专利名称：妙可来素蛋白质及其基因的制作方法
技术领域：
本发明系关于一种妙可来素(mucroslysin)蛋白质及其基因，及制造该蛋白质之载体及宿主细胞。
背景技术：
血栓形成是一种在血管内形成血块的过程，可引起组织伤害，如未及时处理，甚至会造成死亡。血栓之形成与血小板之凝集反应有关。血小板与受伤血管的内皮细胞表面及其它血小板间的交互作用是造成血栓的主要因子。血栓一旦形成可能会引起血管部分或全部之闭塞，导致许多严重的心血管并发症，包括心绞痛、急性心肌梗塞、脑血管栓塞(中风)、孕妇肺栓塞、深静脉血栓及动脉血栓等，其中心肌梗塞及中风是引起死亡的主要原因之一。
现已有许多消除血块的药物，如尿激酶(urokinase)、链球菌激酶(streptokinase)、阿司匹林(aspirin)及重组组织纤溶酶原激活物(recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA)、双嘧胺醇(dipyridamole)及肝素。这些药物并无法直接溶解血块，而系藉由激活患者体内纤溶酶原产生内生性纤溶酶(plasmin)用以消除分解已经产生的血块。然而，上述药物均具有引起持续出血的潜在副作用。此等药物的缺点在于血栓患者的体内为了对抗持续不断产生的血栓块而耗尽血液循环中的纤溶酶原，而此时患者肝脏组织所制造出新的纤溶酶原又无法及时补充，使形成血栓块的动态机制失去平衡，患者之血栓区更因此而持续扩大、恶化。医护人员则是使用更大剂量这类型的药物，想利用它仅剩的抑制血小板凝集的作用来扳回或减缓血栓块的形成和继续堆积，结果不但无助于溶血栓及缩小血栓区，反而产生出血不止的副作用。例如，rt-PA是目前治疗急性缺血性中风及急性心肌梗塞(AMI)的最佳选择，但是rt-PA之作用缓慢且具严重之出血副作用，其治疗仅限于中风开始之3小时内使用，且无法治疗具抗溶性血栓(lytic-resistant thrombi)之患者(Huang，T.C.，Jordan，R.E.，Hantgan，R.R.及Alevriadou，B.R.(2001)Thromb.Res.102，411-425)。rt-PA并非直接溶解血栓，而系活化纤溶酶(plasmin)并藉由一全程(de novo)组织纤溶酶原活化路径以裂解血栓。在病患罹患闭塞性血栓时，此作用机制通常变差。其它临床上使用之治疗剂，如尿激酶及链球菌激酶，则具低管道再通率(recanalization rate)及副作用(如全身性溶解状态及出血并发症)(Mueller，H.S.，Roberts，R.，Teichman，S.L.及Sobel，B.E.(1989)Med.Clin.North Am.73，387-407)等缺点。因此，目前迫切需要有效溶解血栓且无副作用的溶血栓剂。
已知毒蛇之毒液中具有多种可影响血液凝结之蛋白酶。例如，自蛇毒液分离之三弗芬(triflavin)及三格明(trigramin)酶具有抗凝结活性(Cercek，B.，Lew，A.S.，Hod，H.，Yano，J.，Lewis，B.，Reddy，K.N.及Ganz，W.(1987)Thromb.Res.47，417-426)。纤维蛋白原分解酶及纤维蛋白分解酶呈现抗凝结活性，故具有作为血栓溶解剂之潜力(Trikha，M.，Schmitmeier，S.及Markland，F.S.(1994)Toxicon 32，1521-1531)。许多已被分离出之这类酶为含锌之金属蛋白酶；除抗凝结活性外，亦具出血活性。因此，此类酶并不适合于临床应用。