专利名称：pGreen Max1 真核表达载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种分子生物技术领域的载体及其制备方法，特别涉及的是一种 pGreen Maxl真核表达载体及其制备方法。
背景技术：
真核表达载体主要用于在细胞内大量表达某些特定的蛋白，目前已有的真核表达载体主要有(l)pCMVp-NEO-BAN载体，该载体在大多数真核细胞中都可以高水平稳定地表达外源目的基因，并可以利用G418进行筛选。Q)pEGFPi^^JnU.S.Patent Nos. 5625048 issued on April 29，1997。pEGFP 载体的特点是可以表达绿荧光蛋白，通过固定波长的光波激发可以发出绿荧光，该载体可以表达一个蛋白，使之与绿荧光形成融含蛋白，用于确定外源基因在细胞中的定位，同时， 该载体可以用G418来筛选。上述载体都有不足之处，pCMVp-NEO-BAN载体可以很好的表达外援蛋白，但筛选克隆和鉴定蛋白的表达量比较困难，不利于筛选。PEGFP载体可以比较简单的用于筛选和检测蛋白的表达量，但是由于要与绿荧光蛋白融合形成融合蛋白，对目的蛋白构象、后续加工和分布会有影响。pGreenMax 1载体很好的解决了这几个问题。它可以通过G418先进行初步的筛选克隆，然后可以根据细胞绿荧光的表达量来判断稳定细胞株的目的蛋白的表达量，并且绿荧光蛋白和目的蛋白不是形成融合蛋白，而是分别形成两个蛋白，对于目的蛋白构象和后续加工完全没有影响。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种pGreen Maxl真核表达载体及其制备方法，本发明可在哺乳动物细胞内高效表达蛋白或抗体，实现高产细胞株筛选提供稳定筛选标记。本发明是通过以下技术方案实现的本发明涉及的pGreen Maxl真核表达载体，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表达载体重组获得序列1，序列1共计7976bp，其中在第1769bp-2415bp之间插入了含有647bp的 Mex片段，在第3120bp-4^8bp之间插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。本发明涉及的上述pGreen Max 1真核表达载体的制备方法，包括设计引物从质粒中通过PCR的方法克隆得到Mex，并将PCR产物经过SmaI位点定向插入到表达载体中，并经过BamHI和NotI双酶切将IRES-EGFP插入到载体中，构建重组的pGreen Max真核表达载体。所述的pGreen Max 1真核表达载体的制备方法，包括如下步骤A、设计引物根据Mex序列设计引物，上游引物加入RiieI位点，引物序列如下Mex FGATATCGTTTAAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGAT
Mex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以带有Mex的质粒为模板，进行PCR扩增模板1 μ 1，上下游引物10 μ M各1 μ 1，2. 5mM的dNTP底物4 μ 1，10倍缓冲液5 μ 1，pfu聚合酶1 μ 1，双蒸水37 μ 1 ；95°C变性2分子；然后94°C变性30秒、55_65°C退火30秒、72°C延伸50秒，进行 30-40个循环；最后72°C延伸7-10分钟；C、扩增产物纯化PCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约647bp的扩增条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；D、pMex真核载体的构建D-1、酶切将载体用SmaI酶进行酶切，酶切时在反应体系中加入10倍缓冲液 2 μ 1, SmaI 1 μ 1，载体5 μ 1，无离子水12 μ 1，37°C水浴4个小时，酶切后的载体片段经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；D-2、连接回收的Mex的片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应；D-3、转化大肠杆菌将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素 100 μ 1/ml的LB培养基上37°C培养12-16小时；D-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆将菌落放大培养，纯化提取质粒；D-5、利用SpeI进行酶切鉴定和测序，证实得到序列1的pMex真核表达质粒；E、得到IRES-EGFP序列在质粒中利用BamHI和NotI双酶切得到IRES-EGFP序列，并经1 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约1300bp的条带，将目的条带切下，用Gel Extraction KitDNA纯化试剂盒进行纯化；F、pGreen Max 1真核表达载体的构建F-1、酶切将载体用BamHI和NotI双酶切，酶切时在反应体系中加入10倍缓冲液 2 μ 1，BamHIly 1, NotIy 1, pMex载体5 μ 1，无离子水12 μ 1，37°C水浴4个小时，酶切后的载体片段经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；F-2、连接回收的IRES-EGFP片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应；F-3、转化大肠杆菌将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素 100 μ 1/ml的LB培养基上37°C培养12-16小时；F-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆将菌落放大培养，纯化提取质粒；F-5、利用HindIII进行酶切鉴定和测序，证实得到序列1的pMex真核表达质粒。