一种α-淀粉酶及其编码基因与应用【
技术领域：
】[0001]本发明涉及生物工程
技术领域：
，更具体地涉及一种α-淀粉酶及其编码基因与应用。【
背景技术：
】[0002]α-淀粉酶（1，4-a-D-glucan-glucanhydrolase，EC3.2.1·1)是一种内切型淀粉酶。它广泛存在于动物，植物，微生物中，是一种工业酶，在食品，酿酒，饮料，制药等行业中具有广泛应用。目前已经分离并鉴定的120种α_淀粉酶，从数量上看微生物来源的α_淀粉酶占大多数。微生物中能产生α_淀粉酶的有：Bacillus，Thermomonospor，Acinetobacter，Pseudomonas，Streptomyces，Aspergillus，Penicillus等。目前在工业上大量使用的a-淀粉酶主要来源于枯草芽抱杆菌属(Bacillussubtilis)，地衣(Bacilluslicheniformis)，M[S^(AspergillusnigerWP：)|t[S^(Aspergillusoryzae)0[0003]虽然α-淀粉酶的工业应用和微生物的α-淀粉酶已经研究了几十年，并取得了一定的进展，但是符合工业应用要求的仍然有限。[0004]近年来，一系列植物微生物α-淀粉酶实现了在大肠杆菌或者在酵母中的异源表达，如来源于棘孢木霉(Trichodermaasperellum)的α-淀粉酶被克隆到pPIC9K载体在毕赤酵母中实现了可溶性表达（ZengQ,WeiC,JinJ，etal.Cloningofthegeneencodingacid-stablealpha-amylasefromAspergi1lusnigeranditsexpressioninPichiapatoris.AfrJFoodSci，2011，5:668·)，即便如此，还是没有筛选得到适冷的、高效的α-淀粉酶，因此开发这一类新酶依旧是研究热点。1990年以来不少产淀粉酶的南极低温菌被分离和鉴定出来，1997年，M.Fenice此等从南极维多利亚岛上分离出5株都具有淀粉酶活性的G·pannorumvar·pannorum，其中no.1显示出了显著的活力，有产业化的应用价值（参见M.FeniceaLetal.1997.ProductionofextracellularenzymesbyAntarcticfungalstrains.PolarBiol,17:275-280)。2011年，AbiramyKrishn等再次在南极岛上筛选到了数株低温下分泌淀粉酶的真菌，其中主要菌种为Geomycespannorum(参见AbiramyKrishnetal.2011.ExtracellularhydrolaseemzymeproductionbysoilfungifromKingGeorgeIsland,Antarctic.PolarBiol，34:1535-1542)〇虽然已知Geomycespannorum具有客观的淀粉酶活性，但是关于其淀粉酶的基因序列和淀粉序列并没有报道，且由于该菌培养条件限制，至今还没有分离纯化出其淀粉酶，对其酶学性质也没有研究。【
发明内容】[0005]本发明的目的是提供一种α_淀粉酶及其编码基因与应用，从而解决现有技术中的淀粉酶较少符合工业应用要求的缺陷。[0006]为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：[0007]根据本发明的一个方面，提供一种α_淀粉酶，所述α_淀粉酶是如下(a)或(b)的蛋白质：（a)由SEQIDN0:3所不的氣基酸残基序列组成的蛋白质；（b)将SEQIDN0:3所不的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有淀粉酶功能的由(a)衍生的蛋白质。[0008]该<1-淀粉酶来源于南极低温菌6601115^68。3111101'11111(菌种鉴定叱131登录号：JF20026,已保藏在CCTCC，编号为AF2014016)。[0009]为了便于α-淀粉酶的纯化，可在由SEQIDN0:2限定的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。[0010]表1[0012]本发明还提供一种α-淀粉酶基因，编码如上所述的α-淀粉酶。[0013]所述α-淀粉酶基因的碱基序列如下：1)如SEQIDΝ0:2所示的碱基序列；或2)在严格条件下可与SEQIDΝ0:2限定的碱基序列杂交且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子；或3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白质的DNA分子。[0014]上述严格条件可为在0.1XSSPE(或0.1XSSC)，0.1%SDS的溶液中，在65°C条件下杂交并洗月旲。[0015]上述（b)中的α_淀粉酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得至IJ。上述(b)中的淀粉酶的编码基因可通过将SEQIDΝ0:2的自Υ末端第1-1482位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。