专利名称：与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记的制作方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与白粉病抗性基因相连锁的分子标记及其获得方法。
尽管实践中可以采取化学药剂来防治小麦白粉病，但是，培育抗病品种是最为安全、经济、有效的措施。70年代初，我国引入具1B/1R的小麦衍生品种做为抗源，曾经一度有90％以上的品种携有Pm8抗白粉病基因，由于抗性基因的单一性，结果导致小麦白粉病在全国范围内多次大流行。此后，我国小麦育种家致力于多方引入和转育具有新抗病基因的品种，但由于有些抗病基因在不同遗传背景中表达不一致，致使真正用于生产实际的抗白粉病基因很少，在育种中应用的仅有Pm2、Pm4a、Pm4b、Pm6、Pm8及其组合Pm2+6、Pm2+4等，再加上小麦白粉病菌具有群体大，适应范围广，生理小种多且毒力变异快等特点，使得许多花费多年时间培育的抗病品种(系)刚应用不久，有的甚至还未应用，便由于病菌群体毒性的变化而丧失了抗性。“九五”期间，Pm4a、Pm6在全国各地均已开始丧失抗性。二十世纪末，北京地区推出了我国第一个自行转育成功并定名的Pm21基因有毒性的菌株。目前，我国小麦育种项目中较为广泛地利用了该基因，应引起警惕，防止抗源单一现象再次发生，有效地控制白粉病的流行。为此必须大力挖掘和利用新抗源并不断地进行抗病基因的累加，培育抗性持久的小麦品种。
为实现上述任务，挖掘新抗源，以往，育种家们大多借助形态学标记和生化标记来辅助育种，但这类标记具有工作量大、标记数量少、易受环境影响等缺点。随着分子生物学的发展，一类基于DNA变异的分子标记技术已经被国内外许多学者应用于小麦抗白粉病研究。应用分子标记，可以免除传统育种中繁重的工作程序，跟踪、检测外源基因，还可以把多个抗白粉病基因聚合到同一优良品种中，获得持久抗性。此外，将基因精确定位于高密度的分子图谱上，以紧密连锁的分子标记为起点，应用染色体步行(Chromosome Walking)等方法，逐渐逼近目标基因，最终克隆该基因。实践证明DNA分子标记是进行抗病性鉴定和辅助育种研究的重要工具。
小麦对白粉病的抗性主要由主效基因控制，早期基因符号为M1，正式命名的基因符号为Pm(powdery mildew)。自从1930年澳大利亚学者首次报道了澳大利亚春小麦品种Thew携带一个显性抗白粉病基因以来，至今已鉴定出30个Pm基因位点，除Pm29外，其余主效基因已被定位到染色体或染色体臂上。此外尚有抗病基因未被正式命名，临时以M1表示。自从90年代初开展小麦抗白粉病基因分子标记研究以来，已有接近一半的抗病基因找到了相应的分子标记。目前已经得到的分子标记有些由于白粉菌生理小种的变异而失效，抗性基因即失去作用。
采用RAPD和SSR分子标记进行筛选与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记的方法是(1)RAPD、SSR引物在抗、感亲本以及它们的杂交后代间DNA多态性分析用RAPD标记技术筛选，采用美国OPERON公司开发的10bp寡核苷酸作为随机引物，在PE-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为小麦基因组DNA(20ng/μl)1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，MgCl2(25mM)2.5μl，dNTP(10mM)0.5μl，引物(50μM)0.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μ1)0.25μl，ddH2O 17.75μl，总体系25μl。反应程序96℃变性1分钟，35℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，4个循环；94℃变性45秒，36℃退火1分钟，72℃延伸90秒，45个循环；72℃补齐10分钟；产物检测在含有0.5％μg/μl EB的1.4％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果；用SSR标记技术筛选，采用根据Rder在1998年发表的SSR引物序列合成的引物，在PE-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系20ng/μ1小麦基因组DNA2.5μl，10×PCR Buffer 2μl，25mM MgCl21.5μl，2mM dNTP2μl，20ng/μl引物2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 9.7μl，总体系20μl；反应程序94℃变性3分钟，94℃变性1分钟，50℃(或55℃，60℃)退火1分钟，72℃延伸2分钟，45个循环，72℃补齐10分钟；产物检测8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝39∶1)电泳，电极缓冲液为1×TBE，恒定电压90-140伏。