专利名称：一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于油菜育种和分子生物学领域，更具体地涉及一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记的制备方法，同时还涉及一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用。
背景技术：
目前，杂交油菜的推广面积已占油菜生产总面积的60%以上。细胞质雄性不育是生产油菜杂交种的主要授粉控制系统。我国生产上使用的杂油菜有70%左右为细胞质雄性不育杂种，基本上是华中农业大学1972年从引进品种“波里马”中发现的波里马细胞质雄性不育(Pol CMS)配制的。Pol CMS的育性易受温度影响，低温下产生微量花粉，不育株可以自我繁殖，导致配制杂交种时一定比例的不育株存在，使杂种纯度下降，其中的不育株结实率低，影响杂交种产量潜力的发挥，增加杂交油菜利用的风险性。我国目前研究和应用的其他雄性不育细胞质有陕2A CMS、MI CMS、Nca CMS等，这些不育细胞质均是在芸薹属栽培种中经自然变异或种间杂交鉴定出来的，属于同源雄性不育胞质，均有育性不够稳定的缺点，应用时存在杂种纯度难以保证的问题，且其完全保持系和完全恢复系都不容易筛选， 大多数油菜品种都是不恢不保的类型(李殿荣.甘蓝型油菜三系选育初报.陕西农业科学，1980，(1) :26-29;傅寿仲，戚存扣，唐继红.甘蓝型油菜细胞质雄性不育系MI CMS的选育·作物学报，1989，17 (2) 151-156.刘贵华，蔡明，盛晓燕.甘蓝型油菜NCa雄性不育材料的选育及其在甘蓝型油菜中的恢保关系.中国农业科学，1997，30 (3) :61-65)。国外通过转移萝卜不育细胞质得到的育性较为稳定的萝卜质雄性不育材料(Barmerot H,Boulidard L，Cauderon Y andTempe J. Transfer of cytoplasmic male sterility from Raphanus sativus to Brassicaoleracea. Proc. Eucarpia Meeting Cruciferae :1974,52-54)， {i. 在利用过程中出现恢复系难找、恢复基因与不良品质性状连锁的问题，使得该不育系的 禾中禾Ufflii禾呈■个曼(Delourme R. ， Foisset N. ， Horvais R. ， Barret P. ， Champagne G.， Cheung W. Y. , Landry B. S. , Renard Μ.Characterisation of the radish introgression carrying the Rforestorer gene for the Ogu-INRA cytoplasmic male sterility in rapeseed (Brassicanapus L.). 1998, Theor Appl Genet 97:129-134)。从 1974 年不育系创建成功，到1999年打破恢复基因与不良品质性状的连锁，直至2000年以后才不断育成双低杂交油菜品种，实际应用进程花了将近30年的时间(Primard-Brisset C, Poupard JP, Horvais R, Eber F, Pelletier G, Renard M, Delourme R, A new recombined double lowrestorer line for the Ogu-INRA cms in rapeseed(Brassica napus L.). Theor ApplGenet. 2005 ；111 (4) :736_46)。生产上大面积应用单一细胞质生产杂交油菜存在流行性病害发生的危险，利用新的细胞质雄性不育系统对保障杂交油菜的可持续性发展具有重要意义。中国通过甘蓝型油菜与新疆野芥的体细胞杂交，创建了油菜异源细胞质雄性不育系统-野芥细胞质雄性不育系统(Nsa CMS)，与同源细胞质雄性不育系统相比，其
4不育性更为稳定(胡琼，李云昌，梅德圣，方小平，Lise N. Hansen, SvenB. Andersen属间体细胞杂交创建甘蓝型油菜细胞质雄性不育及其鉴定。中国农业科学，2004，37 (3) 333-338)。通过广泛与同一体细胞杂交组合的杂交后代株系测交，获得了该不育系统的恢复系，实现了三系配套(胡琼、李云昌、梅德圣、李英德、徐育松，利用野芥不育细胞质制备油菜及十字花科蔬菜杂种的方法，ZL200710052080. 5，2010年授权)。