目前已有少数非出血性金属蛋白酶已自蛇毒液分离，如纤维酶(fibrolase)、H2-蛋白酶(H2-proteinase)、拉贝酶(lebetase)及血纤维蛋白原酶(vipera lebetina fibrinogenase，VIF) (Sanchez，E.F.，Bush，L.R.，Swenson，S.及Markland，F.S.(1997)Thromb.Res.87，289-302；Takeya，H.，Arakawa，M.，Miyata，T.，Iwanaga，S.，及Omori-Satoh，T.(1989)J.Biochem.(Tokyo)106，151-157；Trummal，K.，Vija，H.，Subbi，J.及Siigur，J.(2000)Biochim.Biophys.Acta 1476，331-336；及Gasmi，A.，Chabchoub，A.，Guermazi，S.，Karoui，H.，Elayeb，M.及Dellagi，K.(1997)Thromb.Res.86，233-242.)。然而，此等蛋白质难以自毒液之出血性同功酶中分离出来，而无法在临床上大量使用。此外，该等蛋白质需要至少90分钟才可将血栓溶解。目前已有利用遗传工程之方法制造之毒液蛋白质，如MT-C、MT-d-I及MT-d-II等，均可在体外实验中表现分解胶原(collagenolytic)及分解明胶(gelatinolytic)的活性(Jeon，O.H.及Kim，D.S.(1999a)Biochem.Mol.Biol.Int.47，417-425；and Jeon，O.H，及Kim，D.S.(1999b)Eur.J.Biochem.263，526-533)。
发明内容
本发明涉及一种新的妙可来素(mucroslysin)蛋白质，包含如SEQ ID NO1所示之氨基酸序列，及其具溶血栓功能之相等物。
本发明亦关于一种核酸分子，包含编码具SEQ ID NO1所示妙可来素蛋白质氨基酸序列之核酸序列。
本发明亦关于一种包含本发明核酸序列之表达载体及包含本发明载体之宿主细胞。
本发明又关于一种制造本发明蛋白质之方法，包含将包含有本发明核酸分子之宿主细胞，于可容许由该核酸分子编码之蛋白质表达之条件下培养；及自该宿主细胞培养液中回收该蛋白质。
本发明又关于一种药物组合物，包含本发明之妙可来素蛋白质。
图1为本发明之重组DNA序列，及依妙可来素之cDNA序列推导之氨基酸序列。顶线为2139bp之cDNA之核苷酸序列；底线为依cDNA序列推导之氨基酸序列。核苷酸及氨基酸之序号标于右侧。氨基酸系以单一字母记号标记。氨基酸序列下的直线表示可能之信号肽(signal peptide)。Kozak序列aaaATGA及聚腺苷酸化信号AATAAA均以方框表示。在酶原区域、锌离子结合区域及RGD共有区域之保守序列系以划底线之方式表示。箭号所示之处为GSP5b及GST3b引物。
图2为妙可来素之组织专一性转录分析。Northern印迹法是以[32P]标记之妙可来素cDNA作为探针。本实验中每一行所用分离自龟壳花不同组织之总RNA均为10微克。1毒腺；2脑；3肺；4睾丸；5肝；6心。图底部系以[32P]标记的18S核糖体RNA作为探针之相同印迹图。
图3为产生自妙可来素之cDNA之重组妙可来素的tricine SDS-PAGE及免疫分析印迹图。(A)以具Coomassie蓝之10％tricineSDS-PAGE分析之妙可来素蛋白质分布图；及(B)纯化自His-结合树脂之重组妙可来素之Western印迹法分析图。Western印迹法以稀释5000倍之抗血清分析。箭号所示为表现之妙可来素蛋白质。1蛋白质分子量标记(9-115kDa)；2pET21a(I)，系以IPTG诱导之载体对照；3pMucroslysin；及4pMucroslysin(I)为His-bind纯化之重组妙可来素蛋白质，分别以IPTG诱导(2小时)或不以IPTG诱导。