凝胶染色采用硝酸银染色；实验结果记录照相和岛津CS-930薄层层析扫描仪记录实验结果；(2)分子标记的连锁性鉴定小麦杂交后代白粉病抗性鉴定在田间进行，白粉菌接种在孕穗期的小麦苗，将带菌感病对照株移栽至田间待鉴定的材料旁，通过自然传播接种，2-3周后调查抗病性，调查级别分为免疫、感病两级；分别提取抗病、感病单株的总体DNA，用与前面同样的反应体系、引物及程序进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapmakerEXP3.0b计算标记与抗白粉病基因之间的遗传距离。有益效果白粉病是影响小麦生产的一种严重病害。本发明是利用分子标记方法得到两个新的与白粉病抗性基因紧密连锁的分子标记。利用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点、有目标地将抗病基因在实验室内选择得到、并有目的地聚合多个抗白粉病基因、培育出具有稳定抗性的小麦新品种，同时也可利用这两个新白粉病抗性基因的分子标记克隆抗白粉病基因、并对其进行结构和功能分析，这对于进一步了解小麦抗白粉病的分子遗传学机理有积极意义。因此，本研究结果在小麦育种实践及抗病理论研究上都很有价值。其优点具体归纳如下(1)本发明的与白粉病抗性基因紧密连锁的分子标记，是在对华北地区白粉病菌免疫的小麦品种Brock及其抗性稳定的杂交后代单株中获得的新的标记，对15号生理小种均有抗性，而且稳定存在，可以用于小麦白粉病品种鉴定和小麦抗病后代的辅助选择育种。
(2)本研究所用材料为对15号生理小种(混合型生理小种，为华北地区流行的多种白粉病病菌)免疫的小麦品种，对华北地区白粉病菌具有比较广普的抗性。因此，根据所得分子标记有望克隆到新的白粉病抗性基因。
(3)为克隆小麦抗白粉病基因、基因序列分析以及转抗白粉病基因小麦研究奠定了良好基础。
具体做法是抗病基因供体亲本来自英国普通小麦品种Brock，其与感病普通小麦亲本015和感病亲本京411进行杂交，杂交组合为“Brock/015//京411”，抗病单株是通过杂交、回交和自交，从抗白粉病稳定的高世代株系中得到92株BC2F5；一、提取DNA取小麦叶片0.2g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提取缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；50mM NaCl)，65℃温浴15分钟，其间颠倒混匀2-3次，0℃冰浴10分钟。3000转/分钟离心10分钟，取上清液，加入等体积Tris-HCl(pH8.0)饱和酚，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入等体积酚、氯仿和异戊醇(25∶24∶1)抽提，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入等体积氯仿，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入两倍体积的冷乙醇，-20℃沉淀2个小时，12000转/分钟离心20分钟，倾去上清液，70％乙醇洗涤沉淀两次，自然凉干后溶于100μl TE中。加入1μl RNase(10mg/ml)，37℃保温1小时，以除去样品中的RNA，加入等体积的酚、氯仿抽提一次，3000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用等体积的氯仿抽提一次，加入两倍体积的冷乙醇，-20℃沉淀2小时以上，12000转/分钟离心20分钟，70％乙醇洗涤沉淀两次，风干后，溶于50μl TE中。紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。二、随机扩增多态性DNA(RAPD)分析RAPD引物一部分购自美国OPERON公司开发的10bp寡核苷酸作为随机引物(OPP01-OPP20，10mer共20个)，一部分购自上海生工生物工程公司(10mer共75个)。1、PCR扩增(1)反应体系为小麦基因组20ng/μlDNA 1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mM dNTP 0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，总体系25μl。混匀，瞬间离心收集，美国PE公司PE9700进行反应。(2)反应程序96℃变性1分钟，35℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，4个循环；94℃变性45秒，36℃退火1分钟，72℃延伸90秒，45个循环；72℃补齐10分钟。2、电泳检测取扩增产物8μl，1.4％的琼脂糖凝胶(含有0.5％μg/μl EB)电泳，紫外灯下观察并照相。
我们利用95个随机引物对京411和杂交后代抗病单株进行了RAPD分析，发现其中有85个引物能扩增出清晰的谱带，扩增片段大小分布在0.2kb-3.5kb之间，每个引物的扩增带数为1-10条，平均为5条，大约对基因组的420个座位进行了分析。结果只有引物OPP15的扩增产物在京411和抗病单株中表现多态性。
图1是引物OPP15的扩增结果，在抗病单株中能观察到一条分子量约为900bp的特异带OPP15900，重复实验三次，此带仍能稳定出现。继续采用OPP15扩增杂交亲本Brock和015发现，抗病亲本Brock中能扩增出特异带OPP15900，如图1所示3(抗病亲本Brock)和4(杂交后代抗病单株)中均能扩增出特异带OPP15900，而1(感病亲本京411)和2(感病亲本015)中缺乏OPP15900。说明这条特异带可能与小麦抗白粉病特性存在联系。三、RAPD分子标记OPP15900的连锁性鉴定
