化学防癌食物制品的制作方法

专利名称：化学防癌食物制品的制作方法
本申请是申请日为1996年9月13日、申请号为CN 96197883.X、发明名称为“化学防癌食物制品”的中国专利申请的分案申请。
美国政府对该发明拥有已付费的许可和在有限情况下要求专利持有者以合理的原因许可他人的权利，根据国家癌症研究所健康和人类服务部对题为“化学防癌的新策略”(Paul Talalay，主要研究者)提供的奖助金P01 CA 44530，政府具有这种许可权利。
I.发明领域本发明涉及一种减少动物及其细胞中的致癌物水平从而减少癌症发展危险的食疗方法。本发明特别涉及富含化学防癌的化合物食品的生产和消费方法。更具体地，本发明涉及调节参与致癌物新陈代谢的哺乳动物酶的化学保护化合物。本发明涉及富含可诱导相2酶活性的化合物的食物来源，该化合物无显著地诱导激活致癌物的相1酶的生物活性。
II.背景技术饮食在控制癌症发展起着很大的作用，以及多吃水果和蔬菜可减少人体内的癌症发生的观念现已得到广泛认同。人们认为保护的主要机理是植物内存在化学物质，当化学物质输递至哺乳动物细胞时可提高解除致癌物毒性的相2酶的水平。
对于某些化学物质的化学保护机理的早期研究认为这些化学保护物质诱导单加氧酶(也称为相1酶或细胞色素P-450)的活性。然而，Talalay等人[参见“通过诱导亲电解毒酶(相II酶)来化学防癌”(Chemical Protection Against Cancer byInduction of Electrophilc Detoxication(PhaseII)Enzymes)在“化学保护的细胞和分子靶”(CELLULAR AND MOLECULAR TARGETS OF CHEMOPREVENTION)，L.Wattenberg等人，CRC Press，Boca Raton，FL，pp469-478(1992)]认为，用已知的化学保护剂丁基化的羟基苯甲醚(BHA)对小鼠给药引起细胞色素P-450(相1酶)很小的变化，但很大地提高了相2酶活力。相2酶，可解除对DNA有破坏性的亲电型最终致癌物的毒性，如谷胱甘肽转移酶、NAD(P)H醌还原酶(QR)和葡糖醛酸转移酶。相2酶的选择性诱导物是指定的单功能诱导物(Prochaska&Talalay，“癌症研究”(Cancer Res.)484776-4782(1988))。单功能诱导物几乎都是亲电体，它们属于8个不同的化学物质类，它们包括(1)二酚、苯二胺和醌；(2)含有与吸电子基团共轭的链烯或乙炔的麦克尔加成反应受体；(3)异硫氰酸；(4)1，2-二硫羟基-3-硫酮；(5)氢过氧化物；(6)三价无机和有机砷的衍生物；(7)对硫羟基有亲和性的重金属，包括Hg2+和Cd2+；和(8)连二硫醇(Prestera等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902963-2969(1993))。这些诱导物仅有的明显的共有性质是它们可与硫羟基团反应。
化学保护剂可用于减少哺乳动物对毒性的敏感性和致癌物的致瘤作用。这些化学保护剂可以来自植物或合成的化合物。人们也制备了天然存在的诱导物的合成类似物，它们可抑制动物中的化学致癌作用(Posner等人，“医药化学杂志”J.Med.Chem.37170-176(1994)；Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913147-3150(1994)；Zhang等人，Cancer Res，(Suppl)541976s-1981s(1994))。
现在已经研究出了测定植物抽提物中提高或诱导相2酶活性的潜活的高效测定方法(Prochaska&Santamaria，“生物化学分析”“Anal.Biochem.”169328-336(1988)和Prochaska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892394-2398(1992))。而且，这些方法已用于分离植物中有诱导物活性的化合物，和评价这些化合物及其它们的合成类似物的抗致癌活性(Zhang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892399-2403(1992)和Posner等人，“医药化学杂志”J.Med.Chem.17170-176(1994))。
尽管在许多不同的可食性植物均发现有诱导物活性，但是根据科、属、种、变种或所选植物品种和生长及采集条件的不同，其量有很大的不同。因此，在本领域中需要确定具体的可食性植物，以及使这些可生成高水平的有化学保护作用的相2酶诱导物活性的植物生长和制备它们的方法。同样也需要确定生长和制备可形成有已知相2酶活性的特异性诱导物谱的可食性植物的方法，以提高与特异性致癌物或致癌物类结合灭活的效率。此外，还需要确定植物的培育和选择的方法来提高相2酶的诱导物活性并控制具体品种中形成的诱导物谱。
发明概要本发明的目的是提供富含化学防癌的化合物的食物制品和食物添加剂。
本发明的另一个目的是提供含有大量相2酶-诱导物而基本上没有相1酶-诱导物的食物制品。
本发明还有一个目的是提供含有大量相2酶-诱导潜活和无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷的食物制品。
这些目的以及其它目的可通过在2叶阶段前采集十字花科的芽苗(除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的芽苗外)来实现。十字花科的芽苗包括甘蓝变种(Brassica oleracea)的羽衣甘蓝(acephala)、芥蓝(alboglabra)、花椰菜(botrytis)、葡萄牙羽衣甘蓝(costata)、抱子甘蓝(gemmifera)、球茎甘蓝(gongylodes)、花茎甘蓝(italica)、髓茎甘蓝(medullosa)、泽西羽衣甘蓝(palmifolia)、千头羽衣甘蓝(ramosa)、皱叶卷心菜(sabauda)、甘蓝种萨贝利卡变种(sabellica)和和甘蓝种西兰夏变种(selensia)。
所述种子是甘蓝变种花茎甘蓝、甘蓝变种花椰菜或甘蓝变种花椰菜茎生花亚变种。
本发明的另一个实施例提供了除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的芽苗以外在2叶阶段前采集获得的十字花科芽苗，其中芽苗基本上没有相1酶诱导潜活。
本发明还有一个实施例提供了除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的芽苗以外在2叶阶段前采集获得的十字花科芽苗的无毒溶剂抽提物。无毒的溶剂抽提物可以是水抽提物。此外水抽提物还可包括十字花科的蔬菜，如包含活性黑芥子酶的萝卜属(Raphanus)的十字花科蔬菜。
本发明的另一个实施例提供了一种食物制品，它包含除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的芽苗以外在2叶阶段前采集得到的十字花科芽苗、芽苗或十字花科种子的抽提物、或其它任何芽苗或抽提物的组合。
本发明另一个实施例提供了一种增加哺乳动物体内相2酶的化学保护量的方法，方法包括用除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的芽苗以外在2叶阶段前采集得到的有效量的十字花科芽苗给药。
