1G-CpCAFl冻融法转化农杆菌EHA105感受态细胞，挑取单 菌落，置于650ul含有YEB+Kan+Chl无菌的1 · 5mL离心管中（50mg/LKan和34mg/LChi)中，28 °〇振荡培养36-48h，以菌液为模板进行PCR检测。并进一步提取农杆菌转化子质粒，反转入 大肠杆菌感受态细胞T0P10中，涂布在含Kan的LB平板上37°C倒置过夜培养，挑取单克隆进 行PCR检测，将检测为阳性的菌液再提取质粒进行双酶切鉴定。验证正确的农杆菌菌液即为 含有植物表达载体pCAMBIA2301G-CpCAFl重组质粒的工程菌。
[0036]实施例3蜡梅CpCAFl转化拟南芥 [0037]花序侵染法转化拟南芥 [0038] (1)拟南芥的培养
[0039]将适量拟南芥种子收集于1.5mL离心管中，加入浓度为17%的次氯酸钠(NaCIO)充 分振荡消毒l〇min，然后用无菌水冲洗5-6次后用移液枪均匀列播或散播在MS培养基平板 上，于4°C冰箱春化2-3d后将培养平板置于光照16h/黑暗8h的光周期、2000LUX照明条件和 22°C、70%湿度的环境下培养，约2周后移栽至培养基质中（蚯蚓土:蛭石= 1:1)。在培养过 程中剪掉最初的顶生花序以促进侧枝的生长。在基质中培养3周左右，至花葶长度5cm左右 时，对拟南芥花序进行农杆菌侵染。
[0040] (2)花序侵染法转化拟南芥
[00411在含有抗生素(Chl:34mg/L，Kan:50mg/L)的YEB固体培养基上划单线活化含有植 物表达载体pCAMBIA2301G-CpCAFl重组质粒的农杆菌EHA105,28°C暗培养36-48h;
[0042] 用无菌牙签挑取单菌落，接种至650ul含有抗生素（Chl:34mg/L，Kan:50mg/LW9 YEB液体培养基中，28°C，200rpm振荡培养36-48h;
[0043] 对培养的农杆菌菌液用特异引物进行PCR鉴定，验证正确后取500ul上述菌液接种 于25mL无抗的YEB液体培养基中，28°C，200rpm摇菌至OD600在1-1.2之间备用；
[0044]用10mL的无菌离心管收集上述菌液，28°C，5000rpm离心15min，弃上清液，收集沉 淀，沉淀用现配侵染液(无菌水+5 %蔗糖+0.5%〇L-77)重悬，稀释至OD600 ? 0.8
[0045]初次侵染剪去拟南芥花葶上已开放的花朵，仅保留刚露白的花蕾，并提前一天浇 水保持基质湿润。侵染前用喷水壶将纸箱内壁喷湿以作暗培养备用，将花葶头浸入侵染液 (0.5cm)，3-5秒后取出放入纸箱中，纸箱外面外蒙上黑布(遮光），置于22°C温度条件下培养 24h后取出，保持在光线较暗的环境中过夜，再转到正常的生长环境中。
[0046]拟南芥侵染1周后根据拟南芥的生长状态可再次侵染以提高转化效率。
[0047]转基因拟南芥的筛选鉴定[0048] (1)转基因拟南芥的Kan抗性筛选
[0049]转化约1个月后，收集成熟、开裂的果荚，即为To代种子。将种子在37°C恒温烘箱中 烘干后再放在低温干燥的环境1周以上播种，进行抗生素筛选。
[0050] To代转基因种子用前述方法消毒后播种于含50mg/LKan的MS培养基平板上进行 筛选，转化成功的拟南芥能在含有Kan抗生素的培养基上正常生长。
[0051]得到若干不同株系，对各株系的种子继续进行Kan抗性筛选，直至所有株系 收获的种子播种后全为绿色抗性苗，一般得到的T3代种子即为转基因纯合株系。
[0052] (2)转基因拟南芥GUS组织化学染色检测
[0053]将抗性筛选所得的Τ4代转基因拟南芥株系播种，取2周左右大小的植株进行GUS染 色鉴定，以野生型拟南芥作为对照。结果表明，筛选获得的8个转基因拟南芥株系均能被染 成蓝色，而野生型拟南芥则不能被染成蓝色（图1)。
[0054] (3)转基因拟南芥的PCR检测
[0055] 提取8个转基因拟南芥株系和野生型拟南芥植株的叶片基因组DNA，用CpCAFl基因 的特异引物进行PCR鉴定，所用引物对为CpCAFl-F和CpCAFl-R。结果表明，所得的转基因拟 南芥株系均能扩增出与阳性对照大小一致的目的条带，而野生型拟南芥未扩增出目的条 带，表明目的基因CpCAFl已成功插入到拟南芥基因组中（图2)。
[0056]实施例4转基因拟南芥的实时荧光定量PCR检测
[0057]为进一步验证CpCAFl基因在转基因拟南芥中的表达情况，提取转基因拟南芥和野 生型拟南芥幼嫩叶片的总RNA，以反转录后的cDNA第一链为模板，拟南芥Actin基因作为内 参基因，对转基因拟南芥中CpCAFl基因进行荧光定量PCR分析表达情况，所用引物如下表1 所示，结果如图3所示。
[0058]表1转基因植株RT-PCR所用引物
