间日疟原虫和镰状疟原虫红细胞结合蛋白的结合区的制作方法

专利名称：间日疟原虫和镰状疟原虫红细胞结合蛋白的结合区的制作方法
背景技术：
每年有200-400百万人感染疟疾，引起1-2百万人死亡，因此疟疾是世界上现存的最严重要的感染性疾病之一。在非洲乡村，年龄在一到四岁之间的儿童总死亡数中有大约25％由疟疾引起。由于该疾病作为一种世界研究性健康问题的严重性，人们花费了相当大的努力来鉴定和研究疟疾疫苗。
人类的疟疾由寄生疟原虫属的四个种引起镰状疟原虫，间日疟原虫，P.knowlesi和三日疟原虫。人类疟疾的主要起因是镰状疟原虫，它每年感染200百万到400百万人，导致1到4百万人死亡。
间日疟原虫(人类的四种感染性疟原虫之一)不能在体外培养，而P.knowlesi(在东半球猴中发现的疟疾品种，也侵入人红细胞)和镰状疟原虫能。尽管间日疟原虫与P.knowle-si在系统发育上基本相似，但两个品种在许多重要方面不同。例如间日疟原虫对许多猿猴种类不感染且在其它种类中不易形成感染，而P.knowlesi不易感染人类但容易感染许多猿猴种类。
抗疟疾的各种有效疫苗的基础鉴别是通过了解该寄生虫的生存周期来实现的。当幼龄疟疾寄生虫或“子孢子”被蚊注射进人的血液中时感染人类。注射后，寄生虫定位于肝细胞。大约一周后，寄生虫或“裂殖子”释放进血液中。寄生虫进入血液后开始“红细胞”期。每个寄生虫进入红血细胞以便生长和发育。当裂殖子在红血细胞中成熟时，将它称为滋养体，滋养体进行几轮核分裂(裂殖生殖)直到使红细胞破裂，释放6到24个裂殖子。经过几个无性裂殖生殖循环后，有些寄生虫发育成称为“配子母细胞”的形态学上明显不同的形式，其寿命长且进行有性发育以代替通过有性繁殖产生的裂殖体。
疟原虫的有性发育涉及雌性或“大配子母细胞”和雄性疟原虫或“小配子母细胞”。这些配子母细胞在人体内不进行进一步的发育。当配子母细胞摄入到蚊体内后，在蚊中肠开始复杂的有性循环。10到20分钟后红血细胞在纹中肠分裂。小配子母细胞通过小配子形成继续发育并释放8个鞭毛丰富的小配子母细胞。受精通过大配子母细胞和小配子母细胞的融合实现。受精的疟原虫称为受精卵，由它发育成“动合子”。动合子包埋于蚊中肠，在那里转化成卵母细胞，形成许多小孢子。在包埋于中肠之前，动合子必须首先穿透围食膜，围食膜明显充当摄入的疟原虫入侵的屏障。卵母细胞破裂成小孢子，经血淋巴迁移到蚊唾液腺。一旦进入蚊唾液，疟原虫可被注射进宿主体内。
疟原虫属生活史的红细胞期与疫苗发展特别相关，因为宿主疟疾的临床和病理特征归因于这一阶段。在间日疟原虫和P.knowlesi中，存在于Duffy阳性红细胞上的Duffy血型决定簇是侵入人红细胞所必需的(Miller et al.，Science 189561-563，(1975)；Miller et al.，N.Engl.J.Med.295302-304，(1976))。在镰状疟原虫中，裂殖子侵入红细胞似乎取决红细胞上血型糖蛋白唾液酸的结合(Miller，et al.，J.Exp.Med.146277-281，(1971)；Pasvol，et al.，Lancet.，ii947-950(1982)；Pasvol，et al.，Nature，27964-66(1982)；Perkins，J.Exp.Med.160788-798(1984))。以猴疟原虫P.knowlesi进行的研究使人们能更清楚地了解侵入过程中发生的多个事件。很可能尽管间日疟原虫和镰状疟原虫分别与Duffy抗原和唾液酸结合，但它们互相间及与P.knowlesi以相同的方式进行侵入。
对于P.knowlesi在侵入过程中，裂殖子首先以裂殖子的任一表面附着于红细胞上，然后重新调整方向以便其顶端与红细胞接触(Dvorak et al.，Science 187748-750(1975)。裂殖子的附着和重新取向在Duffy阳性和Duffy阴性细胞上能同等顺利地进行。然后在裂殖子顶端和Duffy阳性红细胞间形成连接，随后形成液泡，裂殖子进入液泡(Aikawa etal.，J.Cell Biol.7772-82(1978))。在Duffy阴性细胞上不发生连接形成和裂殖子进入红细胞(Miller et al.，J.Exp.Med.149172-184(1979)，认为Duffy决定簇特异性受体与顶端连接形成而不是起始附着有关。
以3种细胞器的存在定义裂殖子的顶端rhopteries，密集颗粒和微丝体。在液泡形成时rhopteries和密集颗粒释放其内含物(Ladda et al.，1969；Aikawa et al.，J.Cell Biol.，7772-82(1978)；Torn et al.，Infection and Immunity 573230-3233(1989)；Bannister and Dluzewski，Blood Cell 16257-292(1990)。到目前为止微丝体的功能尚不清楚。然而，微丝体的位置表明它们与侵入过程有关。Duffy抗原结合蛋白(DABP)和唾液酸结合蛋白(SABP)已分别定位于P.knowlesi和镰状疟原虫的微丝体上(Adams et al.，cell63141-153(1990)；sim et al.，Mol.Biochem.Parasitol.51157-160(1992))。
DABP和SABP是可溶蛋白质，在感染的红细胞释放裂殖子后它们出现在培养物上清液中。免疫化学资料表明DABP和SABP分别是间日疟原虫和镰状疟原虫在红细胞上Duffy和唾液酸受体的配体，在可溶或膜结合形式下具有同样的结合特异性。
DABP是135KDa的蛋白质，它与Duffy血型决定簇特异性地结合(Wertheimer et al.，Exp.Parasitol.69340-350(1989)；Barnwell，et al.，J.Exp.Med.1691795-1805(1989))。因此，DABP与人Duffy阳性红细胞的结合是具有特异性的。人红细胞有4种主要Duffy表型Fy(a)，Fy(b)，Fy(ab)和Fy(阴性)，以抗Fya和抗-Fyb血清来定义(Hadley et al.，In Red Cell A ntigens and Antibodies.G.Garrat-ty，ed.(Arlingten，VaAmerican Association of Blood Banks)PP.17-33(1986)。DABP同等地与Fy(a)和Fy(b)红细胞结合(两类红细胞对间日疟原虫的感染同样敏感)而不与Fy(阴性)红细胞结合。
至于SABP，它是175KDa的蛋白质，与红细胞上血型糖蛋白的唾液酸残基特异性地结合(Camus and Hadley，Science230553-556(1985)；Orlandi，et al.，J.Cell Biol.116901-909(1992))。因此，神经氨酸苷酶处理(裂解唾液酸残基)使红细胞对镰状疟原虫的侵入具有免疫力。