本发明还有一个实施例提供一种增加哺乳动物体内相2酶化学保护量的方法，方法包括用一种有效量的食物制品给药，食物制品包含除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的芽苗以外在2叶阶段前采集得到的十字花科芽苗。
本发明还有一个实施例提供在2叶阶段前采集得到的十字花科芽苗，其中芽苗在从生产所述芽苗的种子中长出3天后测得有至少为200,000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活，且含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。十字花科的芽苗包括甘蓝种的羽衣甘蓝(acephala)、芥蓝(alboglabra)、花椰菜(botrytis)、葡萄牙羽衣甘蓝(costata)、抱子甘蓝(gemmifera)、球茎甘蓝(gongylodes)、花茎甘蓝(italica)、髓茎甘蓝(medullosa)、泽西羽衣甘蓝(palmifolia)、干头羽衣甘蓝(ramosa)、皱叶卷心菜(sabauda)、甘蓝种萨贝利卡变种和甘蓝种西兰夏变种等变种。
本发明还有一个实施例提供一种食物制品，制品包括在2叶阶段前采集得到的芽苗、芽苗的或十字花科种子的抽提物、或任何芽苗或抽提物的组合，其中芽苗在从生产芽苗的种子中长出3天后测得有至少为200,000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活，且含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷；芽苗的或十字花科种子的抽提物；或芽苗的或抽提物的任何组合。
本发明还有一个实施例提供了在2叶阶段前获得的十字花科芽苗，其中芽苗在从生产芽苗的种子中长出3天后测得有至少为200,000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活，且含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷，且基本上没有相1酶-诱导潜活。
本发明另有一个实施例提供了在2叶阶段前获得的十字花科芽苗的无毒溶剂抽提物，其中芽苗在从生产所述芽苗的种子中长出3天后，测得有至少为200,000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活，并含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。无毒溶剂抽提物可以是水抽提液。此外，水抽提液可包括十字花科的蔬菜如包含活性黑芥子酶的萝卜属的十字花科蔬菜。
本发明还有一个实施例提供了一种增加哺乳动物体内相2酶的化学保护量的方法，方法包括用在2叶阶段前采集得到的有效量的十字花科芽苗给药，其中芽苗在从生产芽苗的种子中长出3天后，测得有至少为200,000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活，且芽苗含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。
本发明还有一个实施例提供了一种增加哺乳动物体内相2酶的化学保护量的方法，方法包括用有效量的含有在2叶阶段前获得的十字花科芽苗的食物制品给药，其中芽苗在从生产芽苗的种子中长出3天后，测得有至少为200,000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活，且芽苗含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。
本发明还有一个实施例提供一种制备富含芥子油苷的食物制品的方法，方法包括使除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜种子以外的种子发芽，并在2叶阶段前采集获得芽苗，以制成含有多种芽苗的食物制品。十字花科的芽苗包括甘蓝种的羽衣甘蓝(acephala)、芥蓝(alboglabra)、花椰菜(botrytis)、葡萄牙羽衣甘蓝(costata)、抱子甘蓝(gemmifera)、球茎甘蓝(gongylodes)、花茎甘蓝(italica)、髓茎甘蓝(medullosa)、泽西羽衣甘蓝(palmifolia)、千头羽衣甘蓝(ramosa)、皱叶卷心菜(sabauda)、甘蓝种萨贝利卡变种和甘蓝种西兰夏变种等变种，且芽苗含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。
本发明还有一个实施例提供一种富含芥子油苷的食物制品，食物制品的生产是使用除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜种子以外的十字花科萌发的种子制成，并在2叶阶段前采集得到芽苗，以制成含有多种芽苗的食物制品。
本发明另一个实施例提供一种制备食物制品的方法，方法包括用无毒溶剂将芥子油苷和异硫氰酸酯从十字花科芽苗中抽提出并回收抽提得到的芥子油苷和异硫氰酸酯，其中十字花科芽苗是除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的芽苗以外在2叶阶段前采集得到的芽苗。黑芥子酶或含有这种酶的蔬菜如萝卜属可与十字花科芽苗、抽提物或芽苗和抽提物两者一起混合。
在一个较佳的实例中，该方法还包括对所述抽提得到的芥子油苷和异硫氰酸酯进行干燥。
本发明还有一个实施例提供一种制备富含芥子油苷的食物制品的方法，方法包括使用十字花科发芽种子和在2叶阶段前采集得到芽苗以制成包含多种芽苗的食物制品，在从生产芽苗的种子中长出3天后，测得种子的相2酶诱导潜活至少为200,000单位/克鲜重，且含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。种子可包括甘蓝种的羽衣甘蓝(acephala)、芥蓝(alboglabra)、花椰菜(botrytis)、葡萄牙羽衣甘蓝(costata)、抱子甘蓝(gemmifera)、球茎甘蓝(gongylodes)、花茎甘蓝(italica)、髓茎甘蓝(medullosa)、泽西羽衣甘蓝(palmifolia)、千头羽衣甘蓝(ramosa)、皱叶卷心菜(sabauda)、甘蓝种萨贝利卡变种和甘蓝种西兰夏变种等变种。
本发明还有一个实施例提供一种富含芥子油苷的食物制品，食物制品的生产是使用十字花科发芽种子，和在2叶阶段前采集芽苗以制成包含多种芽苗的食物制品，在从长出芽苗的种子中长出3天后，测得种子的相2酶诱导潜活至少为200,000单位/克鲜重，且含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。这种有营养的制品含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。
本发明另一个实施例提供一种制备食物制品的方法，方法包括将芥子油苷和异硫氰酸酯用溶剂从十字花科种子、芽苗、植物或植物部分中抽提出并回收抽提的芥子油苷和异硫氰酸酯，其中长出芽苗、植物或植物部分的种子长出的芽苗在生长3天后测得相2酶诱导潜活至少为200,000单位/克鲜重，其中种子、芽苗、植物或植物部分含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。无毒的抽提溶剂可以是水。黑芥子酶或含有这种酶的蔬菜如萝卜属可与十字花科芽苗、种子、植物、植物部分或抽提物或其任何组合混合。
