专利名称：一种检测转基因牛的基因芯片，其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于动物分子生物学领域，特别涉及一种检测转基因牛的基因芯片、其制备方法和应用。
背景技术：
转基因技术是指将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，导入基因的表达，引起生物体性状可遗传的一种修饰技术，经该技术修饰的生物体称为遗传修饰生物， 俗称转基因生物(genetically modified organisms，GMO)。转基因动物是人类按着自己的意愿有目的、有计划、有根据、有预见地改变动物的遗传组成，是基于现代分子生物学和动物胚胎和配子生物工程的一项富有挑战性的实验技术。它的研究成果在提高生产能力、改善产品质量、生产生物医药产品、研究人类疾病模型，特别是在治疗人类的疑难病症方面都显示出了广阔的应用前景。转基因动物已成为生命科学研究和开发的重要领域，并逐渐成为一类极具发展前景的高新技术产业，特别是一些猪、牛、羊等转基因产品极具发展潜力， 并正在进行商品化研究。转基因技术能提高动植物驯化水平、获得人类所需要产品，但其安全性也有待进一步考察，对GMO的检测受到广泛关注。各个国家对于转基因技术的安全问题及对转基因产品的规定也不尽相同，如美国可能解除GMO管制；欧盟限制性使用GMOjn 进口物品和食物；中国只批准使用某些特定的GMO产品。许多国家都要求超过一定阈值的 GMO产品贴标签，因此，GMO的检测十分重要。近些年，随着国际社会和我国各级政府部门对转基因产品的安全性问题日益重视并采取了多项积极措施，其中最重要的措施之一就是对转基因产品要进行检验，以明确其种类，确定是否为已批准的或已获得许可的转基因产品，以防止一些具有风险的转基因产品任意扩散，造成不可挽回的损失。目前，转基因动物的检测主要有DNA水平、RNA水平和蛋白水平的检测。主要的方法包括各种PCR方法、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、Western印迹杂交等。我国在转基因动物及产品的安全性评价及检测方面基础相对薄弱，对一些极具商品化前景的转基因动物及产品缺乏准确有效的检测和监测手段。而如何高通量、快速、准确地检测大量试验动物，将是转基因动物检测方法在未来发展中遇到的首要问题，也是转基因发展的首要问题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种检测转基因牛的基因芯片， 其制备方法和应用。本发明提供的检测转基因牛的基因芯片，其包括固相载体和固定在该载体上的寡核苷酸探针，其中寡核苷酸探针包括检测探针和质控探针，所述的检测探针为牛、羊、猪线粒体基因、人乳铁蛋白基因、人溶菌酶基因、人-α-乳清蛋白基因、绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因的特异性探针。
其中所述的每个基因可用至少一条检测探针，较为经济的，每个基因可使用两条检测探针，所述的检测探针的序列如SEQ ID No. 1 16所示。本发明还提供制备所述基因芯片的方法，包括人工合成序列如SEQ ID No. 1 16 所示的探针，用芯片点样仪将所述的探针固定在氨基玻片上，制备含有特异性探针的基因
芯片。本发明还提供所述基因芯片的应用。本发明提供应用所述的基因芯片进行转基因牛检测的方法，包括如下步骤1)提取待测转基因牛的基因组DNA，进行多重不对称PCR扩增，扩增牛、羊、猪线粒体基因、人乳铁蛋白编码基因、人溶菌酶编码基因、人-α-乳清蛋白编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和新霉素磷酸转移酶基因；2)取杂交缓冲液13 μ L，将上述的三组PCR产物等比例混合后取2 μ L，质控探针 (ctrl) 1 μ L，混合均勻后，95°C进行5min变性，立即冰浴3min,3000rpm离心；将芯片浸入 90-100°C水中煮沸2min ；取出芯片迅速浸入已冰冷的乙醇中lmin，离心甩干；将杂交盒的沟槽中加200 μ L水，以防止杂交过程中杂交液蒸发。将芯片朝上放置在杂交盒中，加盖盖玻片；从盖玻片加样孔中加16 μ L已经变性处理的杂交样品，立即将杂交盒密封，并放入 42 °C水浴锅中，杂交12h。3)将杂交后的基因芯片进行洗涤、甩干并进行扫描分析。其中，所述的用于扩增牛、羊、猪线粒体基因、人乳铁蛋白编码基因、人溶菌酶编码基因、人-α-乳清蛋白编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和新霉素磷酸转移酶基因的引物分别为SEQ ID No. 17 禾口 18 ；SEQ ID No. 19 和 20 ；SEQ ID No. 21 和 22 ；SEQ ID No. 23 和 24 ； SEQ ID No. 25 和 26 ； SEQ ID No. 27 和 28 ；SEQ ID No. 29 和 30 ； SEQID No. 31 和 32。为便于芯片对扩增产物的读判，对每个基因的下游引物均进行了 TAMRA荧光修饰。