小麦杂交后代白粉病抗性鉴定在田间进行，白粉菌接种在孕穗期的小麦苗，将带菌感病对照株移栽至田间待鉴定的材料旁，通过自然传播接种，2-3周后调查抗病性，调查级别分为免疫、感病两级。分别提取抗病、感病单株的总体DNA，用上述同样的反应体系及程序，用引物OPP15进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapmakerEXP3.0b计算标记与抗白粉病基因之间的遗传距离。以OPP15对杂交后代群体92个单株进行PCR扩增。结果显示，80个抗病单株中有72株存在特异带，8株没有特异带；12个感病单株中5株有特异带，7株没有特异带。这一实验结果表明特异DNA片段OPP15900与小麦的抗病性是紧密连锁的，但在抗病和感病单株中都有一定的交换。如图2所示R是有OPP15900特异带的杂交后代抗病单株；R*是没有OPP15900特异带，但表型为抗病的杂交后代单株，表明发生了交换；S是没有OPP15900特异带的杂交后代感病单株；S*是有OPP15900特异带，但表型为敏感的杂交后代单株，表明发生了交换。经计算，其重组率为14.13％，OPP15900与抗病基因间的遗传距离为16.6cM。
实施例2用SSR分子标记方法，得到与小麦抗白粉病基因相连锁的新分子标记Xgwm114120。
植物材料同实施例1，具体做法如下一、提取DNA各取小麦叶片0.2g，在液氮中研磨成粉末，迅速加入DNA提取缓冲液(50mMTris-HCl，pH8.0；20mM EDTA，pH8.0；50mM NaCl，65℃温浴15分钟，其间颠倒混匀2-3次，0℃冰浴10分钟。3000转/分钟离心10分钟，取上清液，加入等体积Tris-HCl(pH8.0)饱和酚，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入等体积酚、氯仿和异戊醇(25∶24∶1)抽提，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入等体积氯仿，颠倒混匀，3000转/分钟离心10分钟。取上清液，加入两倍体积的冷乙醇，-20℃沉淀2个小时，12000转/分钟离心20分钟，倾去上清液，70％乙醇洗涤沉淀两次，自然凉干后溶于100μl TE中。加入1μl RNase(10mg/ml)，37℃保温1小时，以除去样品中的RNA，加入等体积的酚、氯仿抽提一次，3000转/分钟离心10分钟，取上清液，再用等体积的氯仿抽提一次，加入两倍体积的冷乙醇，-20℃沉淀2小时以上，12000转/分钟离心20分钟，70％乙醇洗涤沉淀两次，风干后，溶于50μl TE中。紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。二、SSR引物的合成根据Rder在1998年发表的SSR引物序列合成实验所需引物(由上海生物工程公司合成)。三、微卫星引物(SSR)分析1、PCR扩增(1)反应体系20ng/μl小麦基因组DNA 2.5μl，10×PCR Buffer 2μl，25mMMgCl21.5μl，2mM dNTP2μl，20ng/μl引物2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 9.7μl，总体系20μl。混匀，瞬间离心收集，美国PE-9700上进行反应。(2)反应程序94℃变性3分钟，94℃变性1分钟，50℃(或55℃，60℃)退火1分钟，72℃延伸2分钟，45个循环，72℃补齐10分钟。2、电泳检测(1)凝胶电泳取扩增产物5μl，8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝39∶1)电泳，电极缓冲液为1×TBE，恒定电压90-140伏。(2)凝胶染色10％醋酸固定，去离子水漂洗3次，0.1％硝酸银250ml(加入40％甲醛375μl)染色，去离子水漂洗10秒，立即放入预冷的显影液(7.5g无水碳酸钠溶于250ml去离子水+40％甲醛375μl+10mg/ml硫代硫酸钠50μl)，不断摇动至DNA条带清晰，10％醋酸终止反应。3、实验结果记录照相和岛津CS-930薄层层析扫描仪记录实验结果。
利用20个微卫星引物对京411和杂交后代抗、感病单株进行了SSR分析，发现其中有17个引物能扩增出清晰的谱带，扩增片段大小分布在110bp-300bp之间，每个引物的扩增带数为1-5条，平均4条，大约对基因组的65个座位进行了分析。结果只有引物Xgwm114的扩增产物在京411和抗病单株中表现多态性。图3是引物Xgwm114的扩增结果，在3(抗病亲本)、4(抗病杂交后代单株)中能观察到一条分子量约为120bp的特异带Xgwm114120，重复实验三次，此带仍能稳定出现，而在1(感病亲本京411)和2(感病亲本015)中却没有此带。说明该特异带可能与小麦抗白粉病特性存在某种联系。
Xgwm114引物序列为左翼5’-ACA AAC AGA AAA TCA AAA CCC G-3’，右翼5’-ATC CAT CGC CAT TGG AGT G-3’，定位于小麦3B和3D染色体上，复性温度为60℃。四、SSR分子标记Xgwm114120的连锁性鉴定采用引物Xgwm114进行单株的PCR扩增，其方法同实施例1的连锁性鉴定。
