公司；检测波长280nm；流速5ml/min①先用20mM Tris-HCl pH7.6的缓冲液平衡柱子，然后将上清液用水稀释一倍泵入柱内。用20mM Tris-HCl pH7.6内含0.1M NaCl的缓冲液洗脱，待检测值低于0.05以下后换20mM Tris-HCl pH7.6内含0.3M NaCl的缓冲液，人组织激肽释放酶此时解吸附，从柱内流出，收集此时的馏分，4℃贮存备用。柱子再用3M NaCl洗脱下其它吸附的杂蛋白，用缓冲液平衡备用。
其结果如图2所示。SDS-PAGE检测结果如图4所示其中泳道1为低分子蛋白标准；泳道2为Lee Chao实验室赠送的基因工程人组织激肽释放酶纯品(rhUK)；泳道3为分段收集的rHUK；泳道4为在20M Tris-Hcl pH7.6with 0.3M NaCl时收集的馏份。图3为进样量加大100倍时的分离结果，其它实验条件与图2相同。
②样品处理前一步离子交换柱收集的馏分用Centriprep 10P截留分子量为10Kda的滤器浓缩样品，然后将浓缩后样品重新溶解在10M NaAc pH5.0的缓冲液中柱子先用10mM NaAc pH5.0平衡，然后将处理好的样品载入柱内，用平衡缓冲液继续冲柱，直到A280吸收值降至0.05以下，再用10mM NaAc pH5.0内含0.1M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分a。然后用10mM NaAc pH5.0内含0.15MNaCl的缓冲液洗脱，收集馏分b。接着用线性梯度洗脱，洗脱液中盐成分范围为0.15M NaCl至0.5M NaCl，此时大量人组织激肽释放酶被洗脱下来，收集馏分，4℃保存。在收集的馏分a和b中也有少量人组织激肽释放酶洗脱下来，可收集起来重新过柱。
其结果如图5所示其中色谱柱DEAE-Sepharose 16×200mm；缓冲液A10mM NaAc pH5.0；B10mM NaAc with0.5M NaCl；流速5ml/min，检测波长280nm；梯度条件；先用10mM NaAc pH5.0冲洗30min，再用10mM NaAcwith0.10M NaCl冲洗30min，再用10mM NaAc with0.15M NaCl冲洗30min最后用线性梯度洗脱，洗脱范围为0.15M NaCl至0.5M NaCl；rHUK在线性梯度段洗脱。
3.亲和色谱分离纯化人组织激肽释放酶属于丝氨酸蛋白酶，因此可用特异性免疫亲和、苯甲酸胺(PAB)、抑酶肽(Aprotinin)等多种亲和色谱分离介质进行纯化。使用抑酶肽亲和色潜效果较好，而且可多次反复使用。
具体操作可采用如下二种方式
Aprotinin-Agrose柱纯化方法1将活性馏分适当浓缩后，转移至亲和柱上，用15-25m MTris～HCl，pH7.0缓冲液充分洗涤；除去未吸附的蛋白质，至吸光度降至基线。然后用0.1mol/LGiy～HCI，pH2.8～3.0缓冲液洗脱；出现的峰即为目标产物；立即用0.5mol/L Tris中和；将此溶液对20mM磷酸缓冲液透析；冷冻干燥。
Aprotinin-Agrose柱纯化方法2柱子先用20mM Tris-HCl pH8.0内含200mM NaCl的缓冲液平衡，将样品载入柱内，用0.1M甘氨酸/HCl pH2.0吸脱，收集洗脱峰。立即用0.5moL/L Tris中和，将此溶液对20mM磷酸缓冲液透析；冷冻干燥。
其结果如图8所示其中泳道1为标品；泳道2为人组织激肽释放酶；可以看出用该方法可以制备出电泳纯rHUK。
其收率为80％；结果如图7所示其中色谱柱Shodex AFpak AAP-8948×50mm；缓冲液A0.02Mtris-HCl with 0.2M NaCl pH8.0；B0.1M甘氨酸pH2.0；流速1ml/min，检测波长280nm。
比较例11.细胞培养上清液的分离同实施例1；2.离子交换层析分离DEAE-Sepharose离子交换层析方法色谱柱16mm×20cm玻璃填充柱；填料DEAE-Sepharose离子交换填料；蠕动泵miniplus3，Gilson公司；检测波长280nm；流速5ml/min用线性梯度洗脱上清液，其结果如图1所示，其中色谱柱离子交换填料DEAE-Sepharose，16×200mm玻璃填充柱；线性梯度洗脱；缓冲液A20mMTris-HCl pH8.0，缓冲液B20mMtris-HCl、pH8.0with 0.5M NaCl；流速5ml/min；检测波长280nm。人组织激肽释放酶在盐浓度为0.3M时由柱中流出，从图中可以看出激肽释放酶夹杂在其它蛋白中，收集样品时很难确定收集的起止点，不适合作第一步分离。