结合的特异性和与疟原虫感染的相关性表明DABP和SABP是间日疟原虫和镰状疟原虫的与唾液酸和红细胞上的Duffy抗原相互作用的蛋白质。编码两种蛋白质的基因已被克隆、已测定了该DNA和预期的蛋白质序列(B.Kim Leesim，et al.，J.Cell Biol.1111877-1884(1990)；Fang.X.，et al.，Mol.Biochem Parasitol，44125-132(1992))。
尽管全世界做出了相当大的研究努力，但由于疟原虫的复杂性和其与宿主的相互作用，还不可能发现用于阻止或抵抗疟疾血液阶段的令人满意的溶液。由于疟疾是一个巨大的世界性健康问题，因此需要抵抗该疾病影响的方法。本发明提供了抗疟原虫属感染的有效的防止和治疗措施。
本发明概述本发明提供了包含分离的DABP结合区多肽和/或分离的SABP结合区多肽的组合物。DABP结合区多肽优选包含在大约200到大约300之间的氨基酸残基，而SABP结合区多肽优选包含在大约200到大约600之间的氨基酸残基。优选的DABP结合区多肽具有SEQ ID NO2中所示的含有

图1所示的蛋白质的半胱氨酸富集部分的大约325个氨基酸残基。优选的SABP结合区多肽具有SEQ ID NO4的含有图1所示的蛋白质的半胱氨酸富集部分的大约616的氨基酸残基。
本发明还包括包含药用学上可接受的载体和以在生物体内足以诱导抗间日疟原虫裂殖子的保护性免疫反应的量的分离的DABP结合区多肽之药用组合物。而且以足以诱导抗镰状疟原虫保护性免疫反应的量的分离的SABP结合区多肽可加入药用组合物中。
还提供了包含药学上可接受的载体和分离的SABP结合区多肽的药用组合物，其中多肽的量是以在生物体内诱导抗镰状疟原虫的保护性免疫反应。另外，分离的DABP结合区多肽能以足以诱导抗间日疟原虫的保护性免疫反应的量加入药用组合物中。
还公开了编码DABP结合区多肽或SABP结合区多肽的分离的多聚核苷酸。另外，本发明包括含有编码DABP结合区多肽的多聚核苷酸的重组细胞。
本发明进一步包括在病人体内诱导抗疟原虫属裂殖子的保护性免疫反应的方法。该方法包括给病人施用免疫上有效量的药用组合物，该组合物包含药学上可接受的载体和分离的DABP结合区多肽，SABP结合区多肽或其组合。
本说明书还提供来自红细胞结合配体(EBL)家族其它镰状疟原虫基因的DNA序列。该家族具有与镰状原虫175KD和间日疟原虫135KD结合蛋白保守的区域。
定义本文所用的“DABP结合区多肽”或“SABP结合区多肽”是分别与来自Duffy抗原结合蛋白(DABP)富含半胱氨酸的氨基末端区域或唾液酸结合蛋白(SABP)的序列基本相同(定义如下)的多肽。该多肽能结合Duffy抗原或血型糖蛋白上的唾液酸残基。特别是DABP结合区多肽由与含有图1所示的蛋白质的半胱氨酸富集部分的SABP结合区内的序列基本相似的氨基酸残基组成。SABP结合区多肽由与含有图1所示的蛋白质的半胱氨酸富集部分的DABP结合区内的序列基本相似的残基组成。
由EBL家族基因编码的结合区多肽由与上面定义的DABP和SABP结合区的序列基本相同的那些残基组成。EBL家族包含与DABP和SABP保守区基本相似的序列。它们包括本文以EBL-e1(SEQ ID Nos 5和6)，E31a(SEQ IDNos 7和8)，EBL-e2(SEQ ID Nos 9和10)和Proj3(SEQ IDNos 11和12)报道的那些序列。
本发明的多肽可由结合区的全长或其片段组成。典型的DABP结合区多肽由以大约50到大约325的残基组成，优选在大约75和300之间，更优选的是在大约100到大约250之间的残基。SABP结合区多肽由从大约50到大约616的残基组成，优选大约75到300之间，更优选的是大约100到大约250之间的残基。
本发明特别优选的多肽是那些位于结合区内的多肽，该结合区在SABP和EBL家族之间保守。这些保守的区域内的残基如下面图1所示。
当进行最大相关性序列对比时，如果两个序列中的核苷酸或氨基酸残基序列相同时两个多聚核苷酸或多肽说成是“相同的”。可用局部同源性公式(Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2487(1981)，同源性排列公式(Needleman andWunsch，J.Mol.Biol.48443(1970))相似性寻找方法(Pearson and Lipman，Proc Natl Acad.Sci(U.S.A)852444(1988)，这些公式计算机化的程序(GAP，BESTFIT，FASTA，and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Packag，Genet-ics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)或经检查来进行序列比较的最佳排列。本文引用这些文献以供参考。
术语“基本上相同”指多肽包含的序列与对照序列相比(通过比较大约20个残基至大约600个残基，典型的是大约50到大约500个残基，通常是大约250到300个残基)具有至少80％的序列相同性，优选90％，更优选的是95％或更多。使用上面程序测定相同百分数的值。本发明特别优选的多肽包含的序列中至少存在在DABP和SABP中保守的半脱氨酸残基的70％。另外，该多肽包含的序列至少有在DABP和SABP保守的色氨酸残基的50％存在。考虑到在DABP，SABP和EBL家族的序列之间发现的那些保守的氨基酸残基，本文还具体定义了术语基本相似。这些保守的氨基酸主要由在本文报道的所有序列中保守的色氨酸和半脱氨酸残基组成。其它保守的氨基酸残基包括苯丙氨酸残基，它可用酪氨酸取代。本领域的技术人员使用上面所列方法进行序列对比后可测定这些氨基酸残基是保守的。
多肽序列基本相同的另一解释是一种蛋白质是否与产生的抗其它蛋白质的抗体发生免疫反应。因此，本发明的多肽包括与产生的抗SABP结合区，DABP结合区或产生的抗EBL家族保守区的抗体发生免疫反应的多肽。
核苷酸序列基本相同的另一解释是2种分子是否在严格条件下互相杂交。严格条件具有序列依赖性并在不同的环境下会有差别。一般来说，严格条件的选择是在限定离子强度和ph下列入下比特定序列的热熔点(Tm)大约约5℃。Tm是50％的靶序完全匹配的探针杂交的温度(在限定的离子强度和ph下)。典型的严格条件是在pH7下盐浓度至少为大约0.02摩尔，温度至少为大约60℃。
短语“分离的”或“生物学纯的”指物质基本上或必须没有在基天然状态下通常与其共存的成份。因此，本发明的结合区多肽不含正常情况下与其原位环境相联的物质，例如，裂殖子膜的其它蛋白质。然而，即使蛋白质经PAGE分离成均质或占优势的带，可能仍有5-10％范围的与所需蛋白质共同纯化的天然蛋白质的微量污染。本发明分离的多肽不含这类内源性共同纯化的蛋白质。
蛋白质的纯度或匀质性可用许多本领域公知的方法来表示，如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，接着经染色进行肉眼观察。对于某些用途需要高分辩率，可使用HPLC或相似的纯化方法。