步骤C中所述的PCR产物，其纯化方法步骤如下①从琼脂糖凝胶中将PCR产物DNA条带切下，转入离心管中，加入2倍体积的结合缓冲液，55°C下温浴7分钟使得凝胶溶解；②将离心管中溶解的凝胶溶液转移到试剂盒自带的DNA吸附柱中，13000转/分钟离心2分钟；③向DNA吸附柱中加入700 μ 1漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液， 再加入500 μ 1漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液后，13000转/分钟离心2
分钟，室温放置5分钟；④将DNA吸附柱加入一个新的离心管中，加入65°C预热的洗脱缓冲液70 μ 1， 13000转/分钟离心2分钟，离心管底的溶液即为回收的PCR产物DNA片段。步骤D-2中所述的连接，其连接方法如下在反应体系中加入回收的PCR产物DNA片段8 μ 1和载体片段2 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，T4DNA连接酶1 μ 1，去离子水7 μ 1，16°C反应10h。步骤F-2所述的连接方法是在反应体系中加入回收的DNA片段8 μ 1和载体片段 2 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，T4DNA连接酶1μ 1，去离子水7μ 1，16°C反应10h。步骤D-3所述的转化大肠杆菌，其转化大肠杆菌方法步骤如下①取连接产物IOul加到50ul的感受态细胞中，轻轻摇勻，冰浴30min.②42°C热激90s，快速转到冰浴2_;3min，注意不要摇动管。③向管中加入500ul 的 LB 培养基，150rmp，37°C，45min.④将菌液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp.⑤将平板正置直至液体全部吸收。⑥倒置平板，于37°C培养12_16h.步骤D-4中所述的筛选重组真核表达载体阳性克隆，其筛选重组真核表达载体阳性克隆方法步骤如下①挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100μ g/ml)的LB培养基中，37°C，150rpm，摇床培养 12 16hr ；②取1-1. 5ml培养物倒入1. 5ml离心管中，4°C，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4°C保存；③将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100 μ 1冰预冷的碱裂解液I中，漩涡震荡， 使细菌悬浮均勻；④组菌重悬液中加入200 μ 1碱裂解液II，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解， 直至形成透亮的溶液，置于冰上(< 5min)；⑤加入150 μ 1冰预冷的碱裂解液III，上下翻转离心管8次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均勻，并将离心管置于冰上1 :3min，4°C，13000rpm离心5min，将 400 μ 1的上清转移至另一个离心管中；⑥加400 μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm 离心2min，取上清于新离心管中；⑦用2 2. 5体积的乙醇(850 μ 1)室温沉淀核酸，混合均勻，室温静置2min。 13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉；⑧加Iml左右70%乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)；⑨打开离心管，室温静置3 5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在；⑩加50 μ 1 TE缓冲液(含20 μ g/ml RNase Α)于离心管中，静置5min，温和震荡混勻，贮存于_20°C。步骤D-5中所述的酶切鉴定和测序，其酶切鉴定和测序方法如下在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，限制性内切酶SpeI Iy 1，去离子水13μ 1，37°C反应池；经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定pMex的目的条带，SpeI酶切后可切出约1. 3kb和5. 3kb的两个片段，与预期相符，表明目的片段已正确的插入载体中；步骤F-5中的酶切鉴定和测序，其酶切鉴定和测序方法如下在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，限制性内切酶HindIII Iy 1，去离子水13μ 1，37°C反应池；经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定pGreen Max 1的目的条带，HindIII酶切后可切出约4. 9kb,2. 9kb和230bp的三个片段，与预期相符，表明目的片段已正确的插入载体中。本发明应用的是EFl α启动子，是人体内高表达蛋白的启动子，可以避免外源启动子对细胞的不良影响。同时该载体可以利用绿荧光的发光来表征蛋白在细胞中的表达， 便于细胞株的筛选。可在高产哺乳动物细胞株的筛选提供蛋白表达及筛选的标记，为蛋白高效表达提供了很好的载体，也为细胞株的筛选提供一种新的方法和便利。