比较例21.细胞培养上清液的分离同实施例1；2.离子交换层析分离DEAE-Sepharose离子交换层析方法色谱柱16mm×20cm玻璃填充柱；填料DEAE-Sepharose离子交换填料；蠕动泵miniplus3，Gilson公司；检测波长280nm；流速5ml/min①同实施例1；之后采用凝胶色谱过滤；色谱柱16×400mm玻璃填充柱；填料Sephcrtal S-200；Buffer0.005M磷酸钠+0.09M NaCl；流速1ml/min，检测波长280nm。
其结果如图6所示。从分离结果看，Sephcryal S-200并未实现将人组织激肽释放酶同杂蛋白有效分离这一目的，而且还扩大了体积，给后续处理带来更多麻烦。
比较例3因人组织激肽释放酶含有一个疏水基团，因此考虑使用疏水色谱作为①步纯化步骤，尽可能将人组织激肽释放酶与其它杂蛋白分开。
1.细胞培养上清液的分离同实施例1；
2.疏水色谱分离色谱柱16×200mm玻璃填充柱；填料苯基-琼脂糖凝胶6B；流速3ml/min；检测波长280nm色谱柱先用3M NaCl溶液平衡，然后将含有人组织激肽释放酶的细胞培养上清液配成3M NaCl溶液泵入柱内。继续用3M NaCl溶液洗脱，待检测值到0.05以下后，收集样品。经SDS-PAGE检测发现人组织激肽释放酶并未全部吸附于柱上，回收率低，且与其它杂蛋白的分离效果不如离子交换色谱。
实施例21.细胞培养上清液的分离同实施例1；2.离子交换层析分离DEAE-Sepharose离子交换层析方法色谱柱16mm×20cm玻璃填充柱；填料DEAE-Sepharose离子交换填料；蠕动泵miniplus3，Gilson公司；检测波长280nm；流速5ml/min①先用20mM Tris-HCl pH6的缓冲液平衡柱子，然后将上清液用水稀释一倍泵入柱内。用20mM Tris-HCl pH6内含0.1M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分a；待检测值低于0.05以下后换20mM Tris-HCl pH6内含0.3M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分b。SDS-PAGE检测后发现在穿过峰、馏分a及馏分b中均含有人组织激肽释放酶。其结果如图10所示，图中左数第六泳道为馏分b。
以下步骤同实施例1该条件下第一步无法实现最大限度地将人组织激肽释放酶与其它杂蛋白分离同时有高的收率这一目的。收率明显降低，只有50％左右。
实施例31.细胞培养上清液的分离同实施例1；2.离子交换层析分离DEAE-Sepharose离子交换层析方法色谱柱16mm×20cm玻璃填充柱；填料DEAE-Sepharose离子交换填料；蠕动泵miniplus3，Gilson公司；检测波长280nm；流速5ml/min①先用20mM Tris-HCl pH8.5的缓冲液平衡柱子，然后将上清液用水稀释泵入柱内。用20mM Tris-HCl pH8.5内含0.1M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分a；待检测值低于0.05以下后换20mM Tris-HCl pH8.5内含0.3M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分b。
以下步骤同实施例1。
收率82％。但经SDS-PAGE检测第一步组份b中杂蛋白的含量明显增多，给后续工作带来很多麻烦。
实施例41.细胞培养上清液的分离同实施例1；2.离子交换层析分离DEAE-Sepharose离子交换层析方法色谱柱16mm×20cm玻璃填充柱；填料DEAE-Sepharose离子交换填料；蠕动泵miniplus3，Gilson公司；检测波长280nm；流速5ml/min①同实施例1；②样品处理前一步离子交换柱收集的馏分用Centriprep 10P截留分子量为10Kda以上的滤器浓缩样品，然后将浓缩后样品直接上柱。
柱子先用10mM NaAc pH5.0平衡，然后将处理好的样品载入柱内，用10mM NapAc pH5.0内含0.1M NaCl的缓冲液洗脱。然后用10mM NaAc pH5.0内含0.15M NaCl的缓冲液洗脱。接着用线性梯度洗脱，洗脱液中盐成分范围为0.15M NaCl至0.5M NaCl，此时大量人组织激肽释放酶被洗脱下来，收集馏分。
从图9中可以看出该条件未能对样品进行分离，所有组分均在同一个洗脱峰中洗脱下来，没有达到进一步分离的效果。
实施例5第一步DEAE-Sepharose离子交换层析方法色谱柱16mm×20cm玻璃填充柱；填料DEAE-Sepharose离子交换填料；蠕动泵miniplus3，Gilson公司；检测波长280nm；流速5ml/min实验条件上样后用20mM Tris-HCl pH7.6 with 0.15M NaCl，洗脱至基线后改为20mM Tris-HCl with 0.25M NaCl，洗脱至基线后再改用20mM Tris-HClwith 0.5M NaCl洗脱至基线。收率76％。