本发明还有一个实施例提供一种减少哺乳动物体内致癌物水平的方法，方法包括用除卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的芽苗以外的十字花科芽苗给药。
本发明还有一个实施例提供一种减少哺乳动物体内致癌物水平的方法，方法包括用十字花科芽苗给药，十字花科芽苗在从长出芽苗的种子中长出3天后测得相2酶诱导潜活至少为200,000单位/克鲜重，且含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。
本发明的另一个实施例提供一种通过将十字花科种子引入可食组分来制备食物制品的方法，种子在芽苗从种子中长出3天后测得相2酶诱导潜活至少为200,000单位/克鲜重，且含有无毒水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。
本发明还有一个实施例提供一种将芥子油苷和异硫氰酸酯从植物组织中抽提出来的方法，方法包括在抑制黑芥子酶活性的温度下使植物组织在过量的二甲基甲酰胺、丙烯腈和二甲基亚砜的混合物(DMF/ACN/DNSO)中匀浆化。
本发明还有一个实施例提供在2叶阶段前采集十字花科芽苗的方法，其中单功能与双功能诱导物之比至少为20比1。
本发明的另一个目的是提供一种补充入纯化的或部分纯化的芥子油苷的食物制品。
本发明的其它目的、特征和优点可从下列详细描述明显看出。然而，应当理解表述本发明较佳实施方案的详细说明和具体实施例只是用于描述，因为根据这些详细描述在本发明的范围和思路内所作的各种变化和改进对于本领域技术人员是显而易见的。
附图简述

图1显示了花茎甘蓝和小萝卜的有机溶剂抽提物的总诱导潜活随年龄的变化。
图2显示了从3天大的Saga花茎甘蓝芽苗的热的水性抽提物分离获得的芥子油苷的高分辨核磁共振谱。
发明具体实施方案I.定义在下面的描述中，广泛地用了许多术语。下面提供了下列定义有助于理解本发明。
双功能诱导物是一种可同时提高相1酶(如细胞色素P-450)和相2酶活性的分子，它需要芳烃受体(An)及其关连的共同应答元件(Xenobiotic Response Element，XRE)。例子包括平面芳香族如多环烃、偶氮染料或2，3，7，8-四氯-二苯并-对-二喔星(2，3，7，8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin，TCDD)。
化学保护剂是一种可减少哺乳动物内致癌物致毒和转致癌作用的敏感性的合成的或天然存在的化学试剂。
食物制品是任何含有本发明的芽苗、或从这些芽苗制得的抽提物或制品的可消化制品，它可将相2酶输递给消化食物制品的哺乳动物。食物制品可制成含有本发明的芽苗的新鲜制品如色拉、饮料或三明治。或者，含有本发明的芽苗的食物制品可以干燥、烹饪、煮沸、冻干或烘烤过的。也可考虑面包、茶、汤、谷类食品、药丸和药片等许多不同食物制品。
诱导物活性或相2酶诱导活性是衡量化合物诱导相2酶活性的能力的量度。在本发明中，诱导物活性是用鼠体内肝癌细胞QR活性的生物测定法来测定的。在这里，诱导物活性用Hepa 1c1c7细胞(鼠肝癌细胞)的QR诱导活性来定义，其中Hepa 1c1c7细胞与未用黑芥子酶处理的芽苗、种子或其它植物部分的抽提物一起培育。诱导物活性在96孔微量滴定板中生长的Hepa 1c1c7鼠肝癌细胞中测定。通常每个孔内加入10000个Hepa 1c1c7细胞。使肝癌细胞生长24小时，然后将含有微克量新鲜植物组织的植物抽提物通过微量滴定板连续稀释入新鲜的含有0.15mlαMEM的培养基中，培养基中还附加有10％胎牛血清(FCS)、链霉素和青霉素。再培育细胞48小时。用光学微量滴定板扫描仪测定在一个平板上获得的细胞溶解物中的QR活性(原理是形成棕蓝色的还原四氮唑染料)，并与其蛋白质浓度相关联。用计算机分析吸光度来获得定量的QR比活。一个单位的诱导物活性是加入一个微量滴定孔中使QR活性倍增的量。(参见Prochaska和Santamaria，生物化学分析“Anal.Biochem.”169328-336(1988)和Prochaska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892394-2398(1992))。
诱导潜活或相2酶诱导潜活是衡量植物组织中异硫氰酸酯加上可被黑芥子酶转化成异硫氰酸酯的芥子油苷的混合量的诱导物活性的量度。芥子油苷本身并不是哺乳动物相2酶的诱导物，但异硫氰酸酯是诱导物。因此，在这里，诱导物潜活定义为鼠Hepa 1c1c7肝癌细胞中的QR活性，其中Hepa 1c1c7细胞与用黑芥子酶处理过的芽苗、种子或其它植物部分的抽提物共同培育。因此在本发明中，诱导物潜活是用上述的鼠体内肝癌细胞QR活性的生物测定法来测定的。诱导物潜活在96孔微量滴定板中生长的Hepa 1c1c7鼠肝癌细胞中测定。通常，每个孔内加入10000个Hepa 1c1c7细胞。使肝癌细胞生长24小时，然后将含有微克量新鲜植物组织的植物抽提物通过微量滴定板连续稀释入新鲜的含有0.15mlαMEM的培养基中，培养基中还附加有10％胎牛血清(FCS)、链霉素和青霉素。植物抽提物中再加入黑芥子酶(6单位/ml植物抽提物)。黑芥子酶是根据对Palmieri等人的技术(“生物化学分析”Anal.Biochem.35320-324(1982))加以变化，从在不含附加营养物的琼脂糖上生长的7天大的小萝卜芽苗中纯化获得的。在234倍纯化后，黑芥子酶的比活为64单位/毫克蛋白质(单位是每分钟水解1μmol黑芥子苷所需的酶量)。在连续稀释7次后，将植物抽提物稀释200倍，稀释入原先的微量滴定板孔中。然后使孔再培育48小时。用光学微量滴定板扫描仪测定在一个平板上制得的细胞溶解物中的QR活性(原理是形成棕蓝色的还原四氮唑染料)，并与其蛋白质浓度相关联。用计算机分析吸光度来获得定量的QR比活。一个单位的诱导物潜活是指加入一个微量滴定孔中使QR活性倍增的量。(参见Prochaska和Santamaria，生物化学分析“Anal.Biochem.”169328-336(1988)和Prochaska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892394-2398(1992))。
单功能诱导物可选择性地提高相2酶活性而不显著提高相1酶的活性。单功能诱导物与功能的Ah受体无关，但借助于抗氧化物应答元件(ARE)可提高相2酶的转录。
十字花科芽苗是一种植物或在种子发芽后生长早期阶段的幼苗。将十字花科种子置于它们可以发芽生长的环境内。在种子发芽至2叶阶段(包括2叶阶段)后可采集本发明的十字花科芽苗。在使十字花科种子发芽生长的条件下培育3天后，本发明的十字花科芽苗含有至少200000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活。
II.描述水果和蔬菜减少人体内癌症发生的保护作用的主要机理与少量的化学组分有关，当它们输递至哺乳动物细胞时，它们可提高解除致癌物毒性的相2酶水平。现在发现某些可食植物的抗致癌活性可以提高。植物如花椰菜属通常是直到其形成菜花后才采集。通过使这些植物只生长至幼苗或芽苗阶段(即在发芽开始和2叶阶段间)，解除致癌物毒性防止癌症的酶的诱导物的水平至少是同种品种蔬菜处于商业阶段时的5倍。经常也可发现有10至1000倍的提高。
通过在早期幼苗或芽苗阶段采集植物或抑制其生长，可得到最多的诱导物潜活，并可制成一种消费者已经习惯的食物制品。这些芽苗的相2酶诱导潜活比从相同种子获得的成熟市售的蔬菜高几百倍。因此，通过食用较少量的芽苗而不是大量的市售蔬菜，人们即可摄取相同量的诱导物潜活。