图1是本发明的PCR的电泳照片；其中可以看到500bp到750bp之间有一个明显的条带，条带大小与预期的647bp 大致相等，与预期相符，表明Mex序列PCR成功。图2是本发明的pMex质粒的酶切鉴定的电泳图片；其中经过SpeI酶切后，可以切出1.31Λ和5. 31Λ两个条带，与预期相符，表明Mex 片段已正确的插入到载体当中。图3是pMex和IRES-EGFP的酶切电泳照片；其中经过BamHI和NotI酶切，载体大小为6. 6kb, IRES-EGFP序列为1. 3kb,与预
期大小相符。图4是pGreen Max 1质粒酶切照片；其中，经过HindIII酶切，可以切出三个条带，分别是4. 9kb、2. 9kb和230bp的条带，与预期条带相符，表明IRES-EGFP序列已经正确插入到pMex载体当中。图5是转染了蛋白A重组真核表达载体的细胞其中，转染以后，细胞中可以表达绿荧光蛋白，可以用于细胞株的筛选。图6是转染了蛋白A重组真核表达载体的细胞的上清免疫荧光的照片图7为抗体B蛋白电泳照片。其中，转染以后，在细胞的上清中可以检测到蛋白A的表达。表明载体构建成功并可以应用。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的担载蛋白的组织工程纤维支架及其制备和体外释放实验实施作详细说明以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中载体及基因来源说明特异引物由上海生工合成；载体构建中使用的限制性内切酶BamIII、NotI、pfu酶和T4连接酶均!^ermentas公司产品(生工生物工程 (上海)有限公司，021-37772180)；载体构建中使用的DNA纯化试剂盒为索莱宝公司(上海索宝生物科技有限公司，上海市徐汇区钦江路)产品，按说明书进行；载体转染(PEI为sigma公司产品)及分泌表达检测试剂均为市售试剂。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1pGreen Maxl真核表达载体构建方法A、设计引物根据Mex序列设计引物，上游引物加入RiieI位点，引物序列如下Mex FGATATCGTTT AAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGATMex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以带有Mex的质粒为模板，进行PCR扩增模板1 μ 1，上下游引物10 μ M各1 μ 1， 2. 5mM的dNTP底物4 μ 1，10倍缓冲液5 μ 1，pfu聚合酶1 μ 1，双蒸水37 μ 1 ；95°C变性2分子；然后94°C变性30秒、55-65°C退火30秒、72°C延伸50秒，进行30-40个循环；最后72°C 延伸7-10分钟；C、扩展产物纯化PCR产物经琼脂糖电泳分离后，可见一条约647bp的扩增条带，将目的条带切下，用公司琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化，方法是C-I、从琼脂糖凝胶中将PCR产物DNA条带切下，转入离心管中，加入2倍体积的结合缓冲液，55°C下温浴7分钟使得凝胶溶解；C-2、将离心管中溶解的凝胶溶液转移到试剂盒自带的DNA吸附柱中，13000转/分钟离心2分钟；C-3、向DNA吸附柱中加入700 μ 1漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液，再加入500 μ 1漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液后，13000转/分钟离心 2分钟，室温放置5分钟；C-4、将DNA吸附柱加入一个新的离心管中，加入65°C预热的洗脱缓冲液70 μ 1， 13000转/分钟离心2分钟，离心管底的溶液即为回收的PCR产物DNA片段。如图1所示，可以看到500bp到750bp之间有一个明显的条带，条带大小与预期的 647bp大致相等，与预期相符，表明Mex序列PCR成功。D、pMex真核表达载体的构建D-1、酶切将载体用SmaI酶切，酶切的片段和载体经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收的方法是在反应体系中加入10倍缓冲液2 μ 1，SmaI 1 μ 1，载体5 μ 1，无离子水 12 μ 1，37°C水浴4个小时。D-2、连接回收的Mex片段和载体用T4连接美俄进行体外连接反应方法是在反应体系中加入回收的PCR产物DNA片段8μ 1和载体片段2μ 1，10倍缓冲液2μ 1，T4DNA连接酶1 μ 1，去离子水7 μ 1，16°C反应10h。D-3、转化大肠杆菌将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞中，在含有氨苄青霉素100μ 1/ml的LB培养基上37°C培养12-16小时，方法是a、取连接产物IOul加到50ul的感受态细胞中，轻轻摇勻，冰浴30min.b、42°C热激90s，快速转到冰浴2_;3min，注意不要摇动管。c、向管中加入 500ul 的 LB 培养基，150rmp，37°C，45min.