术语“残基”指以酰胺键或酰胺键类似物掺入寡肽的氨基酸(D或L)或氨基酸类似物。本发明的酰胱键类似物包括本领域的技术人员公知的肽骨架修饰。
附图的简要描述图1显示了DABP结合区(间日疟原虫)，2个同源SABP区(SABP F1和SABP F2)和EBL基因家族测序的成员(eb1-e1，E31a，EBL-e2和三个同源Proj3区)预期氨基酸序列的序列对比。
图2显示PRE4克隆载体的图示。
图3显示了在分离编码本发明保守区的序列中有用的引物。
优选实施例方案的描述裂殖子和裂殖体红细胞的结合是由裂殖子或裂殖体表面的特异性结合蛋白介导的，它对红细胞的感染是必需的。对于镰状疟原虫，这种结合涉及红细胞上唾液酸血型糖蛋白残基与裂殖子或裂殖体表面的唾液酸结合蛋白(SABP)之间特异性的相互作用。纯化的SABP结合具有化学或酶修饰的唾液酸残基的红细胞的能力与镰状疟原虫感染这些红细胞的能力相平行。而且，唾液酸缺陷型红细胞既不结合SABP，也不能被镰状疟原虫感染。还克隆和侧序了编码镰状疟原虫SABP的DNA。
在间日疟原虫中，与红细胞的特异性结合涉及红细胞上Duffy血型抗原与裂殖子上Duffy抗原结合蛋白(DABP)之间的相互作用。Duffy结合蛋白在生物学上定义为感染的红细胞释放裂殖子后在培养物上清液中出现的那些可溶性蛋白质，它与人Duffy阳性红细胞结合，而不与人Duffy阴性红细胞结合。显示了间日疟原虫DABP蛋白质与Duffy阴性红细胞的结合被抗Duffy血型决定簇的抗血清抑制。纯化的Duffy血型抗原也抑制与红细胞的结合。Western印迹也显示DABP与Duffy血型决定簇结合。
人红细胞上的Duffy阳性血型决空簇对间日疟原虫引起的人红细胞的感染是必需的。间日疟原虫裂殖子的附着和重新取向在Duffy阳性和阴性红细胞上同等顺利地发生。然后在裂殖子顶端和Duffy阳性红细胞之间形成联接，接着形成液泡且裂殖子进入液泡。在Duffy阴性细胞上不发生连接的形成和裂殖子进入红细胞，这表明Duffy决定簇特异性的受体与顶端连接的形成而不是与起始附着有关。克隆和侧序了编码间日疟原虫和P.knonlesi DABP的DNA序列。
间日疟原虫的红细胞感染绝对需要Duffy血型抗原。然而，镰状疟原虫分离物的感染对唾液酸的依赖性不同。建立了一些以正常频率感染唾液酸缺陷型红细胞的镰状疟原虫克隆。这表明镰状疟原虫的一些菌株能与红细胞上的其它配体相互作用，因此可能有多种具有不同特异性的红细胞结合蛋白。
本发明的基础是在DABP和SABP上发现了结合区。DABP和SABP预期的蛋白质序列比较揭示了在两种蛋白质之间具有高度相似性，在两种蛋白质中有一个氨基末端富含半胱氨酸的区域。DABP氨基末端的富含半胱氨酸的区域含大约325个氨基酸，而SABP氨基末端的富含半胱氨酸的区域含大约616个氨基酸。这是由于在SABP蛋白质的氨基末端半胱氨酸富集区有明显的重复。在SABP和DABP的2个区域之间半胱氨酸残基周围的氨基酸和许多芳香族氨基酸残基也一样。氨基末端的半胱氨酸富集区和靠近羧基末端的另一半胱氨酸富集区表明在DABP和SABP蛋白质之间最相似。这2个半胱氨酸富集区之间的氨基酸序列区域表明在DABP和SABP之间仅有有限的相似性。
鉴定了其它具有与SABP和DABP结合区基本相同的区域的镰状疟原虫开架阅读框和基因。这些序列在疟原虫基因组中存在多个拷贝表明它们在宿主—疟原虫的相互作用中具有重要活性。从染色体7的亚片段文库中克隆了这些序列的一个家族(EBL家族)，该文库在氯奎抗性基因座的遗传研究中构建(Wellems et.al.，PNAS 883382-3386(1991))。EBL序列的对比鉴定了镰状疟原虫175KD蛋白质中高度保守的区域；这些保守区接着用于鉴定其中之一(eb1-e1)位于染色体13的基因(eb1-e1，eb1-e2)。连锁遗传研究将该基因定位在染色体13影响疟原虫感染人红血细胞的区域上(Wellems et al.，Cell 49633-642(1987))。
使用来自这些开架阅读框的探针进行的Southern杂交实验表明这些保守序列有额外的拷贝位于基因组的其它位置。染色体7上最大的开架阅读框是8千碱基，含4个与SABP和DABP N端半胱氨酸富集单位同源的串联重复。
图1代表EBL家族与DABP结合区和2个SABP同源在(F1和F2)的序列比较。将EBL家族分成2个亚家族以获得最佳序列比较。保守的半胱氨酸残基以黑体字显示，保守的芳香族残基下面划线。
本发明的多肽可用于产生SABP，DABP结合区域EBL基因家族保守区特异性的单克隆抗体。该抗体可用于疟疾感染的诊断或作为治疗试剂抑制裂殖子与红细胞的结合。抗所需抗原的单克隆抗体的生产对本领域的技术人员而言是公知的，在本文不再详细描述。
本领域的技术人员，可得到的用于生产和控制各种免疫球蛋白”和“抗体”，指由一种或多种基本上由免疫球蛋白分子的许多技术可轻易地用来控制结合。本文所用的术语“免疫球蛋白基因编码的多肽组成的蛋白质。除抗体外，免疫球蛋白能以各种形式存在，例如包括Fv，Fab，和F(ab)2以及以单链的形式存在。免疫球蛋白结构和功能的一般知识见基础免疫学(第二版，W.E.Paul编辑，Ravens出版，纽约(1989))。
与本发明的多肽结合的抗体可用各种方法来生产。非人类单克隆抗体(例如鼠、兔形目、马等)的生产是公知的并且可用(例如)以含该多肽的制品免疫动物来完成。使从免疫的动物获得的抗体生产细胞成为永生细胞并进行筛选，或者先筛选以生产控制裂殖子和红细胞结合的抗体，然后使成的永生细胞。单克隆抗体生产一般方法的讨论见Harlow和Lane的《抗体，实验室手册》Cold Spring Harbor出版，纽约(1988)。
因此，本发明能达到保护性免疫反应的目的或得到单克隆抗体以侧序在SABP、DABP和EBL基因家族编码区之间保守的结合区。这些蛋白质结合区的鉴定有助于形成疫苗，因为它使人们得以将精力集中在大分子的功能单元上。从结合区内特定序列优选出在进化中保守的关键区域的目标，于是优选用作抗疟原虫的疫苗。
EBL家族的基因(以前尚来侧序)可用作标记来检测病人中镰状疟原虫的存在。使用症状性病人的组织或血液与EBL家族基因片段互补的寡核酸进行PCR反应，以本领域的实践者熟知的方法可完成这种检测。而且，测序的EBL家族为熟练的实践者提供了生产在各种运用中用作遗传标记的限定的探针的一种方法。
另外，本发明定义了一个存在于(但不限于)参与宿主寄生作用的Apicomplexa亚门其它成员中的保守区。可使用图3所示的合成寡聚核苷酸引物以聚合酶链式反应在疟原虫种类和其它寄生的原生动物中鉴定该区域。PCR方法在下文中详细描述。从DABP，SABP和EBL家族中显示出最高保守程序的保守部位的区域设计这些引物。图3显示了这些区域和来自它们的相一致的氨基酸序列。
A.一般方法本申请中所需的许多命名法和一般实验程序可参见Sambrook等的《分子克隆实验手册》(第2版)(Vo.l 1-3)纽约、冷泉港，冷泉港实验室，1989)，该手册下文称为“Sam-brook等”。