进一步研究表明， 该不育系统的恢复系是一个二体附加系，除了含有甘蓝型油菜的38条染色体之外，还含有野芥的2条染色体，且恢复基因位于附加染色体上(Wenhui Wei，Yunchang Li, Lijun Wang, Shengyi Liu, Xiaohong Yan, Desheng Mei, Yinde Li, Yusong Xu, Pengfei Peng, Qiong Hu. Development of a novel Sinapis arvensis disomic addition line in Brassicanapus containing the restorer gene for Nsa CMS and improved resistance toSclerotinia sclerotiorum and pod shattering. TAG,2009, Theor Appl Genet TAG, 2010，120(6) :1089-97)。这使得本来就是非常麻烦的恢复系的选育更加麻烦，因为选育雄性不育系的恢复系时，一个筛选出的单株或者株系是否具有恢复性能，往往需要与不育系进行测交，直到测交下一代的开花期才能进行鉴定。而当恢复系是附加系，恢复基因又位于附加染色体上时，通过杂交很容易使附加染色体丢失，因此恢复基因也易丢失，选择和培育出新的恢复系难度加大。利用恢复基因的分子标记进行辅助筛选，将显著提高恢复系的选育效率。目前国内外尚没有开发鉴定出Nsa CMS恢复基因分子标记的报道。在此背景下， 我们根据恢复基因编码的蛋白大多具有三角状五肽重复区(Pentatricop印tide repeat, PPR)的序列特征，开发出一种Nsa CMS恢复基因的分子标记，可用于恢复系的分子标记辅助选育。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记的制备方法，方法易行，操作性强，其特点是特异性强，扩增重复性好，可以确定植株或品系中是否有恢复基因的存在，从而在早期鉴定油菜植株或品系对Nsa CMS的恢复性能。本发明的另一个目的是在于提供了一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用。通过分子标记辅助选择，鉴定和筛选恢复材料速度快，极大减轻了恢复性能鉴定必需经过测交及后代种植观察的工作量，有效提高了选择的效率和准确性。从而大大提高了油菜异源细胞质雄性不育系恢复系选育的速度与鉴定效率，加快了杂交种选育的进程。根据本发明提供的方法并使用本发明提供的实验步骤可实现上述目的。一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记的制备方法，其步骤是A、从美国国家生物技术信息中心(National Center for BiotechnologyInformation, NCBI)数据库中(http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)选取拟南芥PPR基因AT1G126209、AT1G63070、萝卜细胞质雄性不育(Ogu CMS)的恢复基因RfO， 提取各自蛋白序列，送至欧洲生物信息学研究所网站(http://www. ebi. ac. uk/Tools/msa/ clustalw2/)分析工具软件(ebi clustalff)进行多序列比对，采取保守氨基酸位点兼顾简并度最小原则设计兼并引物。引物序列为；其正向引物为TTY GTN AAG GAR GGN AAG CT, 反向引物为 DAT RAGNGT RTT RTA NGT AAC。
5
B、用 CTAB 法(Doyle J. DNA protocols for plants-CTAB total DNA isolation. In :Hewitt G M, Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy. Berlin Springer-Verlag，1991. P283-293)抽取油菜异源细胞质雄性不育恢复系的叶片DNA，采用降落PCR程序进行扩增，PCR扩增体系为TaqMIX 10 μ 1 (购自GeneStar, DNA模板1 μ 1， 正反向引物各 2. 5μ l(10ym/l)，ddH20 4μ1。降落(touchdown) PCR 程序为95 °C 2min, (94 °C 30s, 55 °C -40 °C 45s, 72 °C 2min)，14 个循环，然后(95 °C 30s, 40 °C 45s, 72 °C 2min)，25个循环。PCR扩增产物用2% (g/v，以下相同)琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后检测。 C、PCR产物回收、转化及测序使用 Ε. Z. N. A GEL extraction kit 试剂盒(Omega, D2501-01)回收目标片断，用PGEM-T vecter试剂盒(购自Promega，A3600)连接后于16°C 过夜，转化大肠杆菌DH5(购自宝生物工程有限公司)感受态细胞，通过篮白斑筛选获得阳性克隆。挑选3-5个阳性克隆繁殖后，菌液送至上海INVITR0GEN公司测序。D、特异片段DNA序列分析将从恢复系DNA中扩增得到的差异片段测序，获得长度为309bp的序列。