d、将菌液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp.e、将平板正置直至液体全部吸收。f、倒置平板，于37°C培养12_16h.D-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆将菌落放大培养，纯化提取质粒，方法是a.挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100 μ g/ml)的LB培养基中，37°C，150rpm，摇床培养 12 16hr。b.取l_1.5ml培养物倒入1. 5ml离心管中，4°C，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4°C保存。c.将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于ΙΟΟμ 1冰预冷的碱裂解液I中，漩涡震荡， 使细菌悬浮均勻。d.细菌重悬液中加入200 μ 1碱裂解液II，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(< 5min)。e.加入150 μ 1冰预冷的碱裂解液III，上下翻转离心管8次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均勻，并将离心管置于冰上1 3min，4°C，13000rpm离心5min，将 400 μ 1的上清转移至另一个离心管中。f.加400μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm 离心2min，取上清于新离心管中。g.用2 2. 5体积的乙醇(850 μ 1)室温沉淀核酸，混合均勻，室温静置2min。 13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉。h.加Iml左右70%乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)。i.打开离心管，室温静置3 5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在。j.加50 μ 1 TE缓冲液(含2 μ g/ml RNaseA)于离心管中，静置5min，温和震荡混勻。贮存于_20°C。D-5、酶切鉴定和测序，证实得到的序列是真核表达质粒，方法是在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，限制性内切酶SpeI 1μ 1，去离子水13μ 1，37°C反应；如图2所示，经过SpeI酶切后，可以切出1. 31Λ和5. 31Λ两个条带，与预期相符， 表明Mex片段已正确的插入到载体当中；E、得到 IRES-EGFP 序列在质粒中利用BamHI和NotI双酶切得到IRES-EGFP序列，并经1 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约1300bp的条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化如图3所示，经过BamHI和NotI酶切，载体大小为6. 61Λ，IRES-EGFP序列为1. 3kb, 与预期大小相符。
F、pGreen Max真核表达载体的构建F-1、酶切将载体用BamHI和NotI双酶切，酶切后的载体片段经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收。方法是在反应体系中加入10倍缓冲液2 μ 1，BamHI 1 μ l,NotI μ 1， pMex载体5μ 1，无离子水12μ 1，37°C水浴4个小时。F-2、连接回收的IRES-EGFP片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应，方法是 在反应体系中加入回收的DNA片段8μ 1和载体片段2μ 1，10倍缓冲液2μ 1，T4DNA连接酶 1μ 1，去离子水7μ 1，16°C反应IOh0F-3、转化大肠杆菌将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素 100 μ 1/ml的LB培养基上37°C培养12-16小时；F-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆将菌落放大培养，纯化提取质粒；F-5、利用HindIII进行酶切鉴定和测序，证实得到序列1的pMex真核表达质粒。 方法是在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，限制性内切酶HindIII 1 μ 1，去离子水13 μ 1，37°C反应浊；如图4所示，用琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定pGreen Max 1的目的条带，经过 HindIII酶切，可以切出三个条带，分别是4. 9kb,2. 9kb和230bp的条带，与预期条带相符， 表明IRES-EGFP序列已经正确插入到pMex载体当中。进行重组真核表达载体的测序，测序结果显示该重组真核表达载体的序列1大小为，在与Mex、IRES-EGFP序列完全一致，说明成功构建了命名为pGreen Max 1真核表达载体，如序列1所示。