权利要求
1.一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法，其特征在于具体过程操作如下(1)细胞培养上清液的分离将含有人组织激肽释放酶的培养液离心分离，取上清液备用；(2)离子交换层析分离①采用台阶梯度洗脱先用20～30mM、pH7～8的缓冲液平衡柱子，然后将上清液泵入柱内；再用20～30mM、pH7～8内含0.1～0.2M NaCl的缓冲液洗脱，然后换20～30mM pH7～8内含0.2～0.4M NaCl的缓冲液，收集此时的馏分，备用；②先用10～20mM NaAc、pH5.0～6.0平衡柱子，然后将样品载入柱内，用平衡缓冲液继续冲柱，再用10～20mM NaAc、pH5.0～6.0内含0.05～0.1M NaCl的缓冲液洗脱，收集馏分a；然后用10～20mM NaAc、pH5.0～6.0内含0.1～0.15MNaCl的缓冲液洗脱，收集馏分b；接着用线性梯度洗脱，洗脱液中盐成分范围为0.1M NaCl至0.5M NaCl，收集馏分保存；(3)亲和色谱分离纯化按常规方法操作，得产品。
2.按照权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于在所述步骤②前进行样品预处理将所述步骤①离子交换柱收集的馏分超滤截留分子量为10Kda的滤器浓缩样品，然后将浓缩后样品重新溶解在10～20mM NaAc pH5.0～6.0的缓冲液中。
3.按照权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于所述离子交换层析分离过程中所使用的离子交换剂为弱阴离子交换树脂。
4.按照权利要求3所述分离纯化方法，其特征在于所述交换树脂为多糖类离子交换剂DEAE-cellulose、DEAE-sephadex、DEAE-sepharose或交联的琼脂糖类离子交换树脂DEAE Sepharose CL-6B。
5.按照权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于所述离子交换层析分离过程中所使用的NaCl也可以用KCL替代。
6.按照权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于在所述步骤①中缓冲液可以为Tris-HCl、磷酸盐缓冲液或HEPES缓冲液。
7.按照权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于在步骤(3)中采用抑肽酶亲和色谱分离介质进行纯化。
8.按照权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于，在步骤(3)亲和色谱分离纯化的具体操作为Aprotinin-Agrose柱纯化将活性馏分浓缩，然后转移至亲和柱上，用15～25mM Tris-HC1、pH6.5～7.5缓冲液充分洗涤；再用0.05～0.15mol/L GIy-HCI、pH2.0～3.0缓冲液洗脱；收集目标产物；所述操作亦可以为先用15～25mM Tris-HCl、pH7.5～8.5内含200～250mMNaCl的缓冲液平衡柱子，将样品载入柱内，用0.1～0.15M甘氨酸/HCl、pH2.0～3.0吸脱，收集洗脱峰。
9.按照权利要求1所述分离纯化方法，其特征在于在步骤(3)亲和色谱分离纯化后产物立即用0.3～0.5mol/L Tris中和。
10.按照权利要求9所述分离纯化方法，其特征在于将中和后溶液对20～25mM磷酸缓冲液透析；冷冻干燥。
全文摘要
本发明涉及人组织激肽释放酶的提取，是一种基因表达人组织激肽释放酶蛋白的分离纯化方法。操作如下(1)上清液分离；(2)层析①台阶梯度洗脱先用20～30mM、pH7～8的缓冲液平衡柱子，然后上清液泵入柱内；用内含0.1～0.2M NaCl的缓冲液洗脱，然后换内含0.3～0.5M NaCl的缓冲液，收集馏分，备用；先用10～20mM NaAc、pH5.0～6.0平衡柱子，然后台阶梯度洗脱收集馏分；接着用线性梯度洗脱，洗脱液中盐成分范围为0.1M NaCl至0.5M NaCl，收集馏分保存；(3)亲和色谱分离纯化。其优点为降低了操作成本，适于大规模生产应用；分离效果较好。
文档编号C12N9/64GK1488753SQ0213316
公开日2004年4月14日 申请日期2002年10月11日 优先权日2002年10月11日
发明者张玉奎, 张维冰, 杨青, 徐茂兰 申请人:中国科学院大连化学物理研究所