已经发现大多数十字花科植物的诱导物潜活与其中的异硫氰酸酯及其生物前体芥子油苷的含量有关。芥子油苷可通过黑芥子酶(一种硫葡糖苷酶)来转变成异硫氰酸酯。通常黑芥子酶和芥子油苷可从细胞中分离获得，若细胞被破坏，则失去区室分隔作用，黑芥子酶将接触芥子油苷使其转变成异硫氰酸酯。
为筛选大量可食性植物并评价环境对那些蔬菜中的相2酶诱导物潜活的影响，需要对前述的那些蔬菜匀浆化和抽提的技术加以改进。原先所述的从蔬菜中抽提相2酶诱导物的技术包括在冰水中对蔬菜匀浆化、冻干、用乙腈抽提得到的粉末、过滤和蒸发浓缩(Prochaska等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892394-2398(1992))。
在确定了从花茎甘蓝获得的主要相2酶诱导物为1-异硫氰基-4R-(甲烷亚硫酰基)丁烷(sulforaphanc)后，将其对比抽提入热的80％的甲醇中，获得与前述乙腈抽提物相同的诱导物活性。当将黑芥子酶加入芥子油苷可自由溶解的热甲醇抽提物中后，大大提高了这些抽提物的相2诱导物活性(数据归纳在表1中)。这种用外源黑芥子酶来使芥子油苷转变成异硫氰酸酯的方法为测试蔬菜的相2酶诱导物给出了更好的指标。因此很明显，十字花科中主要量的潜在的相2诱导物是通常以芥子油苷(异硫氰酸酯的前体)存在于整个植物中的。
由于芥子油苷占大部分，且当十字花科植物组织受伤时芥子油苷可迅速转变成异硫氰酸酯，从而产生了改进的抽提方法。通过对溶剂混合物和新鲜蔬菜/溶剂匀浆物的水活性加以控制，形成了一种可对从相同的未浓缩样品中对芥子油苷和异硫氰酸酯定量的方法。蒸发浓缩除了在抽提过程中是速率限制步骤外，还使挥发性诱导物不被检测到。改进后的步骤是简单有效的，只需要植物样品在溶剂中充分匀浆化即可。因此本发明者可以证明用该技术从十字花科蔬菜中回收的诱导物活性和诱导物潜活比用以前的技术有显著的提高。
如果新鲜时摘取的蔬菜是迅速轻轻采集、直接放入包含DMF/ACN/DMSO混合物的有机溶剂中，并且在抑制黑芥子酶活性的温度下，可有效地将芥子油苷和异硫氰酸酯抽提入有机溶剂混合物中。DMF、ACN和DMSO最好以等体积混合。然而，混合物中这三种溶剂的体积可以不同，以使特异性芥子油苷和异硫氰酸酯从任何植物组织中的抽提最优。抽提的温度较佳的应小于0℃、更佳的应小于-50℃。抽提溶剂的温度必须保持在其冰点以上。同时，黑芥子酶(它总伴随这些物质存在于植物中并可将芥子油苷迅速转变为异硫氰酸酯)被灭活。这些抽提物通常含有大量的芥子油苷和少量的异硫氰酸酯。植物中黑芥子酶活性随不同的植物种类而不同。
芥子油苷本身不是哺乳动物相2酶的诱导物，然而异硫氰酸酯在QR活性的鼠肝癌细胞生物测定法中是单功能诱导物。植物抽提物中的诱导物潜活与诱导物活性不同，它可通过将从同种或其它植物来源纯化获得的黑芥子酶加入测定系统中来测定。
在人体内芥子油苷至少部分可转变为异硫氰酸酯。然而，如果需要加速该转变，可使黑芥子酶与富含芥子油苷的花茎甘蓝或其它蔬菜芽苗混合。混合物可以在水中，或其它使黑芥子酶灭活的无毒溶剂中。黑芥子酶可来自部分纯化或纯化的制品。或者，黑芥子酶存在于植物组织中，如少数富含黑芥子酶的十字花科芽苗，其包括小萝卜。这种制品可用于制成含有大量异硫氰酸酯和少量芥子油苷的“汤”来食入。诱导物潜活可用多孔平板用上述的体外测定鼠肝癌细胞的QR比活的诱导物潜活来测定。
植物组织中单功能与双功能诱导物活性之比可如上所述通过生物测定植物抽提物在野生型Hepa 1c1c7细胞以及变异的有Ah受体缺陷或细胞色素P1-450基因缺陷的c1和BP′c1中来测定。Prochaska和Talalay，癌症研究“CancerResearch”484776-4782(1988)。
本发明的采集后芽苗可立即组合入食物制品如新鲜色拉、三明治或饮料中。或者，采集芽苗的生长可用某些有效人为干扰来抑制，如在2叶阶段前的生长阶段时(通常为种子发芽后1至14天内)进行冷冻。生长抑制也可通过将芽苗从其基质和/或水源中除去来实现。可用冷冻、干燥、烘烤、烹饪、冻干和煮沸来抑制生长。这也可根据具体情况所需来用于抑制芽苗内黑芥子酶的活性(如冻干)或灭活芽苗中黑芥子酶活性(如煮沸)。
也可使采集的芽苗在制入食物制品前在不同的生长条件下继续生长。例如可在生长非常年轻的阶段如在种子吸涨1至2天后采集。然后，使芽苗在不同的生长条件下生长，如提高或降低光强度、温度或湿度；使其暴露在紫外光或其它胁迫下；或加入外源营养物或植物生长调节剂(激素)。然后芽苗可立即制入食物制品中，如用于新鲜食用色拉中。或者，可抑制芽苗的生长和/或进一步用冻干、干燥、用水或其它溶剂抽提、冷冻、烘烤、烹饪或煮沸来处理。
如果芽苗不含非可食性的基质如连带的或粘附在其上的土壤，则芽苗是适于人食用的。通常芽苗是生长在非营养型固体基质如琼脂、纸巾、废纸、蛭石、珍珠岩等上，并对其提供水和光。因此，如果芽苗不是生长在土壤中，而是生长在固体基质上的话，就不需要清洗来除去不可食用的土壤。如果芽苗是长在颗粒化固体基质如土壤、蛭石或珍珠岩上，则需要清洗以获得适于人食用的芽苗。
芽苗可长在适于运输和销售的容器中。通常，这些容器是底部含有润湿苗床的塑料盒或瓶中。这些容器可使光透过，而只是提供了机械的保护层。培育的芽苗的许多方法是已知的，例如美国专利No.3,733,745，3,643,376，3,945,148，4,130,964，4,292,760或4,086,725中所举的例子。含有本发明的芽苗的食物制品可保藏在各种容器如瓶、盒和箱中运输。
适用于癌症化学保护剂来源的芽苗通常是十字花科芽苗、除了卷心菜(Brassica oleracea capitata)、独行菜(Lepidium sarivum)、芥菜(白芥Sinapis alba和黑芥S.niger)和小萝卜(Raphanus sativus)的芽苗以外。选出的芽苗通常是选自十字花科芸苔(Brassiceae)族芸苔(Brassicinae)亚族。较佳的芽苗是选自羽衣甘蓝(acephala，kale，collards，wild cabbage，curly kale)、髓茎甘蓝(medullosa、marrowstem kale)、千头甘蓝(ramosa，thousand head kale)、芥蓝(alboglabra，Chinesekale)、花椰菜(botrytis，cauliflower，sprouting broccoli)、球茎甘蓝(gongylodes，kohlrabi)、花茎甘蓝(italica，broccoli)、泽西甘蓝(palmifolia，Jersey kale)、皱叶卷心菜(sabauda，savoy cabbage)、羽衣甘蓝(sabellica，collards)和羽衣甘蓝(selensia，borecole)的花椰菜属。
在表述的方法中特别有用的花茎甘蓝品种是沙加(Saga)、得西科(Decicco)、埃佛勒斯(Everest)、翠绿城(Emerald City)、帕克曼(Packman)、格林福莱特(GreenValiant)、亚卡叠(Arcadia)、卡拉布利斯卡拉维尔(Calabrese Caravel)、强斯勒(Chancellor)、希特新(Citation)、克鲁伊斯(Cruiser)、早紫发芽红箭(Early PurpleSprouting Red Arrow)、优利卡(Euureka)、埃克塞斯尔(Excelsior)、盖利昂(Galleon)、金加(Ginga)、哥里亚斯(Goliath)、格林杜克(Green Duke)、格林贝尔特(Greenbelt)、意大利发芽(Italian Sprouting)、晚紫发芽(Late Purple Sprouting)、晚冬发芽白星(Late Winter Sprouting White Star)、雷金德(Legend)、利普里强(Leprechaun)、马拉森(Marathon)、马利娜(Mariner)、密纳利特(Minaret(Romanesco))、帕拉宫(Paragon)、帕特利特(Partriot)、普利姆克落普(Premium Crop)、拉品(Rapine(SpringRaab))、罗萨林德(Rosalind)、萨雷德(Salade(Fall Raab))、萨姆莱(Samurai)、秀根(Shogun)、斯普林特(Sprinter)、苏丹(Sultan)、台壳(Taiko)和特莱谢(Trixie)。然而，其它许多花茎甘蓝品种也是适用的。