将特异片段的DNA序列送至美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库中(http //www, ncbi. nlm. nih. gov/)进行基因序列检索，结果获得了三个高度同源的基因序列，其中同源性最高的是一个具有油菜波里马CMS(pol CMS)育性恢复性状的一个白菜型油菜的克隆，在该区段上的一致性达85%，是一个1953bp的表达基因序列，编码含有十六个PI3R基序的蛋白。与美国国家生物技术信息中心数据库(http://www, ncbi. nlm. nih. rov/)中的拟南芥一号染色体臂上的PI3R基因AT1G12300 —致性达79%，与多个拟南芥的PI3R基因同源性都超过了 70%以上。 与萝卜CMS的恢复基因族上恢复基因位点RfO (PPR B)的同源性达69%。E、特异片段可能编码的氨基酸序列及蛋白基序分析使用欧洲生物信息学研究所网站(http://www. ebi.ac.uk/Tools/emboss/)翻译序列分析工具软件(EBItranseq)将此长度为309bp的片段翻译成蛋白质序列，结果表明该片段编码103个氨基酸残基。将这 103个氨基酸序列提交至Smart进行结构域预测，发现其含有两个PI3R蛋白基序，各基序为35个氨基酸，属于PI3R基因家族的P亚族。其中第一个Pra基序位于27-61个氨基酸区域，紧接着第二个位于62-96个氨基酸区域，两个Pra基序的预测值分别为4. OOe-IO和 6. 60e-12。将这103个氨基酸序列提交NCBI进行BLAST同源性搜索，获得的同源序列除了拟南芥的PI3R基因之外，全部是与植物CMS恢复基因相关的序列，包括萝卜及甘蓝型油菜萝
卜细胞质雄性不育(cytoplasmic male sterility，CMS)、甘蓝型油菜波里马细胞质雄性不育(pol CMS)、水稻CMS和矮牵牛CMS的恢复基因，说明包含这一序列的基因很可能与异源细胞质雄性不育的恢复基因相关。F、含特异片段的全长cDNA的获得根据差异DNA片段设计引物，使用SMARTRACE CDNA AMP I CAT I ON KIT (购自 CL0NTECH)，分别进行 5，RACE 与 3，RACE (图 1)。设计的 RACE 引物序列如下3，RACE 基因特异性引物5，GGCTAAGCAGATGATGGACCTGATGGCTAGCAAGGG3，， 5，RACE 基因特异性引物5，ATGTCCACGAGAGGGGTGGTTGCCAATACA3，。将扩增得到的 RACE 片段分别回收测序，测序结果经 SEQMAN 软件(http //www, dnastar. com/t-sub-products-la sergene-seqmanpro. aspx)拼接，获得全长 cDNA ·歹Ij ；G、根据拼接好的全长cDNA序列在其5，端非翻译区域(untranslatedregion，
6UTR)与3’ UTR区设计引物，使用该基因特异引物分别对与新分离群体的可育株与不育株进行PCR扩增，并对异源细胞质雄性不育的恢复系、保持系、不育系、以及同源细胞质雄性不育的恢复系的基因组DNA进行扩增。PCR扩增体系及程序为TaqMIX IOyL(购自 GeneStar, Al 12-20)，DNA 模板 1 μ L，正反向引物各 1.5 μ L(IOyM), ddH20 6μ L0 PCR 扩增程序为 95°C 5m, 94°C 30s，64°C 45s，72°C 3min)，共 34 个循环，然后 75°C IOmin, PCR 扩增产物用1.5% (g/v)琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后检测。结果在异源细胞质雄性不育的恢复系中有2. Ikb的扩增产物，而在其它材料中均无扩增产物；因此上述根据全长 cDNA序列5’ UTR与3’ UTR区设计的特异引物在具有异源细胞质雄性不育恢复性状的材料中扩增出来的2. Ikb的特异DNA片段可作为油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因的分子标记。从而获得了一种油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，其正向引物的序列为 TACGCGGGGAGAGAAGCTTGTCTCG,反向引物的序列为CACATCATAACACACTAACCAGGACTTTGTCTC， 扩增产物长度为2. Ikb。2、一种异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用，其步骤是A、提取油菜育种群体中不同高世代品系的叶片总DNA作为模板；B、采用上述油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的特异引物对待检测的不同品系的DNA进行PCR扩增；C、扩增产物在(g/v)的琼脂糖胶上进行电泳分离，查看分子量约为2. Ikb的特异片段条带出现情况；D、当该约2. Ikb的特异性片段条带出现时，表明油菜品系基因组中含有野芥细胞质雄性不育恢复基因；当该约2. Ikb的特异性条带缺失时，表明油菜品系基因组中不含有野芥细胞质雄性不育恢复基因，可用于野芥细胞质雄性不育恢复系的早期辅助选择。