蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1及其编码的蛋白和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAFI的克隆及 其应用。
【背景技术】
[0002] 錯梅（ChimonanthuspraecοX)，錯梅科（Ca1ycanthaceae)，錯梅属 (Chimonanthus)，别名金梅、錯花、錯木、黄梅花。落叶灌木，常丛生。花期11月至翌年3月。錯 梅是我国传统的名贵花木。蜡梅原产我国，以鄂西、川东、陕南为分布中心。北京以南、衡阳 以北、上海以西、成都以东各地普遍栽培，而以南京、湖北保康、河北鄢陵、重庆栽培较多。蜡 梅花冬春冒寒怒放，风姿独特，芳香馥郁，韵味奇异，园艺造型颇多，加之象征着幸福吉祥， 不仅为历代宫廷权贵所爱，也是诗人、画家的钟情之物。蜡梅园林用途和经济用途十分广 泛，不仅是理想的花灌木，还可做切花、粧景，其花可泡茶、酿酒、入药、提取香精，根茎可作 止咳、活血药用。尤其近20年来在种质资源、形态分类、栽培繁殖、园林应用、基因文库等方 面取得了大量成果，人们对蜡梅的应用也愈加广泛。
[0003]CCR4/P0P2,又名CCR4/CAFl(Tuckeretal.，2001)，P0P2系早期相关关研究使用 的名称，现多用0六？1(〇^4-388〇(^3七6(1€3(^(^1)。〇^4和04?1单体也是脱腺苷酸酶，具备 相应的活性位点和酶切活性(MartineAetal.，2012)<XAFl是参与mRNA降解的主要脱腺 苷酸酶之一，在调控基因表达和影响生物学性状方面起着重要作用（CuiYetal，2008; Liangffetal,2009；MartineAetal.,2012)〇
【发明内容】
[0004] 为了解决上述问题，本发明提供一种蜡梅脱腺苷酸酶及其应用。
[0005] 蜡梅脱腺苷酸酶为，1)由SEQIDNo. 2所示氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQID No. 2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生 的蛋白质。
[0006] 本发明还提供编码上述蛋白的基因，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明提供 的蜡梅脱腺苷酸酶基因是通过随机克隆测序的方法从蜡梅花cDNA文库获得的，其开放阅读 框序列807bp。錯梅脱腺苷酸酶基因编码蛋白与拟南芥（Arabidopsisthaliana)、梅 (Prunusmume)、葡萄（Vitisviifera)、可可（Theobromacacao)、油棕（Elaeis guineensis)、荷花(Nelumbonucifera)、蓖麻(Ricinuscommunis)的脱腺苷酸酶基因编码 蛋白的相似度高达98 %，与其他物种的同源性也在95 %~97 %之间，结构比较保守。
[0007] 应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的 前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。
[0008] 因此，本发明的蜡梅脱腺苷酸酶还包括SEQIDNo.2所示氨基酸序列经取代、缺失 或添加一个或几个氨基酸，具有蜡梅脱腺苷酸酶同等活性的由蜡梅脱腺苷酸酶衍生得到的 蛋白质。本发明蜡梅脱腺苷酸酶基因包括编码所述蛋白的核苷酸序列。此外，应理解，考虑 到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合 特定物种表达的密码子。
[0009]本发明还提供含有上述蜡梅脱腺苷酸酶基因或其片段的载体，以及含有该载体的 宿主细胞;所述载体为所述蜡梅脱腺苷酸酶基因的克隆载体或各类表达载体。
[0010]本发明的蜡梅CpCAFl基因具有花器官优势表达特征和花发育延迟功能，在拟南芥 中超量表达，可以延迟拟南芥开花，增加叶面积、角果数和分枝数，延迟衰老，表明本发明的 蜡梅CpCAFl基因可促进植物生长发育。
【附图说明】
[0011]图1所示为转基因拟南芥的⑶S染色。A:野生型拟南芥;B:转基因拟南芥。
[0012] 图2所示为转基因拟南芥中CpCAFl基因的PCR检测。M:DNA分子量标准，DL2000;1: 野生型拟南芥;2-9:转基因拟南芥中CpCAFl基因的PCR检测；10:阴性对照(ddH20)
[0013] 图3转CpCAFl基因拟南芥叶片中CpCAFl基因的相对表达分析。1:野生型拟南芥;2， 4,6,7,10:转CpCAFl基因拟南芥不同单株系。
【具体实施方式】