图4为再折叠后之妙可来素蛋白质之纤维蛋白原溶解活性与时间的关系。蛋白质分解活性之分析系利用10微克牛纤维蛋白原与再折叠蛋白质共同培养来检视。培养时间表示于图上方，而裂解模式系以10％SDS-PAGE来分析。纤维蛋白原之Aα-、Bβ-及γ-链表示于右侧。蛋白质分子量标记表示于左侧(20-182kDa)。
图5为体内妙可来素对人工血栓之血栓溶解分析。人工血栓系于经麻醉大鼠之尾下腔静脉利用牛纤维蛋白原及血栓诱导而成。血栓溶解系使用血管造影术纪录2小时。(A)显示血栓诱导后之血管照片。在开始时(0时)，人工血栓完全阻塞动脉血流。箭号所示处为血栓及后侧血液之接口。(B)注射每公斤体重1.0毫克(1.0毫克/公斤体重)妙可来素蛋白质后之血管照片。箭号表示再通管之区域。
具体实施例方式
本发明提供一种妙可来素(mucroslysin)蛋白质及其基因，及制造该蛋白质之载体及宿主细胞。本发明自龟壳花(Trimeresurusmucrosquamatus)克隆及表现非出血性溶血栓蛇毒液蛋白质，并再现该蛋白质之生物功能活性。该遗传工程之蛇毒液蛋白质称为妙可来素，可在短时间内(如15分钟内)呈现有效的溶血栓作用且无出血副作用。蛋白质本发明系关于一种妙可来素(mucroslysin)蛋白质，包含如SEQID NO1(如图1)所示之氨基酸序列，及具溶血栓功能之相等物。如本文所使用，语词″溶血栓功能之相等物″为一具有与本发明妙可来素蛋白质之溶血栓功能相同之蛋白质。根据本发明，本发明妙可来素蛋白质具有溶解纤维蛋白原之活性。
根据本发明，克隆出具血栓活性之52kDa蛋白质，该蛋白质与串妙辛(trimucin)具高度同源性，且系分离自相同品种之蛇。本发明蛋白质为含金属蛋白质，其包括一酶原前区域(zymogenprodomain)、一蛋白酶区域及一disinterin区域。信号肽由18个保守氨基酸组成而酶原序列由171个保守氨基酸组成。一高度保守性序列PKMCGVT系位于接近酶原区域之终端。蛋白酶区域包含203个氨基酸残基，其中包括7个半胱氨酸残基，而其中6个半胱氨酸残基涉及链内双硫键。与其它蛇毒液金属蛋白酶类似，妙可来素之活化位置保守性氨基酸序列HEXXHXXGXXH发现于蛋白酶区域中。然而，妙可来素之金属蛋白酶区域并没有N-糖基化位置。该缺乏N-糖基化位置可能与蛇毒金属蛋白酶之非出血性特性有关(Nikai，T.，Taniguchi，K.，Komori，Y.，Masuda，K.，Fox，J.W.及Sugihara，H.(2000)Arch.Biochem.Biophys.378，6-15)。蛋白酶区域之后为一16个氨基酸之区域，其连接至蛋白质的第二个区域，即蛋白质的disintegrin区域。
根据本发明，重组蛋白质之制备系在可容许该蛋白质表达之条件下，培养包含编码本发明蛋白质之核酸分子之宿主细胞及回收该蛋白质，及视需要再折叠该蛋白质。
根据本发明，在一些表达系统表达之蛋白质，如细菌表达系统，将失去其生物活性。因此，要恢复本发明蛋白质的生物活性蛋白质之去折叠(unfolding)及再折叠(refolding)之过程是必需的。本发明蛋白质之序列中有22个半胱氨酸残基，最多可形成11个分子内双硫键。此等双硫键可使该蛋白质难以成功地再折叠。然而，本发明可成功地再折叠妙可来素蛋白质。根据本发明，该再折叠系在包含金属离子(例如，锌及钙离子)之氨基酸(例如，谷胱甘肽)之缓冲系统中进行。核酸本发明提供一种分离核酸分子，包含编码具SEQ ID NO1(见图1)所示妙可来素蛋白质氨基酸序列之核酸序列(即妙可来素蛋白质之基因序列)。本文所使用之语词″核酸分子″意指包括DNA分子(如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(如mRNA)、使用核苷同类物所产生的DNA或RNA同类物及其衍生物、片段及同源物。核酸分子可为单链或双链，但以双链DNA较佳。本文所使用之语词″分离核酸″分子意为分离自存于天然来源之其它核酸者。