B.分离编码SABP、DABP和EBL结合区的方法本发明的核酸组合物，不论是RNA，cDAN，基因组DNA，还是各种组合的杂种，可从天然来源分离或在体外合成。要求保护的核酸可存在于转化的或转染的完整细胞中，在转化的或转染的细胞的溶胞产物中或以部分纯化或基本上纯的形式存在。
编码本发明结合区的基因的核酸操作技术，如将编码多肽的核酸序列亚克隆到表达载体上，标记探针，DNA杂交和类似操作一般在Sambrook等中已有描述，本文引用以供参考。
可使用重组DNA技术生产结合区多肽。一般来说，首先克隆编码SABP和DABP结合区的DNA或以适合物连热闹到表达载体上的形式分离。连接后，含DNA片段或插入物的载体导入合适的宿主细胞以表达重组结合区。然后从宿主细胞中分离多肽。
有许多方法分离编码SABP，DABP和EBL结合区的DNA序列。典型，使用DNA中序列特异性的标记的寡核苷酸探针从基因组或cDNA文库中分离DNA。限制性核酸内切酶消化含合适基因的基因组DNA或cDNA可用来分离编码这些蛋白质结合区的DNA。由于已知SABP和DABP基因的DNA序列，可设计一组限制性核酸内切酶在所需区域裂解该DNA。限制性核酸内切酶消化后，经过其与核酸探针杂交的能力(例如在Soutern印迹上)来鉴定编码SABP结合区域DABP结合区的DNA，使用本领域的技术人员熟悉的标准方法(见Sambrook，et al)分离这些DNA区域。
也可用聚合酶链式反应制备DABP，SABP和EBL结合区DNA。聚合酶链式反应技术(PCR)用于直接从mRNA，cD-NA基因组文库或cDNA文库中扩增DABP和SABP结合区的核酸序列。对这一方法而言，图3所示的引物是特别优选的。
用于扩增SABP和DABP结合区DNA的合适引物和探针从DNA序列分析中产生。简单地说，合成与所要扩增的DNA区域2个3′端互补的寡核苷酸引物。然后使用这2个引物进行聚合酶链式反应。见PCR Proto colsA Guide toMethods and Appeicarions Innis，M.Gelfand.D.，Sninsky，J.and White.T.，eds.，Academic Press，San Diego(1990)。根据需要，可选择引物来扩增全部DABP区域或扩增DABP和SABP结合区的小片段。
根据Beaucage，S.L和Caruthers.M.H.首先描述的固相phosphoramidite三酯方法(Tetrahedron Letts.，22(20)1859-1862，1981)，使用自动合成仪化学合成用作探针的寡核苷酸，如Needham-VanDevanter，D.R.，et al.1984，NucleicAcids Res.，126159-6168中所述。寡核苷酸的纯化经过天然丙烯酰胺凝胶电泳或经过阴离子交换HPLC完成，如Pearson.J.D.and Regnier.F.E.，1983.J.Chrom.，255137-149中所述。
使用Maxam.A.M和Gilbert的化学降解方法(见W.，Grossman.L.and Moldave，D.，eds.Academic Press，NewYork，Methods in Enzymology，65499-560)可证实合成的寡核苷酸序列。
本领域的技术人员已知的其它方法也可用于分离编码SABP或DABP结合区的全部或部分的DNA。见Sambrook等。
C.DABP.SABP和EBL结合区多肽的表达一旦分离和克隆出结合区DNA，可在重组构建的细胞如细菌、酵母，昆虫(特别是使用杆状病毒载体)和哺乳动物细胞中表达所需的多肽。按期望本领域的技术人员知道许多可用于表达编码DABP和SABP结合区的DNA的表达系统。因此不再详细描述已知的在原核或真核细胞中用于表达蛋白质的各种方法。
作为简要的概述，编码结合区的天然或合成的核酸的表达典型地可经过将DNA或cDNA有效连接到启动子上(启动子可以是结构性的或是诱导性的)，接着掺入表达载体中来实现。载体可适合于在原核生物或真核生物中复制和整合。典型的表达载体含有对调节编码结合区的DNA的表达有用的转录和翻译终止子，起始序列和启动子。为了获得克隆基因的高水平表达，所需构建的表达质粒最少含有一个指导转录的强启动子，一个用于翻译起始的核糖体结合位点和一个转录/翻译终止子。
1.在原核生物中的表达在E.coli中适于该目的的调节区例子是Yanofsky，C.，1984，J.Bacteriol.，1581018-1024中所述的E.coli色氨酸生物合成途径的启动子和操纵子区域和Herskowintz，I.and Hagen，D.，1980，Ann，Rev Genet.，14399-445所述的N噬菌体(PL)的左向启动子。转化进E.coli中的DNA载体包含有选择标记也是有用的。这类标记的例子包括编码氨苄青霉素，四环素或氯霉素抗性的基因。见Sambrook等关于在E.coli中使用的选择标记的详细描述。
载体的选择应使之能导入合适的宿主细胞。细菌载体是典型的质粒或噬菌体来源。用噬菌体载体颗粒感染或用裸露的噬菌体载体DNA转染合适的细菌细胞。如果使用质粒载体，用质粒载体DNA转染细菌细胞。
可使用E.coli.Bacillus sp.(Palva，I et al.，1983，Gene22229-235；Mosbach，K.et al.Nature，302543-545)和沙门氏菌优选E.coli系统。
原核细胞产生的结合区多肽可能不会正确地折叠。在从E.coli中纯化的过程中，表达的多肽可能光变性，然后再复性。这可经过将细菌产生的蛋白质溶于离液剂如盐酸胍中并用还原剂如β-巯基乙醇还原全部半胱氨酸残基来实现。然后经缓慢透折或凝胶过滤使多肽复性。见美国专利号4511503。
表达抗原的检测经过本领域已知的方法如放射免疫试验，Western印迹技术或免疫沉淀法来实现。从E.coli中的纯化可按美国专利号4511503所述的程序进行。
2.SABP，DABP和EBL结合区在真核生物中的合成本领域的技术人员已知各种真核表达系统，如酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞。正如下面所作的简要描述，DABP和SABP结合区也可在这些真核系统中表达。
a.在酵母中的表达异源蛋白质在酵母中的合成是人们所熟知的且有较好的描述。Methods in Yeast Genetics，Sherman，F.，et a1.，Coldspring Harbor Laboratory，(1982)是一部较好的论著，描述了在酵母中生产结合区可用的各种方法。