实施例2真核表达载体的表达蛋白A、重组真核表达载体的获得以蛋白A和蛋白B为例来进行说明。A-I、得到含有蛋白A和抗体B的重组载体通过PCR等技术获得蛋白A和抗体B的序列，利用T4DNA连接酶的体外连接，得到含有蛋白A和抗体B的重组载体。A-2、重组表达载体的提取与纯化用于转染的pGreen Max 1重组蛋白A和pGreen Max 1重组抗体B的质粒用质粒小量抽提的方法进行提取与纯化，具体操作步骤如下a.挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100μ g/ml)的LB培养基中，37°C，150rpm，摇床培养 12 16hr。b.取l_1.5ml培养物倒入1. 5ml离心管中，4°C，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4°C保存。c.将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100μ 1冰预冷的碱裂解液I中，漩涡震荡， 使细菌悬浮均勻。d.细菌重悬液中加入200 μ 1碱裂解液II，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(< 5min)。e.加入150 μ 1冰预冷的碱裂解液III，上下翻转离心管8次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均勻，并将离心管置于冰上1 3min，4°C，13000rpm离心5min，将 400 μ 1的上清转移至另一个离心管中。f.加400μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm 离心2min，取上清于新离心管中。g.用2 2. 5体积的乙醇(850 μ 1)室温沉淀核酸，混合均勻，室温静置2min。 13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉。h.加Iml左右70%乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)。i.打开离心管，室温静置3 5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在。j.加50 μ 1 TE缓冲液(含2 μ g/ml RNaseA)于离心管中，静置5min，温和震荡混勻。贮存于_20°C。B、蛋白A重组真核表达载体和抗体B重组真核表达载体在细胞中的分泌表达转染腺病毒ElA基因的人肾上皮细胞系四31~细胞培养与含有10% FCS(胎牛血清)的DMEM完全培养液中，转染前将细胞均勻的铺在IOcm培养皿中，具体步骤按照PEI介导的细胞转染实验进行1、分别将DNA和PEI加入无抗生素、无血清的DMEM培养液Iml中混勻，然后将两液混合成转染液，室温放置10-20分钟；2、吸弃培养皿中的培养液，用无抗生素无血清的DMEM培养液轻轻洗两次，加入 3ml无抗生素无血清的DMEM培养液；3、按蛋白A重组表达载体IOyg/皿，将转染液逐滴加入培养皿中，置于5% 二氧化碳、37°C培养箱中培养4-6小时后，置换无血清培养基继续培养M-48小时后，手机细胞培养上清；4、取转染上清，用浓度为10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，通过免疫印记 (Western Blot)检测蛋白A和抗体B的分泌表达情况。如图5所示，转染以后，细胞中可以表达绿荧光蛋白，可以用于细胞株的筛选。如图6所示，转染以后，在细胞的上清中可以检测到蛋白A的表达。表明载体构建成功并可以应用。如图7所示，蛋白为抗体B的蛋白。蛋白大小为19kD左右。通过图片可以很好的看出细胞上清中含有该抗体并且可以很好的检测出该蛋白，表明该载体可以应用。上述实施例pGreen Max 1真核表达载体作为在真核细胞中获取目的蛋白或抗体的应用，用于制备大量所需目的蛋白以进行临床前研究，并为高产哺乳动物细胞株的筛选提供蛋白表达及筛选的标记，为蛋白高效表达提供了很好的载体，也为细胞株的筛选提供一种新的方法和便利。
权利要求
1.一种pGreen Maxl真核表达载体，其特征在于，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表达载体重组获得序列1，序列1共计7976bp，其中在第1769bp-2415bp之阀插入了含有647bp 的Mex片段，在第3120bp-4^8bp之间插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。
2.一种根据权利要求1所述的pGreen Maxl真核表达载体的制备方法，其特征在于， 包括设计引物从质粒中通过PCR的方法克隆得到Mex，并将PCR产物经过SmaI位点定向插入到表达载体中，并经过BamHI和NotI双酶切将IRES-EGFP插入到载体中，构建重组的 pGreen Max真核表达载体。