[0014] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0015] 实施例1蜡梅CpCAFl基因的分离
[0016] 随机挑选錯梅花cDNA文库克隆，提取质粒DNA，以5'pTriplEx-Sequenceprimer 为测序引物，进行正向序列测定得到EST序列，然后运用DNAStar软件包的SeqMan进行EST聚 类，对获得的EST序列通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih. 8〇￥/)131^\31'程序的131&8七~ (Nucleotide-nucleotideBLAST)和BlastX(Translatedqueryvs.proteindatabase)进 行比对分析，获得目标克隆子，并初步确认其功能属性。
[0017] 以SP5和T7为测序引物进行两次正反向序列测定，得到蜡梅GTP结合蛋白基因CAF1 的cDNA序列。根据获得的蜡梅CAF1基因cDNA序列，用软件Primerprimer5 · 0设计1对跨最 大0RF框的特异引物进行PCR扩增，引物序列如下：
[0018] CpCAFl-F:5'-GAATTCATGGGGAGTTTTCCCAAAGGTG-3'SEQIDΝο·3
[0019] CpCAFl-R:5'-GGATCCTTACCACCGAGACCATTCCAAGACAC-3'SEQIDΝο·4
[0020] 分别以蜡梅文库质粒DNA和蜡梅cDNA为模板，扩增蜡梅CpCAFl基因，PCR反应体系 及反应条件如下：
[0022] 将PCR产物回收后连接到T载体，转化大肠杆菌感受态细胞，或者重组子，挑取重组 子进行测序，蜡梅CAF1基因cDNA序列如SEQIDNo.l所示。
[0023] 在NCBI数据库进行Blastp对比，结果显示蜡梅CpCAFl基因编码蛋白（SEQID 1^〇.2)与其他物种04?1基因编码蛋白的相似性较高，与拟南芥(4抑1^(1(^818 1:1^1131^)、梅 (Prunusmume)、葡萄（Vitisviifera)、可可（Theobromacacao)、油棕（Elaeis guineensis)、荷花(Nelumbonucifera)、蓖麻(Ricinuscommunis)，相似度高达98%，与其 他物种的同源性也在95%~97%之间，结构比较保守。CpCAFl蛋白属于DEDD核酸酶家族的 DEDDh亚族，其活性区由3个天门冬甘酸(D)、l个谷氨酸(E)以及邻近的组氨酸(h)组成。与拟 南芥比较，存在约50个氨基酸的位点变异。
[0024]实施例2蜡梅CpCAFl基因植物超表达载体的构建
[0025]结合CpCAFl基因0RF框序列自身限制性酶切位点的分布特点及所用植物超表达载 体PCAMBIA2301G的多克隆位点特征，设计一对基因特异引物，并分别在引物上下游加入酶 切位点BamHI和EcoRI及相应的保护碱基，用于扩增携带适宜酶切位点的CpCAFl基因编码 区并将其克隆到植物表达载体的多克隆位点。引物名称及序列如下：
[0026] CAF1-FGAATTCATGGGGAGTTTTCCCAAAGGTGSEQIDNo.5
[0027] CAF1-RGGATCCTTACCACCGAGACCATTCCAAGACACSEQIDNo.6
[0028]PCR扩增体系和反应程序如下：
[0030]取5yLPCR产物经1 %琼脂糖凝胶电泳后，回收目的片段，连接到克隆载体pMDl9-T后转化到大肠杆菌感受态细胞Τ0Ρ10中，涂布在Amp的LB平板上37°C倒置过夜培养，挑取单 克隆进行PCR鉴定，鉴定为阳性的质粒送至华大基因测序。将测序正确的阳性质粒命名为 pT-CpCAFl。用BamHI和EcoRI分别酶切pT-CpCAFl质粒和植物表达载体pCAMBIA2301G质 粒，反应体系如下：
[0032] 3 7 °C恒温箱酶切2 -3h，8 0 °C灭活5miη。琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物中 PCAMBIA2301G载体大片段及CpCAFl小片段。将回收的CpCAFl基因片段与表达载体pCAMBIA2301G片段按照Fermentas公司T4连接酶说明书进行连接。22°C水浴过夜连接6h以上。连接 体系如下：
[0034]将连接产物转化大肠杆菌T0P10，涂布在含50mg/LKan的LB平板上37°C倒置过夜 培养，挑取单克隆进行PCR检测，将电泳检测为阳性的菌液活化后提取质粒进行双酶切验 证。将PCR鉴定和双酶切验证均正确的阳性质粒进行测序，确定无碱基突变后，命名为 pCAMBIA2301G-CpCAFl，即为CpCAFl基因植物超表达重组载体。
[0035] 将重组质粒pCAMBIA230