[0016]本发明还提供一种重组质粒，所述重组质粒如上所述的α-淀粉酶基因与表达载体质粒连接构建而成。[0017]所述表达载体质粒是米曲霉表达载体pSKNHG。[0018]本发明还提供包含如上所述的α-淀粉酶基因的表达盒、转基因细胞或重组菌。[0019]优选地，所述重组菌是将如上所述的含有α-淀粉酶基因的重组质粒转入米曲霉中获得的重组菌。[0020]本发明还提供一种制备α-淀粉酶的方法。[0021]本发明所提供的制备α-淀粉酶的方法，是发酵培养上述含有α-淀粉酶基因的重组菌，得到淀粉酶。[0022]本发明还提供一种如上所述的α-淀粉酶在食品，酿酒，饮料，制药行业中的应用。[0023]其中，该α-淀粉酶的最适作用温度为50°C，且在40_60°C之间仍然保持较高酶活力，属于中温蛋白酶，最适作用pH为5·0，在pH3·0~7·0区间内具有较高酶活力。[0024]本发明通过基因工程技术，从南极低温菌Geomycespannorum中扩增得到α-淀粉酶基因，并将其转入米曲霉中成功实现异源表达。本发明提供的淀粉酶具有较高的最适反应温度，且热稳定性好，具有较好的工业应用前景。【附图说明】[0025]图1是本发明纯化的α-淀粉酶的SDS-PAGE图，其中，Μ为蛋白Marker，l为纯化后的GpAl蛋白；[0026]图2是Geomycespannoruma-淀粉酶的温度曲线；[0027]图3是Geomycespannoruma-淀粉酶的温度耐受性；[0028]图4是Geomycespannoruma-淀粉酶的pH曲线；[0029]图5是Geomycespannoruma-淀粉酶的pH耐受性。【具体实施方式】[0030]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。[0031]下述实施例中所述试验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂或耗材，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。实验按《分子克隆：实验室手册》（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件进行，或按照厂商所建议的条件进行。[0032]实施例Ια-淀粉酶基因的扩增[0033]1.1菌株及其培养[0034]从马来西亚大学生物科学学院合作项目中获赠南极低温菌Geomycespannorum(菌种鉴定NCBI登录号JF20026,已保藏在CCTCC，编号为AF2014016)。[0035]用无菌水从培养10天的PDA斜面上洗下G.pannorum孢子，接种液体培养基，20°C培养7天收集菌丝体，用于基因组提取：用牙签接种奶粉固体培养基，20°C培养5天收集菌丝，用于总RNA提取。[0036]1.2基因组提取[0037]按照Omega真菌基因组提取试剂盒说明书进行操作。[0038]1.3总RNA提取[0039]按照TakaraRNA提取试剂盒说明书进行操作。[0040]1·4cDNA第一链合成[0041]以抽提的总mRNA为模板，用Takara试剂盒的方法获得cDNA第一链，PCR体系(如表2和表3)及操作步骤如下：[0042]表2[0043]65°C保温5miii，冰上迅速冷却，向上述反应管中加入[0044]表3[0046]42°C45min，95°C5min，冰上冷却。[0047]1·5Geomycespannoruma-淀粉酶基因的克隆[0048]在NCBI上找到另一株Geomycespannorum菌种的a-淀粉酶氨基酸序列，该菌株与本申请所采用Geomycespannorum属于不同种，根据该序列设计正向引物Alf，反向引物Air。其中：[0049]Alf:5'ATGTTTTTCAACTGCCCTGC3'[0050]Alr:5'TCAAGGGCAATAGCTGCCCT3'[0051]表4[0053]以1.2获得的基因组为模板，采用表4所示反应体系进行PCR。反应条件为:94°C预变性4min;94°C变性30s，50°C退火30s，72°C延伸lmin，30个循环；72°C延伸10min;保存在4°C。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收，连pMD19-TSimpleVector，菌落PCR验证阳性克隆送测序，测序由华大基因完成。[0054]1.6α-淀粉酶CDNA的克隆[0055]分析1.5得到的α-淀粉酶基因DNA序列，根据保守氨基酸序列以3的倍数递推，同时结合NCBIBlastX比对结果，找到了可能性最大的起始密码子ATG和终止密码子ΤΑΑ。在密码子上预测网站（http://linuxl·softberry·com/berry.phtml?group=programs&subgroup=gfind&topic=fgenesh)，得到了主要可能的内含子，设计ORF的特异性引物：[0056]Alf2:5'ATGTTTTTCAACTGCCCTGC3'[0057]Alr2:5，TCAAGGGCAATAGCTGCCCT3，[0058]以1.4获得的GeomycespannorumcDNA为模板，采用特异性引物Alf2和Alr2,进行PCR扩增a-淀粉酶0RF，PCR体系如下表5所示：