本发明通过恢复基因的同源性设计引物，获得异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，并利用分子标记辅助选择恢复系，其特点是特异性强，扩增重复性好，方法易行，操作性强，可以确定植株或品系中是否有恢复基因的存在，从而可以在早期鉴定油菜植株或品系对细胞质雄性不育的恢复性能。通过分子标记辅助选择，极大减轻了恢复性能鉴定必需经过测交及后代种植观察的工作量，有效解决了常规育种方法中存在的恢复基因测交鉴定工作量大、周期长等缺点，可以大大提高Nsa CMS恢复系选育的速度与鉴定效率，有效提高了选择的效率和准确性，有助于加快Nsa恢复系的遗传改良步伐。
图1为一种简并引物特异性片断的扩增效果示意图。 1育性分离群体中的可育株，2育性分离群体中的不育株，3野芥，4甘蓝型油菜亲本中双4号，5不育系。箭头所指为扩增目的片断。图2为一种特异DNA扩增片断序列经SMART预测的PI3R基序图3为一种3’ race与5’ race的扩增情况。图4为一种Nsa CMS恢复基因特异分子标记在育性分离群体可育株中特异扩增示意图。F为育性分离群体中的可育株cDNA，S为育性分离群体中的不育株cDNA。
图5为一种Nsa CMS恢复基因特异分子标记在Nsa恢复系及野芥中的特异扩增示意图。F为Nsa恢复系，S为Nsa不育系，M为Nsa保持系，Y为野芥。图6为一种Nsa CMS恢复基因分子标记在Nsa恢复系中的特异扩增示意图。泳道 1-3为三个不同的Nsa恢复系，泳道4-8为其他类型CMS恢复系。图7为一种Nsa CMS恢复基因分子标记在F2育性分离群体中的检测效果示意图。图左边1-8泳道为不育单株的DNA，右边第9_18泳道为可育单株的DNA。图8为一种Nsa CMS恢复基因分子标记在高世代株系中的检测效果示意图。图9为一种Nsa CMS恢复基因分子标记在高世代纯合株系不同单株中的检测效果示意图。图10为一种Nsa CMS恢复基因分子标记在高世代杂合株系不同单株中的检测效果示意图。图11为利用一种Nsa CMS恢复基因分子标记辅助选择选育出的新恢复系田间长势示意图。
具体实施例方式实施实例1 一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法，具体步骤为1、油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因相关片段的获得A、实验材料及群体构建野芥细胞质雄性不育(Nsa CMS)的不育系(均为与甘蓝型油菜的自交或回交后代，细胞核中不含野芥染色体)、中双4号(为Nsa CMS的保持系，也是体细胞杂交所用的原始甘蓝型油菜亲本)、野油18 (为体细胞杂交所用的原始野芥亲本) 及Nsa CMS的不育系与1号恢复系(恢1)杂交获得的可育Fl代单株，再与保持系杂交后， 从复交Fl中选可育株与保持系连续回交4代后获得的育性分离群体中的可育株与不育株。B、简并引物设计基于多数植物细胞质雄性不育的育性恢复基因编码PPR蛋白及其进化特点，选用美国国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information, NCBI)数据库中(http //www, ncbi. nlm. nih. rov/)的拟南芥的 PI3R 基因 AT1G126209、AT1G63070，萝卜细胞质雄性不育(Ogu CMS)的恢复基因(RfO)，从I数据库中获取各自蛋白序列，送至欧洲生物信息学研究所网站(http://www, ebi. ac. uk/Tools/msa/ clustalw2/)分析工具软件(ebi clustalff)进行多序列比对，比对后发现，该三个基因在约200bp长的区段上的同源性较高，选取保守氨基酸位点兼顾简并度最小原则设计兼并引物，共获得3条正向引物和3条反向引物，简并度变幅为64-768 (表1)。引物序列交由上海生工合成。表1简并引物序列及简并度
权利要求
1. 一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法，其步骤是A、选取拟南芥1号染色体臂PI3R基因AT1G126209，AT1G63070,萝卜细胞质雄性不育的恢复基因RfO，从美国国家生物技术信息中心数据库中提取各基因的蛋白质序列，进行多序列比对，在保守氨基酸位点处兼顾简并度最小原则设计间并引物，正向引物序列为TTY GTN AAG GAR GGN AAG CT，反向引物序列为 DAT RAG NGT RTT RTA NGT AAC ；B、用CTAB法抽取油菜异源细胞质雄性不育恢复系的叶片DNA，采用降落PCR程序进行扩增，PCR扩增体系为=TaqMIX 10μ1, DNA模板 μ ,正反向引物各2. 