特别有用的花椰菜品种是阿佛达(Alverda)、亚美金(Amazing)、安德斯(Andes)、布干迪葵因(Burgundy Queen)、堪迪恰姆(Candid Charm)、卡许美尔(Cashmere)、克里斯马怀特(Christmas White)、多密南特(Dominant)、埃尔比(Elby)、特早雪球(Extre Early Snowball)、复利蒙特(Fremont)、因克莱(Incline)、密克维密特曼(Milkyway Minuteman)、拉许摩尔(Rushmore)、S-207、色拉诺(Serrano)、斯拉内华达(Sierra Nevada)、斯利亚(Siria)、斯诺克郎(Snow Crown)、斯诺福雷克(Snow Flake)、斯诺格雷斯(Snow Grace)、斯诺布雷德(Snowbred)、苏莱德(Solide)、台番(Taipan)、外类特葵因(Violet Queen)、怀特巴隆(White Baron)、怀特比肖普(White Bishop)、怀特肯特萨(White Contessa)、怀特克落那(White Corona)、怀特德福(White Dove)、怀特福莱士(White Flash)、怀特福克斯(White Fox)、怀特耐特(White Knight)、怀特莱特(White Light)、怀特葵因(White Queen)、怀特洛克(WhiteRock)、怀特塞而斯(Whitc Sails)、怀特萨姆(White Summer)、怀特脱普(White Top)、优肯(Yukon)。然而，其它许多花椰菜品种也是适用的。
种子在种子能发芽生长的条件下培育3天后，测得合适的芽苗有至少200000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活。较佳的，芽苗应有至少250000单位/克鲜重的诱导潜活，或甚至是300000单位、350000单位、400000单位或450000单位。一些样品在从种子中长出3天后发现含有大于500000单位/克鲜重的诱导潜活。
发现十字花科种间甚至是品种间诱导活性和诱导潜活的水平是不同的。较佳的，芽苗应基本上不含对哺乳动物细胞有相1酶诱导潜活的吲哚芥子油苷及其分解产物，且基本上不含致毒水平的致甲状腺肿腈类和芥子油苷如羟基丁基芥子油苷，它在水解时产生的噁唑烷硫酮是致甲状腺肿的。成熟的抱子甘蓝和油菜中富含这些不希望的芥子油苷。
本发明的无毒溶剂抽提物可用作健康的浸剂或汤。用于本发明中抽提的无毒或易除去的溶剂包括水、液体二氧化碳或乙醇。芽苗可用冷的、暖的或最好用热的或煮沸的水来抽提，以使黑芥子酶变性或灭活。在抽提后，残余的芽苗可以从抽提物中除去或不必除去。抽提过程可用来灭活芽苗中的黑芥子酶。这有利于诱导物潜活的稳定。抽提物可直接食用或进一步进行处理。例如，它可被蒸发以制成干的抽提制品。它可被烹调、冷冻或冻干。它可与含有活性黑芥子酶的十字花科蔬菜混合。这将使芥子油苷在食用前迅速转变成异硫氰酸酯。含有活性黑芥子酶的合适蔬菜是萝卜属，特别是小萝卜。
发现种子和芽苗一样非常富含诱导物潜活。因此，在本发明的范围中也用十字花科种子作为食物制品。合适的十字花科种子可研磨成粉末或粗粉以用作一种食物或饮料补充物。粉末或粗粉可制入面包、其它烘烤制品、或健康的饮料或冰淇淋中。或者，可用无毒溶剂如水、液体二氧化碳或乙醇来抽提种子以制成汤、茶或其它饮料和浸剂。种子也可不磨碎就制入食物制品中。种子可用于许多不同的食物中如色拉、燕麦花卷、面包和其它烘烤的食物中。
本发明的食物制品可包括从一种或多种不同十字花科属、种、变种、亚变种或品种获得的芽苗、种子或芽苗或种子的抽提物。发现遗传不同的十字花科类可产生化学上不同的相2酶诱导物。不同的相2酶诱导物以不同的速度从化学上解除不同致癌物的毒性。因此，含有不同遗传性的十字花科芽苗或种子或从这些芽苗或种子制得的抽提物或制品的食物制品可解除很大范围的致癌物的毒性。
芥子油苷和/或异硫氰酸酯可用该领域已知的方法来从种子或植物抽提物中纯化获得。(参见Fenwick等人，CRC Crit.Rez.Food Sci.Nutr.18123-201(1983)和Zhang等人，Pro.Natl Acad.Sci.USA 892399-2403(1992))。纯化的或部分纯化的芥予油苷或异硫氰酸酯可以补充加入食物制品中。加入食物制品的芥子油苷和/或异硫氰酸酯的剂量最好在1μmol至1000μmol间。然而，补充加入食物制品的芥子油苷和/或异硫氰酸酯的剂量也可更高。
选择在芽苗、种子或植物其它部分有较高相2酶诱导物潜活的植物可与十字花科培育过程结合。而且，这些相同培育过程可包括鉴定和选择可生成特异性相2酶诱导物或特定的相2酶诱导物谱的品种。十字花科新品种的杂交、选择和培育方法是该领域技术人员已知的。(白菜类作物和野生型类似物“Brassica Cropsand Wild AlliesBiology&Breeding”；S.Tsunoda等人(eds)，日本科学出版社“Japan Scientific Societies Press”，东京，pp.354(19880))。可根据相2诱导物活性或在特定植物生长阶段产生的特定相2酶诱导物的化学特性筛选后代植物。可鉴定有感兴趣的特征的植物，以及用植物培育领域熟知的培育技术来加强这些特征或使之与其它重要农业特征相结合。
实施例1十字花科芽苗诱导潜活的比较芽苗用来自十字花科的不同种的表面消毒过的种子来制备，表面消毒首先是在70％乙醇中处理1分钟，然后在含约0.001％Alconox洗涤剂的1.3％次氯酸钠中处理15分钟。使种子在无菌塑料容器中在0.7％不含附加营养物的琼脂基质上生长1至9天，种子密度约为8个种子/cm2。用宽谱荧光照明、湿度和温度控制来严格控制环境。使种子和芽苗每天在25℃下在光照下培育16小时，以及在20℃下在暗处培育8小时。
在培育3天后采集芽苗并立即投入10体积的-50℃的混合物中，混合物中包含等体积的DMF/ACN/DMSO。该溶剂的冰点约为-33℃，但当其与10％的水混合时，如在植物材料中所发现的，其冰点降至-64℃以下。而植物材料中的真实的冰点降低程度则更大。
通过在玻璃-玻璃匀浆器中先用所用总溶剂的少量，然后逐渐加入更多的溶剂来手工研磨样品，或者用Brinkman Polytron匀浆器在最大功率半值下在10体积溶剂中匀浆1分钟可打成匀浆。然后离心匀浆物除去剩余的颗粒并保藏在-20℃下直至测定。
如上所述制得植物抽提物的诱导物潜活，用上述定义部分所述的微量滴定板生物测定法来测定。
在种子培育3天后采集花茎甘蓝和花椰菜的芽苗并在生长条件下测得相2酶诱导物潜活大于200000单位/克鲜重。另外，在相同时间下测得卷心菜、独行菜、芥菜和小萝卜的相2酶诱导物潜活小于200000单位/克鲜重。