3.根据权利要求2所述的pGreenMaxl真核表达载体的制备方法，其特征是，包括如下步骤A、设计引物根据Mex序列设计引物，上游引物加入RiieI位点，引物序列如下 Mex F :GATATCGTTT AAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGATMex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以带有Mex的质粒为模板，进行PCR扩增模板Iy1，上下游引物 ΙΟμΜ各1μ 1，2. 5mM的dNTP底物4μ 1，10倍缓冲液5μ l，pfu聚合酶1μ 1，双蒸水37μ 1 ； 95°C变性2分子；然后94°C变性30秒、55_65°C退火30秒、72°C延伸50秒，进行30-40个循环；最后72°C延伸7-10分钟；C、扩增产物纯化PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，将一条约647bp的扩增目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；D、pMex真核载体的构建D-1、酶切将载体用SmaI酶进行酶切，酶切时在反应体系中加入10倍缓冲液2 μ 1， SmaI 1μ 1，载体5μ 1，无离子水12μ 1，37°C水浴4个小时，酶切后的载体片段经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；D-2、连接回收的Mex的片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应； D-3、转化大肠杆菌将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素 100 μ 1/ml的LB培养基上37°C培养12-16小时；D-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆将菌落放大培养，纯化提取质粒； D-5、利用SpeI进行酶切鉴定和测序，证实得到序列1的pMex真核表达质粒；E、得到IRES-EGFP序列在质粒中利用BamHI和NotI双酶切得到IRES-EGFP序列，并经1 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，将一条约1300bp的目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；F、pGreenMax 1真核表达载体的构建F-1、酶切将载体用BamHI和NotI双酶切，酶切时在反应体系中加入10倍缓冲液 2 μ 1，BamHIly 1, NotIy 1, pMex载体5 μ 1，无离子水12 μ 1，37°C水浴4个小时，酶切后的载体片段经琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；F-2、连接回收的IRES-EGFP片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应； F-3、转化大肠杆菌将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素 100 μ 1/ml的LB培养基上37°C培养12-16小时；F-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆将菌落放大培养，纯化提取质粒； F-5、利用HindIII进行酶切鉴定和测序，证实得到序列1的pMex真核表达质粒。
4.根据权利要求3所述的pGreenMaxl真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤C中所述的PCR产物，其纯化方法步骤如下①从琼脂糖凝胶中将PCR产物DNA条带切下，转入离心管中，加入2倍体积的结合缓冲液，55°C下温浴7分钟使得凝胶溶解；②将离心管中溶解的凝胶溶液转移到试剂盒自带的DNA吸附柱中，13000转/分钟离心 2分钟；③向DNA吸附柱中加入700μ 1漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液，再加入500 μ 1漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液后，13000转/分钟离心2分钟，室温放置5分钟；④将DNA吸附柱加入一个新的离心管中，加入65°C预热的洗脱缓冲液70μ 1，13000转 /分钟离心2分钟，离心管底的溶液即为回收的PCR产物DNA片段。
5.根据权利要求3所述的pGreenMaxl真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤D-2 中所述的连接，其连接方法如下在反应体系中加入回收的PCR产物DNA片段8 μ 1和载体片段2 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，T4DNA连接酶1μ 1，去离子水7μ 1，16°C反应10h。步骤F_2 所述的连接方法是在反应体系中加入回收的DNA片段8 μ 1和载体片段2 μ 1，10倍缓冲液 2 μ 1，T4DNA连接酶1μ 1，去离子水7μ 1，16°C反应10h。
6.根据权利要求3所述的pGreenMaxl真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤D-3 所述的转化大肠杆菌，其转化大肠杆菌方法步骤如下①取连接产物IOul加到50ul的感受态细胞中，轻轻摇勻，冰浴30min.；②42°C热激90s，快速转到冰浴2-aiiin，注意不要摇动管；③向管中加入500ul的LB培养基，150rmp，37°C，45min.；④将菌液全部涂到LB平板上，含100ug/mlAmp.；⑤将平板正置直至液体全部吸收；⑥倒置平板，于37°C培养12-16h.。