根据本发明，核酸可仅包含编码妙可来素生物活性之部分片段。本文所使用之语词″片段″意指编码仍具生物活性之妙可来素蛋白质片段之核苷酸序列部分。
根据本发明之一较佳具体实施例中，本发明分离核酸分子具有SEQ ID NO2之核苷酸序列(见图1)或其简并序列(摆动假说，Wobble hypothesis)。在另一较佳具体实施例，本发明分离核酸分子包括如SEQ ID NO2所示之核苷酸序列。如本领域技术人员所认同者，基于基因密码的简并性(摆动假说)，可制得许多编码本发明妙可来素蛋白质之核酸。因此，针对一已被鉴定之特定氨基酸序列，本领域技术人员可在不改变妙可来素蛋白质之氨基酸序列之情况下，藉简单修饰一或多个密码而制出各种不同核酸。
根据本发明，编码妙可来素之核酸可使用标准杂交及克隆技术来分离。特别地，本发明核酸可使用标准克隆及筛选技术，自龟壳花毒液之cDNA库分离出来。本发明核酸之扩增(amplification)可根据标准PCR扩增技术，使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板及适当的寡核苷酸引物而得。经扩增之核酸可克隆至适当载体并藉DNA序列分析来鉴定。特别地，龟壳花毒液之cDNA文库系构筑于一适当的表达载体，如λgt11。妙可来素cDNA系藉筛选重组克隆株而分离，所得之核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，大小为2139bp，具有起始自核苷酸位置96及终止于位置1541之终止密码(TAA)之开放阅读框。表达载体及宿主系统本发明亦提供一表达载体，包含一编码如SEQ ID NO1所示之妙可来素核酸序列。在一本发明之较佳具体实施例中，表达载体包含如SEQ ID NO2所示之核酸序列。本文所使用之语词″表达载体″系可直接表达连接至其上之基因核酸分子。较佳的载体为彼等可自行复制及表达连接于其上之核酸者。一般言之，可用于重组DNA技术之表达载体通常为″载体″形式，一般为环状双链之DNA，在其为载体形式时并未融合至染色体。
为表达具生物活性之妙可来素，本发明编码妙可来素蛋白质或其功能相等物之核酸序列可插入适当之表达载体中，此载体需含有插入编码序列之转录及转译等必要组件。根据本发明，本领域技术人员可利用熟知之方法构筑含有编码妙可来素及适当转录及转译控制组件之表达载体。此等方法包括体外重组DNA技术，合成技术及体内基因重组技术等。
本发明另一目的系提供包含表达载体之宿主细胞，该载体包含编码妙可来素之核酸序列。本文所使用之语词″宿主细胞″为可经载体(如质粒)感染之宿主细胞。适用于本发明之宿主包括通常及一般使用于本领域的宿主。根据本发明，许多宿主系统可用于包含且表达编码妙可来素之序列。此等宿主系统包括但不限于微生物(如以重组质粒或表达载体转化之细菌)、酵母菌(如以酵母菌表达载体转化之酵母菌)、或动物细胞系统。药物组合物本发明亦包括一种药物组合物，包含本发明之重组蛋白质。除本发明蛋白质外，该药物组合物可含有适当之药学上可接受之载剂。