实施例2不同花茎甘蓝品种的诱导物潜活的不同不同的花茎甘蓝品种的诱导物潜活不同。而且，十字花科中大多数的诱导物潜活是以芥子油苷前体存在的。市售的花茎甘蓝菜花头的诱导物活性和诱导物潜活在DMF/ACN/DMSO抽提后用如上所述的QR活性测定法测定。
这些市售花茎甘蓝菜花头的匀浆物在加入或不加入纯化过的植物黑芥子酶后用生物测定法测得，在没有黑芥子酶时的QR活性的量是加入黑芥子酶所发现的量的不到5％。这一发现证实了前者的建议(参见Matile等人，生物化学生理学“Biochem.Physiol.”，Pfianzen 1795-12(1984))，即未受损的植物几乎不含游离的异硫氰酸酯。
表1黑芥子酶对市售花茎甘蓝菜花头的诱导物活性的影响
*低于检测的范围(833单位/克)。
从表1中可发现，大多数的植物诱导物潜活是从芥子油苷在用黑芥子酶水解后形成异硫氰酸酯而获得的。因此，水解是生物活性所需的。
实施例3诱导物潜活在种子中最高，并随芽苗成熟而减少相2酶诱导物潜活在种子内是最高的，并随种子的早期生长而逐渐减少。植物用来自花茎甘蓝Saga品种和DeCicco品种的表面消毒过的种子来制备，表面消毒首先是在70％乙醇中处理1分钟，然后在含约0.001％Alconox洗涤剂的1.3％次氯酸钠中处理15分钟。使种子在无菌塑料容器中在0.7％不含附加营养物的琼脂基质上生长，种子密度约为8个种子/cm2。用宽谱荧光照明、湿度和温度控制来严格控制环境。使种子和芽苗每天在25℃下在光照下培育16小时，以及在20℃下在暗处培育8小时。
每天从折叠容器的琼脂表面迅速地轻轻地收集植物。采集植物时应轻轻地，以尽量减少芥子油苷被植物受伤害时释放的内源黑芥子酶水解。将含有约40株芽苗的样品在10体积-50℃的DMF/ACN/DMSO溶剂中匀浆，以使几乎所有的非木质素植物材料溶解。
将采集的植物打匀浆，并如上所述测定有或没有黑芥子酶时的QR活性。从图1可看出，种子内的相2酶诱导物潜活/克植物最高，但随着随后的发芽逐渐减少。在不加入黑芥子酶时没有可检测的QR诱导物活性(低于1000单位/克)。
实施例4芽苗的诱导物潜活比市售植物高本发明的十字花科芽苗的相2酶诱导物潜活比市售植物要高。更具体的说，芽苗的相2酶诱导潜活比成熟蔬菜至少要高5倍。例如与田中栽培的花茎甘蓝Saga品种和DeCicco品种的菜花头的分别为25000和20000单位/克鲜重诱导潜活相比，测得的7天大的花茎甘蓝芽苗的总诱导潜活，如上所述用DMF/ACN/DMSO抽提并用黑芥子酶处理后，为238000和91000单位/克鲜重。
对于40多种不同种的十字花科芽苗的抽提物进行了生物测定，花茎甘蓝芽苗是测试中最富含相2酶诱导物的植物。表2中显示了市售的和芽苗阶段的花茎甘蓝和小萝卜的有机溶剂抽提物中的总诱导潜活。
表2芽苗和成熟蔬菜中的诱导潜活的比较
*对每种植物的商用部分(如小萝卜的直根以及花茎甘蓝的菜花头)取样。所有测试的抽提物中均加入黑芥子酶。
**花茎甘蓝芽苗为1天大，小萝卜幼苗为4-5天大。
花茎甘蓝Everest品种的芽苗含有比成熟蔬菜高130倍的诱导物潜活(单位/克鲜重)。花茎甘蓝中的诱导物活性比小萝卜中的要高的多。
实施例5花茎甘蓝芽苗抽提物的诱导物潜活下面对Saga品种的3天大的花茎甘蓝芽苗的一系列水抽提物进行诱导物潜活测定。植物用来自花茎甘蓝Saga品种的表面消毒过的种子来获得，表面消毒首先是在70％乙醇中处理1分钟，然后在含约0.001％Alconox洗涤剂的1.3％次氯酸钠中处理15分钟。使种子在无菌塑料容器中在不含附加营养物的0.7％琼脂基质上生长72小时，种子密度约为8个种子/cm2。用宽谱荧光照明、湿度和温度控制来严格控制环境(光照下16小时，25℃/暗处8小时，20℃)。
从琼脂表面迅速地轻轻地收集植物，以尽量减少芥子油苷被植物受伤害时释放的内源黑芥子酶水解。轻轻地采集芽苗(约25mg鲜重/株芽苗)并立即迅速投入3体积的沸水中以灭活内源黑芥子酶，并将芥子油苷和异硫氰酸酯从植物组织中抽提出。使水重新沸腾并维持滚动沸腾3分钟。然后将芽苗从煮沸的浸剂[茶、汤]中取出，或在其中磨匀浆，然后过滤或离心除去残余物。
表3中的数据代表匀浆物和浸剂的数据。制剂保藏在-20℃下直至测定。对如上所述制得的植物抽提物用上述定义部分所述的方法进行测定。
表33天大的Saga品种花茎甘蓝芽苗的热水抽提物的诱导物潜活
测得相2酶诱导物潜活的量有变化。然而，发现始终有高水平的相2酶诱导物潜活。
实施例6用小萝卜黑芥子酶处理过的花茎甘蓝热水抽提物花茎甘蓝热水抽提物中的QR活性在蔬菜来源的黑芥子酶存在时有所提高。将在水琼脂上生长3天的花茎甘蓝Saga品种的芽苗水性抽提物分成不同的6份150ml等份，其中抽提物在沸水中沸腾3分钟以灭活黑芥子酶。将9天大的小萝卜芽苗(一种富含黑芥子酶的来源)以相当于花茎甘蓝的0、5、9、17、29和40％(w/w)的量加入该冷却的浸剂中。如定义部分所述，测得不含小萝卜的对照抽提物的QR活性为26300单位/克鲜重，而接受小萝卜作为黑芥子酶来源的抽提物的QR活性在500000至833000单位/克鲜重花茎甘蓝。因此，小萝卜芽苗中的黑芥子酶可使花茎甘蓝抽提物中的QR活性提高超过19倍。
实施例7萝卜苷和葡糖芥酸精是花茎甘蓝(Saga品种)芽苗的热水抽提物中主要的芥子油苷离子对层析(PIC)。将离心过的3天大的花茎甘蓝(Saga品种)芽苗的热水抽提物上柱于反相C18 Partisil ODS-2 HPLC柱，在ACN/H2O(1/1，体积比)中进行分析和制备PIC，以四辛基溴化铵(TOA溴化物)作为反离子。只测得有三个良好分离的峰A、B、C峰分别在5.5、11.5、13分钟时洗脱出，A∶B∶C的大致摩尔比为2.5∶1.6∶1.0(用235nm下的紫外吸收检测)，且如果最初的抽提物首先用高度纯化的黑芥子酶处理，则这些峰将消失。A、B和C峰不含显著的诱导物活性，且环缩合(cyclocondensation)法测定黑芥子酶的水解产物的结果表明只有A和C峰生成显著量的异硫氰酸酯构成所有的诱导物活性。(参见Zhang等人，生物化学分析“Anal.Biochem.”205100-107(1992))。没有对峰B进行进一步表征。将峰A和C以TOA盐的形式从HPLC上洗脱下来，但要将其转变成铵盐以便进行质谱分析、核磁共振分析和生物测定。在真空离心中干燥的纯峰物质，重新溶解在20mM水性？NH4Cl中，并用氯仿抽提以除去过量的TOA溴化物。芥子油苷的铵盐留在水相中，然后蒸发水相。
芥子油苷的鉴定。用质谱分析和核磁共振技术来表征峰A和C的铵盐的特征(a)在硫甘油基质上进行阴离子快速原子轰击；结果是阴离子的值436(峰A)和420(峰C)amu，和(b)如图2所示的高分辨率的核磁共振谱，为结构提供了明确的鉴定。峰A是萝卜苷[4-甲基亚硫酰基丁基芥子油苷]，峰C是非常相关的葡糖芥酸精[4-甲基硫丁基芥子油苷]。这些鉴定和纯度也与诱导物潜活一致；与报道的0.2μM的1-异硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷(33333单位/μmol)和2.3μM的芥酸精(2900单位/μmol)的CD值相比，峰A和C在黑芥子酶水解后，其潜活分别为36100和4360单位/μmol。CD值是化合物倍增Hepa 1c1c7鼠肝癌细胞中的QR比活所需的浓度。由于没有其它芥子油苷的峰，且峰A和C的诱导物活性即为抽提物总的诱导物活性，因此很可能在该花茎甘蓝品种中没有其它显著量的诱导物，即没有吲哚或羟基链烯基芥子油苷。因此可知分离得到的化合物基本上是纯的。