本发明中，将LTF、α-LALBA、LYZ、EGFP、NPTII 基因以及 BOS、OVIS、SUS 基因分别进行 3 组多重 PCR 扩增，即 BOS、OVIS, SUS 基因；EGFP、NPT II ；LTF, α -LALBA, LYZ。反应体系为50 μ L，反应条件为95°C预变性5min ；94°C变性45s，56°C退火30s，72°C延伸30s， 30个循环；72°C延伸lOmin。产物4°C避光保存。本发明中，芯片与PCR产物的具体杂交步骤如下杂交取杂交缓冲液(终浓度为50%甲酰胺，5 X SSC，0. SDS，5 XDenhardt' s 的水溶液)13μ L、PCR产物混合物2μ L、质控探针(Ctrl) 1 μ L混合均勻(16 μ L体系)，95°C 热变性5min，立即冰浴3min，3000rpm离心。将芯片浸入90-100°C水中煮沸2min ；取出芯片迅速浸入已冰冷的乙醇中lmin，离心甩干；将样品杂交液混勻后加到芯片阵列区后放入杂交盒，密封后置于42°C水浴杂交12h。洗涤杂交结束，将芯片置于预热到42°C的洗液I(2XSSC，0. 1 % SDS) 120rpm洗涤 5min，重复两次；将芯片取出后置于预热到42°C的洗液11(0. 2 X SSC, 0. 1% SDS)中120rpm 洗涤5min，重复两次；将芯片取出后置于洗液111(0. 2XSSC)中120rpm洗涤5min。再将芯片置于无水乙醇中浸提6-8次，离心甩干。扫描将杂交完毕的芯片插入PerkinElmer ScanArray Gx plus扫描仪中进行扫描分析波长532nm ；PMT70%;能量90%;亮度93，对比度96。当PC、QC都有荧光信号而NC 没有荧光信号时，为有效杂交结果。根据阵列图，每个样品的同一条探针的3个重复点都有荧光信号时为杂交阳性，只有一个点有荧光信号时为可疑结果，应进行重复试验；无荧光信号为杂交阴性。本发明还提供含有所述基因芯片的转基因牛检测试剂盒。所述的试剂盒还包括 SEQ ID No. 17 32所示的引物、Taq DNA聚合酶、杂交缓冲液、洗液I、洗液II和洗液III寸。本发明针对编码牛(BOS)、羊(OVIS)、猪(SUS)的线粒体基因，人乳铁蛋白编码基因(LTF)、人溶菌酶编码基因(LYZ)、人-α-乳清蛋白编码基因(α-LALBA)，以及转基因动物常用的标记基因绿色荧光蛋白编码基因(EGFP)和新霉素磷酸转移酶基因(NPT II)，设计了 8对特异性引物。根据扩增的靶序列，设计并合成16条特异性探针和3条质控探针， 用芯片点样仪将探针固定到氨基玻片上，制备含有特异性探针的基因芯片；将多重不对称扩增产物与基因芯片杂交后扫描，建立转基因牛基因芯片检测方法。本发明所用的是70mer 无修饰检测探针，既提高了特异性又节约了成本。本发明中用多重不对称PCR方法扩增基因组DNA，由于引物浓度的不对称可使扩增后得到更多单链，可直接用于芯片杂交而无需后处理，显著提高了杂交效率和敏感度。本发明的方法检测灵敏度达10个拷贝数，转基因牛相关转基因样品高通量筛查结果表明，具有特异性强和敏感性高的特点，适合转基因牛相关转基因成分的筛查。
图1所示为基因芯片阵列排布图。图2所示为基因芯片检测转基因牛结果。其中，A为人乳铁蛋白转基因奶牛；B为人α “乳清蛋白转基因奶牛；C为人溶菌酶转基因奶牛；D为阴性对照。图3所示为基因芯片特异性试验结果。其中，A为非转基因鸡样品、B为非转基因猪样品、C为非转基因牛样品、D为非转基因羊样品、E为转Mxl鼠样品；F为转Omega-3脂肪酸去饱和酶基因猪样品。图4所示为LTF敏感性结果。其中，A为IO5拷贝；B为IO3拷贝；C为IO1拷贝。图5所示为LYZ敏感性结果。其中，A为IO5拷贝；B为IO3拷贝；C为IO1拷贝。图6所示为α -LALBA敏感性结果。其中，A为IO5拷贝；B为IO3拷贝；C为IO1拷贝。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1转基因动物转人乳铁蛋白基因奶牛制备方法参考文献“Yang P.，Wang J.，Gong G.，et al. Cattle mammary bioreactor generated by a novel procedure of transgenic cloning for large-scale production of functional human lactoferrin[J]. PLoS One, 2008，3 (10) :e3453”。转人-α-乳清蛋白编码基因奶牛制备方法参考文献“Wang J，Ymg P，Tmg B， et al.Expression and characterization of bioactive recombinant human alpha-lactalbumin in the milk of transgenic cloned cows[J]. J Dairy Sci，2008，