5μ1, ddH20 4μ1，降落 PCR 程序为95°C 2 min，14 个循环，然后 95°C 30 s, 40°C 45 s, 72°C 2 min，25 个循环， PCR扩增产物用2% g/v琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后检测；C、PCR产物回收、转化及测序使用E.Z.N. A GEL extraction kit试剂盒回收目标片断，用PGEM-T vecter试剂盒连接后于16°C过夜，转化大肠杆菌DH5感受态细胞，通过篮白斑筛选获得阳性克隆，挑选3-5个阳性克隆繁殖后，菌液送样测序；D、特异片段DNA序列分析将从恢复系DNA中扩增得到的特异片段测序，获得长度为 309 bp的序列，将特异片段的DNA序列送至NCBI基因序列库进行BLAST检索，获得了三个高度同源的基因序列，其中一个是从具有油菜波里马CMS育性恢复性状的一个白菜型油菜材料中得到的克隆，在该区段上的一致性达85%，是一个1953bp的表达基因序列，编码含有 16个PI3R基序的蛋白，与拟南芥1号染色体臂上的PI3R基因AT1G12300的同源性在70%以上；E、特异片段可能编码的氨基酸序列及蛋白基序分析使用EBItranseq将此长度为 309 bp的片段翻译成蛋白质序列，结果表明该片段编码103个氨基酸残基，将这103个氨基酸序列提交至Smart进行结构域预测，发现其含有两个PI3R蛋白基序，各基序为35个氨基酸，属于PI3R基因家族的P亚族，其中第一个PI3R基序位于27-61个氨基酸区域，接着第二个位于62-96个氨基酸区域，两个PPR基序的预测值分别为4. OOe-IO和6. 60e_12，将这 103个氨基酸序列提交NCBI进行BLAST同源性搜索，获得的同源序列除了拟南芥的PI3R基因之外，全部是与植物CMS恢复基因相关的序列，包括萝卜及甘蓝型油菜萝卜质CMS、甘蓝型油菜波里马CMS、水稻CMS和矮牵牛CMS的恢复基因；F、含特异片段的全长cDNA的获得根据所得的DNA片段设计引物，使用SMARTRACE CDNA AMP I CAT I ON KIT,分别进行5，RACE与3，RACE，设计的RACE引物序列如下3' RACE GSP 5' GGCTAAGCAGATGATGGACCTGATGGCTAGCAAGGG3'，5’ RACE GSP 5’ ATGTCCACGAGAGGGGTGGTTGCCAATACA3’ ；将扩增得到的RACE片段分别回收测序，测序结果经SEQMAN软件拼接，获得全长cDNA 序列；G、根据拼接好的全长cDNA序列在其5’UTR与3’ UTR区设计引物，使用该基因特异引物分别对育性分离群体中可育株与不育株进行RT_PCR扩增，并对异源细胞质雄性不育系统的恢复系、保持系、不育系以及同源细胞质雄性不育系统的恢复系基因组DNA进行扩增， PCR扩增体系及程序为=TaqMIX ΙΟμ ，DNA模板 μ ，正反向引物各1. 5μ , ddH20 6PL，PCR 扩增程序为 95°C 5min, 94°C 30 s, 64°C 45s, 72°C 3 min,共 34个循环，然后 75°C IOmin, PCR扩增产物用1. 5%g/v琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后检测，在异源细胞质雄性不育恢复系中有分子量约2. Ikb的扩增产物，在不育系、保持系及同源细胞质雄性不育恢复系中都无扩增产物，因此，根据全长cDNA序列5’ UTR与3’ UTR区设计的特异引物，其正向引物的序列为TACGCGGGGAGAGAAGCTTGTCTCG，反向引物的序列为CACATCATAACACACTAACCAGGAC TTTGTCTC，扩增出的长度约为2. Ikb的DNA片段作为油菜野芥细胞质雄性不育恢复基因的分子标记，获得了一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记。
2.权利要求1所述的一种油菜异源细胞质雄性不育恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种油菜雄性不育恢复基因分子标记的制备方法及应用，步骤是A、根据PPR基因保守氨基酸位点设计兼并引物；B、用CTAB法抽取油菜细胞质雄性不育恢复系的叶片DNA，采用降落PCR扩增出特异的恢复基因候选片断；C、PCR产物回收、转化、测序及序列分析；D、进行5’RACE与3’RACE，将测序结果拼接，获得全长cDNA序列；E、根据拼接好的全长cDNA序列在其5’UTR与3’UTR区设计特异引物，获得分子标记。同时公开了一种恢复基因的分子标记在油菜杂交种亲本选育中的应用方法，提高了恢复系选育的速度与鉴定效率，方法易行，操作性强，鉴定恢复材料速度快，极大减轻了恢复性鉴定必需经过测交及后代种植观察的工作量，提高了杂交种选育的效率。
文档编号C12N15/10GK102220316SQ201110099608
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者付丽, 徐育松, 李云昌, 李英德, 梅德圣, 胡琼, 郝建轶 申请人:中国农业科学院油料作物研究所