为了检测Xgwm114120的稳定性及其与抗病基因的连锁关系，以引物Xgwm114对杂交后代92个单株进行扩增，如图4所示。结果80个抗病单株中有63株(R)存在特异带，17株没有特异带(R*)；12个感病单株中3株(S*)有特异带，9株没有特异带(S)。经计算，其重组率为21.74％，Xgwm114120与抗病基因间的遗传距离为28.5cM。
权利要求
1.与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记，其特征在于所述的分子标记OPP15900和Xgwm114120，其是用下述方法得到的(1)抗病基因供体亲本来自英国普通小麦品种Brock，其与感病普通小麦亲本015和感病亲本京411进行杂交，杂交组合为“Brock/015//京411”，抗病单株是通过杂交、回交和自交，从抗白粉病稳定的高世代株系中得到；(2)用苯酚-氯仿方法提取小麦亲本幼苗及杂交后代幼苗DNA；(3)采用RAPD和SSR两种分子标记方法进行小麦白粉病抗性分子标记的筛选；(4)筛选出一个RAPD分子标记OPP15900和一个SSR标记Xgwm114120，经过连锁性鉴定，发现该两个标记与小麦抗白粉病基因相连锁。
2.按照权利要求1所述的与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记，其特征在于采用RAPD和SSR分子标记进行筛选与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记的方法是(1)RAPD、SSR引物在抗、感亲本以及它们的杂交后代间DNA多态性分析用RAPD标记技术筛选，采用美国OPERON公司开发的10bp寡核苷酸作为随机引物，在PE-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20ng/μl小麦基因组DNA1μl，10×PCR Buffer 2.5μl，25mM MgCl22.5μl，10mMdNTP0.5μl，50μM引物0.5μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.25μl，ddH2O 17.75μl，总体系25μl。反应程序96℃变性1分钟，35℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，4个循环；94℃变性45秒，36℃退火1分钟，72℃延伸90秒，45个循环；72℃补齐10分钟；产物检测在含有0.5％μg/μl EB的1.4％的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果；用SSR标记技术筛选，采用根据Rder在1998年发表的SSR引物序列合成的引物，在PE-9700PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系20ng/μl小麦基因组DNA2.5μl，10×PCR Buffer 2μl，25mM MgCl21.5μl，2mM dNTP2μl，20ng/μl引物2μl，5U/μl Taq DNA聚合酶0.3μl，ddH2O 9.7μl，总体系20μl；反应程序94℃变性3分钟，94℃变性1分钟，50℃(或55℃，60℃)退火1分钟，72℃延伸2分钟，45个循环，72℃补齐10分钟；产物检测8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis＝39∶1)电泳，电极缓冲液为1×TBE，恒定电压90-140伏。凝胶染色采用硝酸银染色；实验结果记录照相和岛津CS-930薄层层析扫描仪记录实验结果；(2)分子标记的连锁性鉴定小麦杂交后代白粉病抗性鉴定在田间进行，白粉菌接种在孕穗期的小麦苗，将带菌感病对照株移栽至田间待鉴定的材料旁，通过自然传播接种，2-3周后调查抗病性，调查级别分为免疫、感病两级；分别提取抗病、感病单株的总体DNA，用与前面同样的反应体系、引物及程序进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapmakerEXP3.0b计算标记与抗白粉病基因之间的遗传距离。
全文摘要
与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记属于农业生物技术工程，特别涉及与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记及其获得方法。本发明克服常规标记方法工作量大、易受环境影响、育种周期长等缺点。采用RAPD和SSR两种分子标记方法对抗、感小麦亲本及抗病杂交后代“Brock/015∥京411”进行抗性标记的筛选。其中RAPD标记用美国OPERON公司开发的10bp寡核苷酸为随机引物；SSR标记用Rder在1998年发表的SSR引物序列合成的引物，筛选后得到与小麦抗白粉病基因相连锁的分子标记OPP1文档编号C12Q1/68GK1428440SQ0213131
公开日2003年7月9日 申请日期2002年9月27日 优先权日2002年9月27日
发明者王振英, 陈宏 , 彭永康 申请人:天津师范大学