591(12) 4466 4476”。转人溶菌酶基因奶牛制备方法参考文献“Z Yu, Q Meng, H Yu. Expression and Bioactivity of Recombinant Human Lysozyme in the Milk of Transgenic Mice[J]· Journal of Dairy Science,2006，89(18) :2911 2918”。转Omega-3脂肪酸去饱和酶基因猪制备方法参考文献“潘登科，张莉，周艳荣.体细胞核移植生产转ω-3脂肪酸去饱和酶基因sFat-Ι克隆猪[J].中国科学，2009，39 (3) 295-302，，禾口文献"Lai L, Kang J X, Li R, et al. Generation of cloned transgenicpigs rich in omega-3 fatty acids[J], Nat Biotechnol，2006，24(4) :435 436”。实施例2引物、探针的设计和合成根据Genbank已发表的编码牛、羊、猪的线粒体基因(BOS mtDNA16s rRNA、Ovis mtDNA12s rRNA、Sus NADH5)，人乳铁蛋白、人溶菌酶、人-α -乳清蛋白这三种蛋白各自的编码基因，以及转基因动物常用的标记基因EGFP和NPT II相关序列，应用DNAstar、 primer5. O.DNAman.Mega等筛查并设计了 8对检测引物和16条特异性探针，引物和探针均由上海Invitrogen公司合成。为便于芯片对扩增产物的读判，对下游引物进行了 TAMRA修饰。表1 转基因芯片引物序列
权利要求
1.一种检测转基因牛的基因芯片，其包括固相载体和固定在该载体上的寡核苷酸探针，其中寡核苷酸探针包括检测探针和质控探针，所述的检测探针为牛、羊、猪线粒体基因、 人乳铁蛋白基因、人溶菌酶基因、人-α -乳清蛋白基因、绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因的特异性探针。
2.根据权利要求1所述的基因芯片，其特征在于，每个所述基因两条检测探针，所述的检测探针的序列如SEQ ID No. 1 16所示。
3.权利要求1或2所述的基因芯片的制备方法，包括人工合成序列如SEQID No. 1 16所示的探针，用芯片点样仪将所述的探针固定在氨基玻片上，制备含有特异性探针的基因芯片。
4.应用权利要求1或2所述的基因芯片进行转基因牛检测的方法，包括如下步骤1)提取待测转基因牛的基因组DNA，进行多重不对称PCR扩增，扩增牛、羊、猪线粒体基因、人乳铁蛋白编码基因、人溶菌酶编码基因、人-α-乳清蛋白编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和新霉素磷酸转移酶基因；2)将杂交缓冲液、PCR产物和质控探针混合均勻，预变性后加到基因芯片上进行杂交；3)将杂交后的基因芯片进行洗涤、甩干并进行扫描分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的用于扩增牛、羊、猪线粒体基因、人乳铁蛋白编码基因、人溶菌酶编码基因、人-α -乳清蛋白编码基因、绿色荧光蛋白编码基因和新霉素磷酸转移酶基因的引物分别为=SEQ ID No. 17和18 ；SEQ ID No. 19和20 ；SEQ ID No. 21 禾口 22 ；SEQ ID No. 23 禾口 24 ； SEQ ID No. 25 禾口 26 ； SEQID No. 27 禾口 28 ；SEQ ID No. 29 和 30 ； SEQ ID No. 31和 32。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的每对扩增引物的下游引物用荧光基团进行修饰，所述荧光基团优选为TAMRA、Cy-3或Cy_5。
7.根据权利要求4 6任一项所述的方法，其特征在于，以牛、羊、猪线粒体基因为一组，绿色荧光蛋白编码基因和新霉素磷酸转移酶基因为一组，人乳铁蛋白编码基因、人溶菌酶编码基因和人-α-乳清蛋白编码基因为一组，分别进行多重不对称PCR扩增，所述的PCR 反应条件为95°C预变性5min ；94°C变性45s，56°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C 延伸lOmin。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的杂交缓冲液为终浓度为50%甲酰胺、5XSSC，0. 1% SDS, 5XDenhardt' s 的水溶液。
9.含有权利要求1或2所述的基因芯片的转基因牛检测试剂盒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，还含有SEQID No. 17 32所示的引物、Taq DNA聚合酶、杂交缓冲液、洗液I、洗液II和洗液III。
全文摘要
本发明公开了一种检测转基因牛的基因芯片、其制备方法和应用。本发明提供的芯片，包括固相载体和固定在该载体上的寡核苷酸探针，其中寡核苷酸探针包括检测探针和质控探针，所述的检测探针为牛、羊、猪线粒体基因、人乳铁蛋白基因、人溶菌酶基因、人-α-乳清蛋白基因、绿色荧光蛋白基因和新霉素磷酸转移酶基因的特异性探针。用本发明的基因芯片和建立的方法对转基因牛检测，准确性、特异性和灵敏度均较高，适合转基因牛高通量筛查。
文档编号C12Q1/68GK102181553SQ20111009952
公开日2011年9月14日 申请日期2011年4月20日 优先权日2011年4月20日
发明者林祥梅, 王慧煜, 韩雪清 申请人:中国检验检疫科学研究院