用于酵母的启动子例子包括GAL.，10(Johnson，M.，and Davies，R.W.，1984，Mol.and Cell，Biol.，41440-1448)ADH2(Russell，D.，et al.1983，J.Biol，Chem.，2582674-2682).PHO5(EMBO J.6675-680，1982)和MFal(Herskowitz，Iand Oshima，Y.，1982 in The Molecular Bi-ology of the Yeast Saccharomyces，(eds，Strathern，J.N.Jones，E.W.，and Broach，J.R.，Cold Spring Harbor Lab.，Cotd Sp[ring Harbor.N.Y.，PP 181-209).也可使用具有选择性标记的多拷贝质粒，如Leu-2，URA-3，Trp-1，和His-3。
许多酵母表达质粒(如YEp6，YEpb，YEp)可用作载体。可将目的基因与各种酵母载体中的任一启动子融合。上述质粒在文献中已做了充分描述(Botstein，et al.，1979，Gene，817-24；Broach，et al.，1979，Gene，8121-133)。
在转化酵母细胞中使用2种方法。在一种情况下，首先使用Zymolyase，溶细胞酶或glusulase将酵母细胞转化为原生质体，接着加入DNA和聚乙二醇(PEG)。然后在选择性条件下在3％的琼脂培养基中再生PEG处理的原生质体。在文章(J.D.Beggs，1978，Nature(London).275104-109；和Hinnen，A.，et al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，751929-1933)中给出了该方法的细节。第二种方法不涉及去掉细胞壁。而是将细胞用氯化锂或乙酸及PEG处理并涂布在选择性培养板上(Ito，H.，et al.，1983.J.Bact.，153163-168)。
经过溶融细胞并对溶胞产物运用标准蛋白质分离技术可以酵母中分离结合区。经过使用Western印迹技术或其它标准免疫测定技术的放免试验可实现对纯化过程的监测。
b.在哺乳动物和昆虫细胞培养物中的表达对生产结合区有用的细胞培养物的例子有昆虫或哺乳动物起源的细胞。哺乳动物细胞系统常以细胞单层的形式使用，尽管也可使用哺乳动物细胞悬液。哺乳动物细胞糸的例子包括VERO和Hela细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系，W138，BHK.Cos-7或MDCK细胞糸。
如上面所述，用于转化宿主细胞的载体(例如质粒)优选含起动转录的DNA序列和控制抗原基因序列翻译的序列。这些序列称为表达控制序列。当宿主细胞是昆虫或哺乳动物起源的细胞时，表达控制序列的例子是得自SV-40启动子(Science，222524-527，1983)，CMV I.E.启动子(Proc.Natl.Acad.Sci.81659-663，1984)或金属硫蛋白启动子(Nature 29639-42，1982)的序列。使用限制性酶裂解含表达控制序列的克隆载体，如果必要或需要的话调节其大小并以本领域熟知的方法与编码SABP或DABP多肽的DNA连接。
与酵母一样，当使用更高等动物的宿主细胞时，需要将已知哺乳动物基因的多聚腺苷化或转录终止子序列掺入载体中。终止子序列的例子是牛生长激素基因的多聚腺苷酸化序列。还应包括对转录子进行精确剪接的序列。剪接序列的例子是SV40的VP1内含子(sprague J.et al.，1983，J.Vi-rol.45773-781)。
另外，可向载体中掺入在宿主细胞中控制复制的基因序列，例如在牛乳头状瘤病毒类型载体中发现的序列(Saveria-Campo.M.，1985，“Bovine Papilloma viras DNA a EudargoticCloning Veitor”in DNA Cloniry Vol.II a praitical Approach Ed.D.M.Glover.IRL Press.Arlington.Virginia pp.213-238)。
为了进行转化，宿主细胞应是感受态或经过各种方法使其成为感受态。有一些熟知的方法诱导DNA进入动物细胞。这些磷酸钙沉淀法，将受体细胞含DNA的细菌原生质体融合，用含DAN的脂质体处理受体细胞，DEAE葡聚糖，电穿孔和将DNA直接显微注射进细胞。
以本领域，已知的方法培养转化的细胞(BiochenicalMethods in Cell Culture and Virologg，Kuchler，R.J.Dowden，Hutchinson and Ross.Inc.(1977)。从以悬液或单层生长的细胞中分离表达的DABP和SABP结合区多肽。对于单层的回收使用熟知的机械，化学或酶方法。
c.在重组牛痘病毒或腺病毒感染的细胞中表达除了在重组表达系统中使用外，分离的结合区DNA序列也可用于转化在病人中的转染宿主细胞的病毒。活的减毒病毒(如牛痘或腺病毒)是疫苗的常规选择，因为它们生产成本低且易于运输和施用。在免疫方法中有用的牛痘载体和方法已有描述，例如美国专利号422848，本文引用以供参考。
用于本发明的合适的病毒包括(但不限于)痘病毒(如金丝雀痘和牛痘病毒)，牛痘病毒，α病毒，腺病毒和其它动物病毒。可使用本领域熟知的方法生产重组病毒，例如使用同源重组或连接工种质粒的方法。例如，重组金丝雀痘或奶牛痘病毒的制备可经过将编码DABP和SABP结合区多肽的DNA插入质粒，使其两端以病毒序列为侧翼。然后通过同源重组将编码结合区的DNA插入病基因组中。
例如，重组腺病毒的生产可经过将各含大约50％病毒序列的2种质粒与编码红细胞结合区多肽的DNA序列连接起来。重组RNA病毒(如α病毒)的制备可使用本领域已知的方法经CDNA介导制备。
到于牛痘病毒(例如WR株)，经过包括同源重组的许多方法，使用转移载体pTKgpt-OFIS可将编码结合区的DNA序列插入基因组中，如Kaslow.et al.，Science 2521310-1313(1991)中所述，本文引用以供参考。
作为选择，编码SABPS和DABP结合区的DNA可插入另一设计的质粒(例如PGS62)中以生产重组中痘(Langford，C.L.，et al.，1980，Mol.Cell.Biol.63191-3199)。这种质粒由用于插入外源基因的克隆位点，指导插入基因合成的痘P7.5启动子和在外源基因两端侧翼的牛痘TK基因组成。
可使用编码DABP和SABP结合区多肽的cDNA经DNA杂交和使用表达结合区多肽特异性的抗体经免疫检测技术来进行重组病毒生产的证实。病毒种子的制备可经过感染细胞(例如HELA S3旋转细胞)并收获病毒子代实现。
本发明的重组病毒可用于哺乳动物(如小鼠或人类)中诱导抗-SABP和抗-DABP结合区抗体。另外，可经过体外感染宿主细胞，该宿主细胞随后表达多肽来将重组病毒用于生产SABP和DABP结合区(见上面SABP和DABP结合区在真核细胞中的表达部分)。
本发明还涉及用重组病毒感染的宿主细胞。本发明的宿主细胞优选哺乳动物，如BSC-1细胞。以重组病毒感染的宿主细胞在其细胞表面表达DABP和SABP结合区。另外，当用于接种或加强预先接种的哺乳动物时，感染细胞的膜提取物诱导保护性抗体。