实施例8诱导物潜活抽提的水性和有机溶剂技术的比较植物用来自花茎甘蓝Saga品种的表面消毒过的种子来获得，表面消毒是先用70％乙醇，然后再用含0.001％Alconox的1.3％次氯酸钠处理。使种子在无菌塑料容器中在不含附加营养物的0.7％琼脂基质上生长72小时，种子密度约为8个种子/cm2。用宽谱荧光照明、湿度和温度控制来严格控制环境(光照16小时，25℃/暗处8小时，20℃)。
从琼脂表面迅速地轻轻地摘下植物，以尽量减少芥子油苷被植物受伤害时释放出的内源黑芥子酶水解。如实施例1所述的，使部分植物在10体积的DMF/ACN/DMSO溶剂中在-50℃下匀浆，以使几乎所有的非木质素植物材料溶解。或者，将大多数采集的植物投入5体积的沸水中3分钟以灭活内源黑芥子酶并抽提出芥子油苷和异硫氰酸酯。将冷却的混合物打成匀浆、离心，并将上清液保藏在-20℃下。
用前述的微量滴定板生物测定法测定用前述两种方法制得的植物抽提物的诱导物潜活。典型的，5个制剂的平均诱导物潜活为702000(DMF/ACN/DMSO抽提物)和505000(水性抽提物)单位/克鲜重芽苗。
如Zhang等人(生物化学分析，“Anal.Biochem.”205100-107(1992))所述的，对异硫氰酸酯与1，2-苯二硫杂环戊二烯反应的环缩合产物进行分光光度定量。在加入黑芥子酶后芥子油苷迅速变为异硫氰酸酯。总的热水可抽提材料(溶解的固体)的约6％为芥子油苷。这些结果证明(a)原始植物抽提物中的异硫氰酸酯水平很低；(b)黑芥子酶可迅速地将富含的芥子油苷转变成异硫氰酸酯；(c)用三种溶剂混合物可将热水抽提物中超过70％的诱导活性抽提出，使得可回收制剂中大部分的人可安全服用的生物活性；和(d)整个植物中超过95％的诱导潜活是以芥子油苷形式存在，因此没有其它诱导物以显著的生物活性量存在。
实施例9芥子油苷生成的发育调节通过在同一土地上连续采集田中栽培的花茎甘蓝(DeCicco品种)的初步实验表明以鲜重计，从早期蔬菜到上市采集，诱导物潜活是降低的，但在最后的采集阶段(花开的开始)表现出提高。这些数据表明可能种子内的诱导物潜活最高。后续的研究表明，当8种花茎甘蓝品种的种子进行表面消毒并在定菌生物条件下生长时，种子内的相2酶诱导物潜活(以鲜重计)是最高的，并且在幼苗生长前14天内随时间逐渐降低。
然而，以每株植物计的活性在这个期间是保持恒定的，这表明在该早期生长阶段，没有芥子油苷的净合成。但是，在比较市售阶段的花茎甘蓝和3天大的芽苗(Emperor品种)的芥子油苷曲线时，这些植物的外观的芥子油苷组成有很大的不同。
植物用来自花茎甘蓝Emperor品种的表面消毒过的种子来获得，表面消毒是先用70％乙醇处理1分钟，然后再用含约0.001％Alconox洗涤剂的1.3％次氯酸钠处理15分钟。使种子在无菌塑料容器中在不含附加营养物的0.7％琼脂基质上生长72小时，种子密度约为8个种子/cm2。严格控制环境；控制宽谱荧光照明、湿度和温度(光照16小时，25℃/暗处8小时，20℃)。
从琼脂表面迅速地轻轻地收集植物，以尽量减少芥子油苷被植物受伤害时释放出的内源黑芥子酶水解。轻轻地采集芽苗(约25mg鲜重/株芽苗)并立即迅速投入约3体积的沸水中以灭活内源黑芥子酶并将芥子油苷和异硫氰酸酯从植物组织中抽提出。使水重新沸腾并维持滚动沸腾3分钟。然后将芽苗从煮沸的浸剂[茶、汤]中取出，并使浸剂保藏在-20℃下直至测定。
使暖房浇灌土壤中的同一批种子(seedlot)移植到Garrett County，MD的已上过有机肥的土地上，并在市售阶段采集，从而获得市售的菜花头。在采集后立即将叶球冷冻，放在冰上运至实验室，并用如上所述的相同方法制备芽苗抽提物，只是用约3克小花组织的样品来抽提。
用实施例1中所述的微量滴定板生物测定法测定如上所述制备的植物抽提物的诱导物潜活。离子对层析表明，在与葡糖蔓菁苷(吲哚-3-基甲基芥子油苷)和新葡糖蔓菁苷(neoglucobrassicin)(1-甲氧吲哚-3-基甲基芥子油苷)相同的滞留时间处，市售菜花头抽提物有两个主峰，可能是葡糖蔓菁苷和新葡糖蔓菁苷。该发现与公开的关于成熟花茎甘蓝植物的芥子油苷组合物的报道是一致的。然而，同样制得的3天大的芽苗抽提物在相同条件下的离子对层析却显示没有葡糖蔓菁苷和新葡糖蔓菁苷。而且，不同花茎甘蓝品种的3天大的芽苗可产生不同的芥子油苷混合物。因此，芥子油苷的产生是受发育调节的。
实施例10在哈金斯DMBA(9，10-二甲基-1，2-苯并蒽)乳房肿瘤病理模型中评价花茎甘蓝芽苗制剂防致癌的活性植物用来自花茎甘蓝Saga品种的表面消毒过的种子来获得，表面消毒是先在70％乙醇中处理1分钟，然后再在含约0.001％Alconox洗涤剂的1.3％次氯酸钠中处理15分钟。使种子在无菌塑料容器中在不含附加营养物的0.7％琼脂基质上生长72小时，种子密度约为8个种子/cm2。通过宽谱荧光照明、湿度和温度控制来严格控制环境(光照16小时，25℃/暗处8小时，20℃)。
从琼脂表面迅速地轻轻地收集植物，以尽量减少芥子油苷被植物受伤害时释放出的内源黑芥子酶水解。将采集的大量芽苗立即迅速投入约3体积的沸水中以灭活内源黑芥子酶并将芥子油苷和异硫氰酸酯从植物组织中抽提出。使水重新沸腾并维持滚动沸腾3分钟。然后将芽苗从煮沸的浸剂[茶、汤]中取出，并冻干浸剂，以干粉形式保藏在-20℃下(指定为制剂A)。其它芽苗同样用沸水抽提，冷却至25℃，并补充入一定量的7天大的小萝卜芽苗(相当于原先花茎甘蓝芽苗鲜重的约0.5％)。该混合物用Brinkrman Polytron匀浆器匀浆，并在37℃下培育2小时，然后使其过滤通过烧结玻璃过滤器，如上冻干并以干粉形式保藏在-20℃下(指定为制剂B)。
用上述微量滴定板生物测定法测定如上所述制得的植物抽提物的QR诱导物活性和诱导物潜活。制剂A的QR诱导活性主要是由于芥子油苷；主要为萝卜苷，它是1-异硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷的芥子油苷，但也含有一些萝卜苷的硫化类似物葡糖芥酸精。制剂B的QR诱导活性几乎全部是由于黑芥子酶对芥子油苷作用后产生的异硫氰酸酯。
将35天大的雌性Sprague-Dawley大鼠随机分组；每个塑料笼中有4只。在50天时，所有动物通过管饲法服用在1ml芝麻油内的10mgDMBA。在给DMBA前3、2、和1天、给DMBA的当天(在给DMBA试剂前2小时)以及在给DMBA以后用管饲法给以芽苗制剂(A或B)或载剂对照。所用的载剂是50％Emulphor620P/50％水。从给药时起使动物保持半纯化的AIN-76A饮食随意食水饲养(adlibitum)直至实验结束(167天龄)。
表4DMBA鼠乳房肿瘤病理模型中花茎甘蓝芽苗抽提物的抗致癌活性
通过芽苗抽提物的给药，可触摸到的肿瘤的发生延迟多达5周。用制剂A或B治疗过的鼠的肿瘤明显比未治疗的对照要少，且接受制剂A或B的动物的肿瘤数(肿瘤个数/鼠)明显降低。
实施例11人体内芥子油苷的新陈代谢和清除两个不吸烟的志愿者(35岁和40岁，均健康)采用少量蔬菜的饮食，其中不食用绿色或黄色的蔬菜，或调味品、芥菜、辣根、西红柿或番木瓜。在此饮食进行24小时后收集所有8小时的尿样。在24小时的基线数据后，使他们食用含有520μmol芥子油苷的100ml花茎甘蓝芽苗的汤(如前所述制备)。