7.根据权利要求3所述的pGreenMaxl真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤D-4 中所述的筛选重组真核表达载体阳性克隆，其筛选重组真核表达载体阳性克隆方法步骤如下①挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100yg/ml)的LB培养基中， 37°C，150rpm，摇床培养 12 IMir ；②取1-1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，4°C，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4°C保存；③将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100μ 1冰预冷的碱裂解液I中，漩涡震荡，使细菌悬浮均勻；④细菌重悬液中加入200μ 1碱裂解液II，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上< 5min ；⑤加入150μ 1冰预冷的碱裂解液III，上下翻转离心管8次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均勻，并将离心管置于冰上1 :3min，4°C，13000rpm离心5min，将 400μ 1 的上清转移至另一个离心管中；⑥加400μ1体积比为1 1的酚氯仿，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm离心2min，取上清于新离心管中；⑦用2 2.5体积的乙醇850 μ 1室温沉淀核酸，混合均勻，室温静置anin。13000rpm 离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉；⑧加Iml左右70%乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心lmin。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出，若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部；⑨打开离心管，室温静置3 5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在；⑩加含20μ g/ml RNase A的50 μ 1 TE缓冲液于离心管中，静置5min，温和震荡混勻， 贮存于-20°C。
8.根据权利要求3所述的pGreenMaxl真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤D-5 中所述的酶切鉴定和测序，其酶切鉴定和测序方法如下在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，限制性内切酶 SpeI Iy 1，去离子水13μ 1，37°C反应池；经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定pMex的目的条带，SpeI酶切后可切出约1. 3kb和5. 3kb的两个片段，表明目的片段已正确的插入载体中。
9.根据权利要求3所述的pGreenMaxl真核表达载体的制备方法，其特征是，步骤F-5 中的酶切鉴定和测序，其酶切鉴定和测序方法如下在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5 μ 1，10倍缓冲液2 μ 1，限制性内切酶 HindIII Iy 1，去离子水13μ 1，37°C反应浊；经1 %琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定pGreen Maxl的目的条带，HindIII酶切后可切出约4. 9kb,2. 9kb和230bp的三个片段，表明目的片段已正确的插入载体中。
10.一种根据权利要求1所述的pGreen Maxl真核表达载体的应用，其特征在于， PGreen Maxl真核表达载体作为在真核细胞中获取目的蛋白或抗体的应用，并为高产哺乳动物细胞株的筛选提供蛋白表达及筛选的标记。
全文摘要
本发明涉及一种分子生物技术领域的pGreen Max1真核表达载体及其制备方法。由Mex、IRES-EGFP片段和真核表达载体重组获得序列1，序列1共计7976bp，其中在第1769bp-2415bp之间插入了含有647bp的Mex片段，在第3120bp-4428bp之间插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列；制备方法包括设计引物从质粒中通过PCR的方法克隆得到Mex，并将PCR产物经过SmaI位点定向插入到表达载体中，并经过BamHI和NotI双酶切将IRES-EGFP插入到载体中，构建重组的pGreenMax真核表达载体。本发明载体作为在真核细胞中获取目的蛋白或抗体的应用，并为高产哺乳动物细胞株的筛选提供蛋白表达及筛选的标记。
文档编号C12N15/85GK102242143SQ20111009937
公开日2011年11月16日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者徐维果, 李大伟, 武正华, 金龙 申请人:上海交通大学