D.SABP，DABP和EBL结合区多肽的纯化重组DNA技术产生的结合区多肽可使用本领域的技术人员熟知的标准技术来纯化。重组产生的结合区多肽可直接表达或以融合蛋白质的形式表达。然后将细胞溶合(例如声处理)和亲合色谱结合使用来纯化蛋白质。对于融全产物，随后用合适的蛋白裂解酶消化融合蛋白以释放所需的SABP和DABP结合区。
本发明的多肽可用本领域熟知的标准技术纯化成基本纯的产品，这些技术包括用诸如硫酸铵的物质进行选择性沉淀，柱色谱免疫纯化方法和其它方法。例如，见R.Scopes.Pro-tein PurifieationPrinciples and Practice，Springer-VelagNewYork(1982)，本文引用以供参考。
E.以蛋白质化学技术生产结合区可用大量各种各样的方法结合成制备本发明的多肽。例如大小相当短的多肽可按常规技术在溶液中或在固体支持物上合成。各种自动合成仪可以商品的形式买到并根据已知的方法使用，例如见Stewart and Young，Solid Pharse PeptideSynthesis，2d.ed.，Pierce Chemical Co.(1984)。
作为选择，可蛋白裂解酶处理纯化的和分离的SABP，DABP或EBL家族蛋白质以生产结合区多肽。例如，重组DABP和SABP蛋白质可用于该目的。然后可分析DABP和SABP蛋白质的序列以选择蛋白裂解酶，用于生产含DABP和SABP结合区的所需区域的多肽。然后经过使用蛋白质和肽纯化的标准技术纯化所需多肽。至于标准技术，可见Meth-ods in Enzymology，″Guide to Protein Purification″M.Deutscher，ed.Vol.182(1990)，Page619-626，本文引用以供参考。
F.核酸和多肽序列的修饰用于转染宿主细胞以生产重组结合区多肽的核苷酸序列可标准技术进行修饰以产生是有各种所需特征的结合区多肽。本发明的结合区多肽经使用本领域的技术人员熟知的各种重组DNA技术可较容易的设计和生产。例如可以氨基酸插入，取代，缺失和类似技术从天然存在的序列在一级结构水平上改变结合区多肽。可使用这些修饰的许多组合以生产最终的修饰的蛋白质链。
可据各种主观目的制备氨基酸序列的变异体，包括利于纯化和制备的重组多肽。修饰的多肽对于改变血桨半衰期，提高治疗效力和降低治疗使用中副作用的严重性或发生率也是有用的。氨基酸序列变异体通常是预先确定的变异体，它在自然是中不存在但与天然存在的多肽表现出相同的免疫活性。例如，可生产仅包含一级结构一部分(通常是至少大约60-80％，典型的是90-95％)的多肽片段。为用作疫苗，典型的多肽片段的长度应优选至少保留一个能诱导封闭抗体生产的抗原决定基。
一般来说编码结合区多肽序列的修饰应以各种熟知的技术易于完成，如用定点突变技术(见.Giliman and Smith，Gene 881-97(1979)and Roberts.S.et al.，Nature 328；731-734(1987))。一个普通技术人员将感到许多突变的效果难以预料。因此大多数修饰在争对所需特征的合适试验中经常规筛选来评价。例如，多肽免疫特征的改变可用合适的竞争性结合试验来检测。其它特征的修饰，如氧化还原或热稳定性，疏水性，对蛋白裂解的敏感性或凝集倾向性都可根据标准技术来测定。
G.诊断和筛选试验本发明的多肽可用于在生物样品中裂殖子检测的诊断学应用。使用一些较好识别的以免疫结果为基础的特异性结合试验可检测寄生物的存在(见美国专利436624143761104517288和4837168，本文引用以供参考)。例如，抗本发明多肽的标记的单克隆抗体可用于检测生物学样品中的裂殖子。作为选择，本发明标记的多肽可用于检测生物学样品中抗SABP或DABP抗体的存在。至于诊断性免疫试验中的一般方法，也见Basic and Clinical Immunology tth Edition(CD.Sti es and A.Terr edy)1991，本文引用以供参考。
另外，修饰的多肽，抗体或其它能抑制SABP或DABP与红细胞间相互作用的化合物可测定生物活性。例如，多肽可在细胞表面以重组形式进行表达且可按下面所述测定细胞结合红细胞的能力。作为选择，可试验肽或抗体抑制红细胞与裂殖子或SABP和DABP之间的结合的能力。
也可使用无细胞试验测定DABP和SABP多肽与分离的Duffy抗原或血型糖蛋白多肽的结合。例如，红细胞蛋白质可被固着于固体表面并可测定标记的SABP或DABP多肽的结合。
许多试验方法使用标记的试验成份。标记系统可以是各种形式。可根据本领域熟知的方法将标记物与试验所需的成份直接或间接偶联。可使用大范围的各种标记物。成份可用一些方法中的任意一种进行标记。最常用的检测方法是使用对3H，125I，35S，14C或32P标记的成份或类似物进行放射自显影。非放射活性标记包括与标记的抗体，荧光团，化学发光剂，酶和能用作标记配体的特异性结合对成员的抗体相结合的配体。标记的选择取决于所需的灵敏性，与化合物连接的容易程度，稳定性需要和可得到的仪器。
另外，本发明的多肽可使用本领域的技术人员熟知的动物模型来试验。用于镰状疟原虫的体内模型包括Aotus sp。猴或黑猩猩；用于间日疟原虫的体内模型Saimiri猴。
H.含有结合区多肽的药用组合物本发明的多肽在治疗疟疾的治疗学和预防学应用中有用。本发明的药用组合物适用于各种药品传递系统。用于本发明的合适配方见Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，PA，17th ed.(1985)，本文引用以供参考。至于药品传递方法的简要描述见Langer，Science 2491527-1533(1990)，本文引用以供参考。
本发明的多肽可以药用和疫苗组合物使用，它们在治疗哺乳动物，特别是人类中是有用的。多肽可在某些情况下一起施用(例如在很可能同时被镰状疟原虫和间日疟原虫感染的情况下)。因此，单个药用组合物就可用于或预防由两种疟原虫引起的疟疾。
组合物适用于一次施用或系列地施用。当以系列给药时，在起始用药后依次进行接种以加强免疫反应，典型地称为加强接种。
本发明的药用组合物打算用于肠胃外，局部，口服或定点用药。优选的是药用组合物经肠胃外施用，例如经静脉内，皮下，皮内或肌肉内用药。因此，本发明提供的经肠胃外施用的组合物包含上述试剂溶于或悬浮于一种可接受的载体(优选一种含水载体)中的溶液。可使用各种含水载体，例如，水，缓冲水，0.4％盐水，0.3％甘氨酸，透明质酸和类似物。这些组合物可用常规熟知的灭菌技术来灭菌或可过滤灭菌。所得水溶液可包装备用或经冻干。施用前将冻干制品与无溶液混合。按照挖近似生理条件的需要组合物可含药用上可接受的辅助物质，如pH调节和缓冲剂，张力调节剂，润湿剂和类似物。例如醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、山梨聚糖单月桂酸酯，三乙醇胺油酸酯等。