本发明之药物组合物可以本领域已知之方式(例如藉常用方法)制造，该常用方法包括混合、溶解、制粒、制锭、磨细、乳化、包胶、包陷及/或冷冻干燥等步骤。
本发明之药物组合物可藉任何途径投药，此等途径包括(但不限于)口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、脑室内、穿皮、皮下、腹膜腔内、鼻内或肠道投与。实用性根据本发明，本发明之妙可来素蛋白质在短时间内，较佳为15分钟内，即可呈现溶解血栓效果且无出血性副作用。换言之，妙可来素仅需短时间(约15分钟)即可去除血栓，其在治疗血栓上呈现独特的特性。本发明之妙可来素蛋白质具有溶解纤维蛋白原之活性，可直接溶解血栓，故提供较快之溶解速率。因此，本发明蛋白质可用于治疗心血管并发症，包括心绞痛、急性心肌梗塞、脑血管栓塞(中风)、孕妇肺栓塞、深静脉血栓及动脉血栓。本发明蛋白质特别系有用于治疗中风，急性心肌梗塞、孕妇肺栓塞及深静脉血栓。
Northern印迹法分析显示一2.1Kb之毒腺专一性杂交产物(图2)。Northern印迹法分析指出妙可来素基因组织专一性仅表现于毒腺，以及其对应长度之cDNA。实施例3妙可来素蛋白质之制备表达质粒之构建表达质粒之构建系藉连接妙可来素cDNA之编码区域至pET21a载体(Novagen Inc.，WI，U.S.A.)之BamHI及EcoRI位置。接着将包含1.47Kb插入物之质粒，称为pMucroslysin，转染至E.coli BL21(DE3)细胞中进行蛋白质表达。融合蛋白质之表达及纯化包含pMucroslysin之BL21(DE3)细胞在Luria-Bertani培养液中生长至晚对数期(A600＝0.3～0.4)并以1毫摩尔浓度之异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)诱导2小时。在8M尿素缓冲液(8M urea，0.1M NaH2PO4，10mM Tris-HCl pH8.0)以超声波作用，细胞会形成团块。将所得包含重组妙可来素蛋白质之裂解物在4℃下以His-结合亲和性树脂培养2小时。此树脂接着以8M尿素缓冲液清洗2次。重组蛋白质以含有400mM咪唑(imidazole)之相同缓冲液洗脱。纯化蛋白质之产率为10毫克/升细菌培养液。经纯化之融合蛋白质以10％tricine SDS-PAGE进行分析(图3A)。Western印迹法分析根据Burnette之方法进行Western印迹法(Burnette，W.N.(1981)Anal.Biochem.112，195-203)。将膜首先以兔抗-龟壳花毒腺(1∶5000)抗血清处理，接着以羊抗兔IgG之过氧化物酶结合的二级抗体反应。使用3，3′-二氨基联苯胺(3，3′-diaminobenzidine)(DAB)及过氧化氢检测蛋白质。Western印迹图系示于图3B。经由His-结合-树脂纯化之妙可来素系藉抗龟壳花毒液之多克隆抗体确认，且发现具有52kDa之分子量。表达于E.coli之重组蛋白质之再折叠及鉴定经纯化后之妙可来素蛋白质，在4℃下于含有金属离子之氨基酸缓冲液(再折叠缓冲液)中进行再折叠。再折叠蛋白质之功能性分析在37℃下于含有1mM CaCl2及10微克纤维蛋白原之中，分别进行0、3、6、18、24、30及36小时。纤维蛋白原对再折叠蛋白质之蛋白质比例为100/1(w/w)，并以100℃下加热5分钟来终止反应，并将所得样品利用SDS凝胶电泳进行分析。