[0060]在检测的6个转基因拟南芥株系中，CpCAFl基因的表达差异较大（图3)。在后期对 转基因拟南芥进行分析时，根据实时荧光定量结果，选取表达量最高和表达量稍低株系代 表转基因不同表达量的株系进行表型观察和相关处理。
[0061]实施例5转基因拟南芥表型观察
[0062]对鉴定为阳性的T4代转基因拟南芥株系进行表达量分析，选取2个转基因株系（1 个强表达+1个稍弱表达），并以野生型拟南芥(WT)为对照，每个转基因株系和WT各选择5-10 株为表型观察记录植株，每天定时观察比较从苗期到抽葶结实期再到衰败时期的表型，并 进行相关数据统计。
[0063]对T4代转基因拟南芥株系和野生型拟南芥进行表型观察及相关指标测定，结果发 现，转基因拟南芥株系的抽薹时间、莲座叶侧枝、和茎生叶侧枝形成时间、第一个花序、第一 朵花和第一个果荚出现时间都稍晚于野生型植株(表2)，在生长30天时，转基因拟南芥株系 CpCAFl-3、CpCAFl-5的高度分别为野生型植株的1.08倍、1.19倍，转基因拟南芥株系 CpCAFl-3、CpCAFl-5的莲座叶叶面积分别为野生型植株的1.02倍、1.46倍。在60天时，转基 因拟南芥株系CpCAFl-3、CpCAFl-5的莲座叶侧枝数分别为野生型植株的1.33倍、1.75倍;茎 生叶数分别为野生型植株的1.32倍、1.79倍;荚果数分别为野生型植株的1.28倍、1.83倍。 另外转基因拟南芥株系CpCAFl-3、CpCAFl-5的第一片黄叶出现时间明显晚于野生型植株， 在55天时叶片黄化程度没有野生型严重，在65天时转基因株系仍能大部分保持绿色，而野 生型植株出现大面积的黄化干枯。说明，CpCAFl基因的过表达能调控转基因拟南芥的生长 发育，使开花推迟，促进生长发育，延迟衰老。
[0064]表2T4代转CpCAFl基因拟南芥株系相关指标观察
[0066] 每组数为平均值土标准差;a、b、c、d表示P〈0.05水平上差异显著
[0067]该发明专利受到国家自然科学基金(脱腺苷酸酶基因CpCAFl对蜡梅花发育和非生 物胁迫响应的调控，项目号:31370698)资助。
[0068]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰 也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种蜡梅脱腺苷酸酶，其为： 1) 由SEQIDNo.2所示的氨基酸组成的蛋白质;或 2) 在SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 同等活性的由1)衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白的蜡梅脱腺苷酸酶基因。3. 根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。4. 含有权利要求2或3所述基因的载体。5. 含有权利要求4所述载体的宿主细胞。6. 含有权利要求2或3所述基因的转化植物细胞。7. 制备权利要求1所述蜡梅脱腺苷酸酶的方法，其特征在于，将蜡梅脱腺苷酸酶基因构 建到原核表达载体中，通过在大肠杆菌中发酵制备。8. 权利要求2或3所述的基因在调控转基因植物生长发育中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述基因在转基因植物中超量表达，使转 基因植物推迟开花，促进植物生长发育。
【专利摘要】本发明公开了蜡梅脱腺苷酸酶基因CpCAF1及其编码的蛋白和应用。本发明提供的蜡梅脱腺苷酸酶，其为：1)由SEQ？ID？No.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或2)在SEQ？ID？No.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本发明的蜡梅CpCAF1基因具有花器官优势表达特征和花发育延迟功能，在拟南芥中超量表达，可以延迟拟南芥开花，增加叶面积、角果数和分枝数，延迟衰老，表明本发明的蜡梅CpCAF1基因可促进植物生长发育。
【IPC分类】C12N15/82, C12N9/78, A01H5/00, C12N15/70, C12N15/55
【公开号】CN105420221
【申请号】CN201610019112
【发明人】眭顺照, 周仕清, 李志能, 马婧, 刘道凤, 李名扬
【申请人】西南大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2016年1月13日