至于固态组合物，可使用常规无毒固态载体，例如包括药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁和类似物。对于口服用药，药用上可接受的无毒组合物经掺入任意一种通常使用的赋形剂(如前面列出的那些载体)和通常10-95％的活性成份(更优选25％-75％的浓度)来形成。
对于以烟雾剂进行的用药，优选使用以细小的分离形式与表面活性剂和推进剂一起的多肽。当然，表面活性剂必须是无毒的并优选可溶于推进剂。这种试剂的代表是酯或部分含6到22个碳原子的脂肪酸酯，如己酸、辛酸、月桂酸、软脂酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、olesteric和油酸的脂肪族多羟基醇酯或其环酐。可使用混合的酯，如混合的或天然的甘油酯。如果需要，也可包括一种载体，例如以鼻内用药时可含卵磷脂。
在一些实施例中，可用SABP或DABP多肽或其它特异性抑制(例如单克隆抗体)治疗疟疾病人以阻止疟原虫属裂殖子和裂殖体与红细胞表面的结合。
病人用药量的范围取决于施用何种药物，病人的状态和用药方式。在治疗应用中，给已患有疟疾的病人施用的组合物的量应足以抑制疟原虫通过红细胞的传播并因此治愈或至少部分控制该疾病和其并发症的症状。是以实现该目的的量定义为“治疗有效量”。对这一用途有效的量取决于疾病的严重性和病人的体重和一般状态。但一般范围是每天大约1mg到大约5gm，对于70kg的病人，优选大约100mg。
作为选择，本发明的多肽可在预防上用作疫苗。本发明的疫苗含作为有效成份的免疫有效量的结合区多肽或本文所述的重组病毒。免疫应答可包括抗体的产生，抗存在来自本发明SABP、DABP或EBL序列编码肽的多肽的细胞之细胞毒T淋巴细胞(CFL)的激活，或本领域已知的其它机制。例如见Paul Funp damental Immunology Second Edition Pub-lished by Roven press New York(本文引用以供参考)关于免疫应答的描述。有用的载体是本领域所熟知的，例如它们包括甲状腺球蛋白，诸如人血清白蛋白的白蛋白，破伤风类毒素。多聚氨基酸如聚(D-赖氨酸D-谷氨酸)，流感、肝炎B病毒核心蛋白质，肝炎B病毒重组疫苗。疫苗也可含有生理耐受性(可接受的)稀释剂，如水，磷酸盐缓冲液，或盐水，典型地还含有佐剂。诸如不完全Freund氏佐剂，磷酸铝，氢氧化铝，或明矾的佐剂是本领域熟知的物质。
编码SABP或DABP结合区和EBL基因家族基序的DNA或RNA可导入病人以获得对核酸编码的多肽的免疫应答。Wolff et，al.，Science2471465-1468(1990)(本文引用以供参考)描述了核酸在引起该核酸编码的基因表达中的使用。
含本发明的多肽，核酸或病毒的疫苗组合物施用给病人以诱导抗该多肽的保护性免疫应答。“保护性免疫应答”指阻止或抑制疟原虫通过红细胞的扩散，从而至少部分阻止该疾病和其并发疟的症状。是以达到这一目的的量定义的“免疫有效剂量”。在这一用途中有效的量取决于所用的组合物，用药方式，病人的体重和一般健康状态，以及处方医生的判断。对于多肽组合物，开始免疫的一般范围(治疗或预防用药)用于70kg的病人是从大约10μg到大约1gm的多肽，随后的加强剂量按照从几周到几月(取决于病人的反应和状态，例如，经测量病人血液中的疟原虫水平)的加强方式从大约100μg到大约1gm的多肽。对于核酸，典型地将30-1000μg的核酸注射入70kg的病人，更典型地将大约50-150μg的核酸注射入70kg的病人，接着如果合适就注射加强剂量。
下面以说明的方式而不是限制的方式提供实施例。
实施例作为红细胞结合区的SABP和DABP氨基末端，半脱氨酸富集区的鉴定1.SABP结合区多肽在Cos细胞表面的表达为了证实SABP蛋白质的氨基末端，半胱氨酸富集区是唾液酸结合区，在哺乳动物Cos细胞表面体外表达蛋白质的这一区域。这一DNA序列是SABP DNA序列(SEQ ID No3)上从位置1到位置1848。聚合酶链式反应技术(PCR)用于直接从克隆基因中扩增SABP DNA的这一区域。
将与Pvu II或Apa I的限制性内切酶位点相对应的序列掺入用于PCR扩增的寡核苻酸序列中以利于将PCR扩增区域插入pRE4载体中(见下面)。合成特异性的寡核苷酸5′-ATCGATCAGCTGGGAAGAAATACTTCATCT-3′。这些寡核甘酸用作PCR扩增编码SABP蛋白半胱氨酸富集的氨基末端区的DNA序列区的引物。
PCR条件以Saiki，et al.，Science239487-491(1988)描述的标准为基础。从经过剪接并以单个开架阅读框片段再克隆的编码SABP的基因克隆片段提供模板DNA。
用于在Cos细胞中表达的载体pRE4如图1所示。该载体有一个SV40复制起，一个氨苄青霉素抗性标记和在Rous肉瘤病毒长末端重复(RSV LTR)下游克隆的单纯疱疹病毒糖蛋白D基因(HSV glyd)。使用HSV glyd上的Pvu II和ApaI位点切除HSV glyd基因的部分细胞外区域。
如上面所述，PCR寡核苷酸引物含Pvu II或Apa I限制性位点，用限制性酶Pvu II和Apa I消化上面得到的PCR扩增的DNA片段并克隆到载体pRE4的Pvu II和Apa I位点上。设计这些构建体来表达以在N末端与HSV glyd信号序列及在C末端与HSV glyd跨膜和胞质区嵌合的蛋白质形式出现的SABP蛋白质区域。HSV glyd信号区将这些嵌合蛋白质定位于Cos细胞表面，HSV glyd跨膜片段将这些嵌合蛋白质锚着于Cos细胞表面。
根据标准技术以磷酸钙沉淀法用含PCR扩增的SABPDNA区域的pRE4构建体转染哺乳动物Cos细胞。
2.DABP结合区多肽在Cos细胞表面的表达为了证实DABP蛋白质的氨基末端半胱氨酸富集区是结合区，在Cos细胞表面表达这一区域。首先从位置1-975经PCR扩增DNA序列的这一区域(SEQ ID NO.1)。
将与Pvu II和Apa I的限制性核酸内切酶位点相对应的序列掺入用于PCR扩增的寡核苷酸探针中。以利于随后将扩增的DNA插入pRE4载体中，如上所述。合成寡核苷酸5′-TCTCGTCAGCTGACGATCTCTAGTGCTATT-3′和5′-ACGAGTGGGCCCTGTCACAACTTCCTGAGT-3′。这些寡核苷酸用作引物，使用与上面所述相同的条件直接从克隆的DABP基因中扩增编码DABP蛋白质半胱氨酸富集的氨基末端区的DABP DNA序列区域。
也使用与上面在Cos细胞表达SABP区域部分中所述相同的pRE4载体作为DABP DNA区域的载体。