在该纤维蛋白原分析中，纤维蛋白原之Aα链在培养后18小时可被完全消化。然而，Bβ链之消化则自18小时后开始而可于36小时后被完全消化。妙可来素亦呈现裂解纤维蛋白原之γ链的能力。凝胶底部在30kDa处凝集一额外带，其对应至消失的纤维蛋白原之Bβ链及γ链(图4)。实施例4血栓溶解分析血管造影图之血栓溶解分析重组蛋白质之体内纤维蛋白原溶解活性系以诱导于Sprague-Dawley(SD)鼠之尾下腔静脉之人工血栓进行测试，而以血管造影术分析血栓溶解情况，分析时间超过2小时。首先将导管插入经麻醉SD鼠之右链静脉以进行加药及采血。人工血栓系在开腹手术后，藉注射15微升之牛纤维蛋白原溶液(5％)及5微升血栓(100u/ml)而诱导于分离之尾下腔静脉。血栓诱导后1小时，将剂量1.0毫克/公斤的重组妙可来素蛋白质经腿骨静脉导管注射于大鼠。取血管照片前，经导管注射0.5毫升体积之血管造影剂(angiograffin))(Angiovist 370，Berlex Labs)。分别在实验开始后之0分钟、15分钟、30分钟及120分钟时，共摄取四张血管照片(Willis，T.W.，Tu，A.T.及Miller，C.W.(1989)Thromb.Res.53，19-29)。
剂量1.0毫克/公斤之重组妙可来素之静脉内投药显示投药妙可来素15分钟后，原先阻塞血管之血栓开始溶解并在2小时内完全溶解(图5)。经重组妙可来素蛋白质处理之动物之组织学实验10只Sprague-Dawley鼠经静脉内注射10毫克/公斤体重剂量之妙可来素蛋白质。24小时后，取自肾、肝、心及肺之组织切片以10％福尔马林固定并包埋在石蜡中。切片以苏木精(hematoxylin)及伊红(eosin)染色。每一组织进行坏死及出血检测。肾、肝、心及肺组织之组织检测显示并无坏死及出血现象。
上述实施例系用以进一步说明本发明之核酸及蛋白质，并非作为本发明之限制。
权利要求
1.一种妙可来素(mucroslysin)蛋白质，包含如SEQ ID NO1所示之氨基酸序列，及其具溶血栓功能之相等物。
2.根据权利要求2之蛋白质，其具溶解纤维蛋白原之活性。
3.一种分离核酸分子，其包含编码具SEQ ID NO1所示妙可来素蛋白质氨基酸序列之核苷酸序列。
4.根据权利要求3之核酸分子，其中该分子包含如SEQ ID NO2所示之核苷酸序列或其简并序列。
5.一种表达载体，包含如权利要求3之核酸序列。
6.一种表达载体，包含如权利要求4之核酸序列。
7.一种宿主细胞，包含如根据权利要求5之载体。
8.一种宿主细胞，包含如根据权利要求6之载体。
9.一种制造如权利要求1之蛋白质的方法，其包含下列步骤a)将包含有如权利要求3之核酸分子之宿主细胞，于可容许由该核酸分子编码之蛋白质表达之条件下培养；及b)自该宿主细胞培养液中回收该蛋白质。
10.根据权利要求9之方法，另包含在含有金属离子之氨基酸缓冲系统中再折叠该蛋白质之步骤。
11.一种药物组合物，包含如权利要求1之蛋白质。
12.根据权利要求11之药物组合物，具有溶解纤维蛋白原之活性。
13.根据权利要求11之药物组合物，用于去除血栓。
14.根据权利要求11之药物组合物，用于治疗选自下列之心血管并发症心绞痛、急性心肌梗塞、脑血管栓塞(中风)、孕妇肺栓塞、深静脉血栓及动脉血栓。
15.根据权利要求11之药物组合物，用于治疗中风、急性心肌梗塞、孕妇肺栓塞及深静脉血栓。
全文摘要
本发明提供一种新的妙可来素(mucroslysin)蛋白质及基因，制造该蛋白质之载体及宿主细胞。本发明妙可来素蛋白质可在短时间内呈现溶解血栓之效果且无出血性之副作用。
文档编号C12N15/12GK1482139SQ0213156
公开日2004年3月17日 申请日期2002年9月11日 优先权日2002年9月11日
发明者郭耀文, 何佩勋 申请人:基亚生物科技股份有限公司