芽苗用来自花茎甘蓝Saga品种的表面消毒过的种子来获得，表面消毒是先在70％乙醇中处理1分钟，然后再在含约0.001％Alconox洗涤剂的1.3％次氯酸钠中处理15分钟。使种子在无菌塑料容器中在不含附加营养物的0.7％琼脂基质上生长72小时，种子密度约为8个种子/cm2。通过宽谱荧光照明、湿度和温度控制来严格控制环境(光照16小时，25℃/暗处8小时，20℃)。从琼脂表面上迅速地轻轻地采集植物，以尽量减少芥子油苷被植物受伤害时释放出的内源黑芥子酶水解。将采集的大量芽苗立即迅速投入约3体积的沸水中以灭活内源黑芥子酶，并将芥子油苷和异硫氰酸酯从植物组织中抽提出。使水重新沸腾并维持滚动沸腾3分钟。在沸腾后，用Brinkman Polytron匀浆器直接使芽苗在浸剂中匀浆1分钟，并将制剂冷冻在-79℃下直至使用。
用上述微量滴定板生物测定法测定如上所述制得的植物抽提物的诱导物潜活。诱导物潜活几乎全部是由于芥子油苷；芥子油苷主要为萝卜苷，它是1-异硫氰基-4R-[甲基亚硫酰基]丁烷的芥子油苷，但也含有一些萝卜苷的硫化类似物葡糖芥酸精。当加入纯化过的黑芥子酶使芥子油苷转变成异硫氰酸酯后，用如实施例7中描述的环缩合反应测定，相2酶的诱导物潜活为100000单位/ml，且每毫升含有5.2μmol的异硫氰酸酯。因此，他们总共服用了520μmol的芥子油苷。
使8小时的尿样收集继续30小时。用实施例7所述的环缩合反应来检测尿液排泄的异硫氰酸酯共轭物(二硫氨基甲酸酯)。
表5服用从Saga品种花茎甘蓝抽提出的520μmol芥子油苷的两位受治疗者的二硫氨基甲酸酯的排泄
研究的两位受治疗者将服用的芥子油苷的大部分代谢转变成异硫氰酸酯，而异硫氰酸酯转变成关联的可在尿中测得的二硫氨基甲酸酯。
实施例12物理干扰对芽苗生长产生醌还原酶诱导物的影响芽苗用来自小萝卜(daikon)的表面消毒过的种子来获得，表面消毒是先用70％乙醇处理1分钟，然后再用含约0.001％Alconox洗涤剂的1.3％次氯酸钠处理15分钟。使种子在无菌塑料容器中在不含附加营养物的0.7％琼脂基质上生长7天，种子密度约为8个种子/cm2。通过宽谱荧光照明、湿度和温度控制来严格控制环境(光照16小时，25℃/暗处8小时，20℃)。
在第5和第6天用杀菌的UV光来辐射处理芽苗。处理后的芽苗只有未处理对照的一半高。在第7天从琼脂表面上迅速地轻轻地采集植物，以尽量减少芥子油苷被植物受伤害时释放出的内源黑芥子酶水解。将采集的芽苗立即迅速投入约10体积的DMF/ACN/DMSO(1∶1∶1，-50℃)中以灭活内源黑芥子酶，并将芥子油苷和异硫氰酸酯抽提出。立即用研磨玻璃研钵和研杵将芽苗磨成匀浆并保藏在-20℃下。
用上述微量滴定板生物测定法测定如上所述制得的植物抽提物的诱导物潜活。紫外处理过的芽苗的诱导物潜活是未处理对照的3倍。因此用紫外光来处理芽苗可提高植物组织的相2酶诱导物潜活。
尽管前述是涉及具体的较佳的实施例，但应理解本发明并不局限于此。对于该领域技术人员来说，公开的实施例可作各种改进，而这些改进是包括在由下列权利要求确定的本发明的范围内的。本说明书中提到的所有出版物和专利申请表明了本发明所属领域中的技术水平。
所有的出版物和专利申请均在此引作参照，就如每一单独的出版物或专利申请全文具体单独引作参考在此一样。
权利要求
1.除卷心菜、独行菜、白芥、黑芥和小萝卜的种子以外的十字花科种子或从所述种子制得的粉末，其中所述种子含有高的相2酶诱导潜活。
2.根据权利要求1所述的十字花科种子或从所述种子制得的粉末，其中所述种子产生的芽苗在生长3天后测得有至少200000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活。
3.根据权利要求1所述的十字花科种子或从所述种子制得的粉末，其中所述种子产生的芽苗在生长3天后测得有至少300000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活。
4.根据权利要求1所述的十字花科种子或从所述种子制得的粉末，其中所述种子产生的芽苗在生长3天后测得有至少400000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活。
5.根据权利要求1所述的十字花科种子或从所述种子制得的粉末，其中所述种子产生的芽苗在生长3天后测得有至少500000单位/克鲜重的相2酶诱导潜活。
6.上述任一权利要求所述的十字花科种子或除卷心菜、独行菜、白芥、黑芥和小萝卜的芽苗以外的在发芽开始起至包括2叶阶段间采集获得的十字花科芽苗的无毒溶剂抽提物。
7.一种食物制品，它包含权利要求1-5任一项所述的十字花科种子、权利要求1-5任一项所述的从种子制得的粉末、权利要求6所述的无毒溶剂抽提物、除卷心菜、独行菜、白芥、黑芥和小萝卜的芽苗以外的在发芽开始起至包括2叶阶段间采集获得的十字花科芽苗；或所述种子、从所述种子制得的所述粉末、所述无毒溶剂提取物或所述芽苗的组合物。
8.一种丸剂或片剂，它包含权利要求1-5任一项所述的十字花科种子、权利要求1-5任一项所述的从种子制得的粉末、权利要求6所述的无毒溶剂抽提物、除卷心菜、独行菜、白芥、黑芥和小萝卜的芽苗以外的在发芽开始起至包括2叶阶段间采集获得的十字花科芽苗；或所述种子、从所述种子制得的粉末、无毒溶剂提取物或芽苗的组合物。
9.一种制备富含芥子油苷的食物制品的方法，该食物制品包含权利要求1-5任一项所述的十字花科种子、权利要求1-5任一项所述的从种子制得的粉末、权利要求6所述的无毒溶剂抽提物、除卷心菜、独行菜、白芥、黑芥和小萝卜的芽苗以外的在发芽开始起至包括2叶阶段间采集获得的十字花科芽苗；或其组合，其中所述方法包括将所述种子、所述粉末、所述无毒溶剂抽提物或所述芽苗或其组合加入另一可食用的组分中，其中所述种子、所述粉末、所述无毒溶剂抽提物或所述芽苗富含芥子油苷。
10.一种从植物组织抽提芥子油苷和异硫氰酸酯的方法，该方法包括在足以灭活黑芥子酶活性的温度下，在过量的二甲基亚砜、乙腈和二甲基甲酰胺的混合物中匀浆所述植物组织。
11.根据权利要求10所述的方法，其中二甲基亚砜∶乙腈∶二甲基甲酰胺之比为1∶1∶1。
12.权利要求8所述的丸剂或片剂在减少哺乳动物中致癌物水平的方法中的用途，其中将所述丸剂或片剂给予哺乳动物。
13.权利要求8所述的丸剂或片剂在提高哺乳动物相2酶化学保护量的方法中的用途，其中将所述丸剂或片剂给予哺乳动物。
14.权利要求7所述的食物制品在减少哺乳动物中致癌物水平的方法中的用途，其中将所述食物制品给予哺乳动物。
15.权利要求7所述的食物制品在提高哺乳动物相2酶化学保护量的方法中的用途，其中将所述食物制品给予哺乳动物。
16.权利要求1-5任一项所述的十字花科种子、权利要求1-5任一项所述的从种子制得的粉末、权利要求6所述的无毒溶剂抽提物、除卷心菜、独行菜、白芥、黑芥和小萝卜的芽苗以外的在发芽开始起至包括2叶阶段间采集获得的十字花科芽苗或其组合物在制备食物制品中的用途，该食物制品在食用后可提高相2酶的化学保护量。
17.权利要求1-5任一项所述的十字花科种子、权利要求1-5任一项所述的从种子制得的粉末、权利要求6所述的无毒溶剂抽提物、除卷心菜、独行菜、白芥、黑芥和小萝卜的芽苗以外的在发芽开始起至包括2叶阶段间采集获得的十字花科芽苗或其组合物在制备食物制品中的用途，该食物制品在食用后可减少哺乳动物中致癌物的水平。
18.根据权利要求1所述的十字花科种子或粉末，其中所述种子还含有无毒性水平的吲哚芥子油苷及其分解产物和致甲状腺肿的羟基丁烯基芥子油苷。
全文摘要
本发明确定了癌症化学保护试剂的蔬菜来源，它极富含异硫氰酸酯的新陈代谢前体芥子油苷。蔬菜来源可用于通过饮食来减少哺乳动物中的致癌物的水平。
文档编号A23L1/172GK1502263SQ0213217
公开日2004年6月9日 申请日期1996年9月13日 优先权日1995年9月15日
发明者J·W·费伊, J W 费伊, P·塔拉雷 申请人:约翰斯·霍普金斯医学院, 约翰斯 霍普金斯医学院