3.与红细胞的结合试验为了证实它们与人红细胞结合的能力，将转染的表达DABP和SABP结合区的Cos细胞与红细胞在培养基(DMEM/10％FBS)中37℃下培养2小时。用磷酸盐缓冲液洗涤5次去掉未附着的红细胞用光学显微镜观察结合的细细胞。在其表面表达氨基末端半胱氨酸富集的SABP多肽的Cos细胞与未处理的人红细胞结合，但不与神经氨酸苷酶处理的红细胞(即在其表面缺乏唾液酸残基，资料未显示)结合。在其表面表达SABP蛋白质其它区域的Cos细胞不结合人红细胞(资料未显示)。这些结果将SABP的氨基末端半胱氨酸富集区鉴定为红细胞结合区，表明表达这些区域的Cos细胞与人红细胞的结合是特异性的。而且，表达区与红细胞的结合与在结合红细胞方面可信的SABP-175分子所见的结合方式相同。
同样地，在其表面表达DABP氨基末端半胱氨酸富集区的Cos细胞结合Duffy阳性人红细胞，但不结合Duffy阴性人红细胞(即缺乏Duffy血型抗原的红细胞，资料未显示)。在其表面表达DABP蛋白质其它区域的Cos细胞不结合人红细胞(资料未显示)。这些结果将DABP氨基末端半胱氨酸富集区鉴定为红细胞结合区并表明Cos细胞的结合是特异性的。
序列描述(1)一般资料(I)申请人(A)名称美国，国有健康与人类服务部(B)街道6011 Executive Blvd.，Suite 325(C)城市Rockville(D)州马里兰(E)国家美国(F)邮编20852(G)电话(301)496-7056(H)电传(301)402-0220(I)电信(II)发明题目间日疟原虫和镰状疟原虫红细胞结合蛋白的结合区(III)序列数16(IV)计算机可读形式(A)媒体类型Floppy盘(B)计算机IBM PC兼容性(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patent In Realease #1.0，Version #1.25(V)最近申请资料(A)申请号PCT/US94/10230(B)申请日1994年9月7日(C)分类(VI)优先权申请资料(A)申请号US 08/119,677(B)申请日1993年9月10日(2)SEQ ID NO1资料(I)序列特征(A)长度4084碱基对(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线型(II)分子类型DNA(基因组)(III)假定非(VI)原始来源(A)生物间日疟原虫(XI)序列描述SEQ ID NO1AAGCTTTTAA AAATAGCAAC AAAATTTCGA AACATTGCCA CAAAAATTTT ATGTTTTACA 60TATATTTAGA TTCATACAAT TTAGGTGTAC CCTGTTTTTT GATATATGCG CTTAAATTTT120TTTTTCGCTC ATATGTTTAG TTATATGTGT AGAACAACTT GCTGAATAAA TTACGTACAC180TTTCTGTTCT GAATAATATT ACCACATACA TTTAATTTTA AATACTATGA AAGGAAAAAA240CCGCTCTTTA TTTGTTCTCC TAGTTTTATT ATTGTTACAC AAGGTATCAT ATAAGGATGA300TTTTTCTATC ACACTAATAA ATTATCATGA AGGAAAAAAA TATTTAATTA TACTAAAAAG360AAAATTAGAA AAAGCTAATA ATCGTGATGT TTGCAATTTT TTTCTTCATT TCTCTCAGGT420AAATAATGTA TTATTAGAAC 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ATCGATCAGC TGGGAAGAAA TACTTCATCT(2)SEQ ID NO14资料(I)序列特征(A)长度30对碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(II)分子类型DNA(基因组)(III)假定的非(IV)反义无(V)片段类型(VI)原始来源(XI)序列描述SEQ ID NO14ATCGATGGGC CCCGAAGTTT GTTCATTATT(2)SEQ ID NO15资料(I)序列特征(A)长度30对碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(II)分子类型DNA(基因组)(III)假定的非(IV)反义无(V)片段类型(VI)原始来源(XI)序列描述SEQ ID NO15TCTCGTCAGC TGACGATCTC TAGTGCTATT(2)SEQ ID NO16资料(I)序列特征(A)长度30对碱基(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑线性(II)分子类型DNA(基因组)(III)假定的非(IV)反义无(V)片段类型(VI)原始来源(XI)序列描述SEQ ID NO16ACGAGTGGGC CCTGTCACAA CTTCCTGAGT
权利要求
1.一种源自镰状疟原虫唾液酸结合蛋白(SABP)的分离的结合区多肽，其中所述的结合区多肽至少含有图1中定义的所述的SABP中开始于SEQ ID NO4中的大约第158位残基的半胱氨酸富集区的一部分，或者其中含有用GAP，BESTFIT，FASTA或TFASTA在使用默认参数下确定其中至少存在SEQ ID NO4所含半胱氨酸残基的70％的序列的一部分，所述的结合区多肽含有的氨基酸在约50个到约616个之间。
2.权利要求1的结合区多肽，其中SABP结合区多肽含大约200到大约600之间的氨基酸残基。
3.权利要求1的结合区多肽，其中SABP结合区多肽具有大约616的氨基酸残基。
4.权利要求1的结合区多肽，其中SABP结合区多肽含有图1所示的开始于SEQ ID NO4的大约第158位残基的SABP F1序列。
5.权利要求1的结合区多肽，其中SABP结合区多肽含有图1所示的开始于SEQ ID NO4的大约第462位残基的SABP F2序列。
6.权利要求1的结合区多肽，其中SABP结合区多肽是重组产生的。
7.一种药物用组合物，包含药学上可接受的载体和权利要求1的结合区多肽，其用途是在人体或动物体内诱导抗疟原虫属裂殖子的保护性免疫反应。
8.权利要求7的药物用组合物在人体或动物体内诱导抗疟原虫属裂殖子的保护性免疫反应上的用途。
9.一种包含分离的编码权利要求1的SABP结合区多肽的多核苷酸。
10.一种含有权利要求9的多核苷酸的重组细胞。
全文摘要
本发明提供了在治疗和阻止由镰状疟原虫或间日疟原虫引起的疟疾中有用的分离的多肽。特别是来自EBL家族中的蛋白质的结合区以及镰状疟原虫裂殖子上唾液酸结合蛋白(SABP)的多肽。也可以是来自间日疟原虫裂殖子上Duffy抗原结合蛋白(DABP)的多肽。
文档编号C12N15/09GK1414018SQ02131950
公开日2003年4月30日 申请日期2002年9月5日 优先权日1993年9月10日
发明者吉里·辛, 切坦·切特尼斯, 路易斯·H·米勒, 戴维·S·彼特森, 星专·苏, 托马斯·E·威廉姆斯 申请人:美国国有健康与人类服务部