专利名称：一种溶栓酶的制备方法
技术领域：
本发明属生物工程技术。
心脑血管疾病是危害人们健康和生命的主要疾病之一。全世界每年大约有1500万患者，其发病率、致残率和死亡率皆居三大疾病(心脑血管病、癌症、糖尿病)之首。造成心脑血管疾病的主要原因之一是由于血管内形成血栓，临床表现为急性心肌梗塞、脑血栓中风和脉管栓塞，严重危害人的生命。对于这些疾病最有效的治疗途径之一是采用溶栓制剂进行溶栓疗法。目前已经商品化的溶栓剂主要有第一代溶栓药物链激酶(SK)、尿激酶(UK)，这两种溶栓酶均为纤溶酶原激活剂，虽已成为商品，但缺点是缺乏溶栓特异性，容易导致出血等不良后果，同时，SK还有抗原性。第二代溶栓药以组织型纤维溶酶激活剂TPA为代表，此类药物对溶解纤维蛋白具有一定的特异性，但在体内的半衰期很短，如TPA仅为3-5分钟。同时，这些溶栓剂均为静脉注射剂型，只能用作治疗血栓病，而不能用于预防，并且由于它的制备工艺复杂，价格昂贵，难以广泛推广应用。
曾有日本学者Sumi.H从食品中分离出能溶解纤维蛋白的溶栓酶的报导、但尚未商品化。(Experientia，43，1110-1111，1987)鉴于目前已经商品化的溶栓药剂，由于溶栓剂的来源困难、生产工艺复杂等因素，使该类产品的产量受到限制，因而直接影响到疾病的治疗。如尿激酶由收集尿液、储运，消臭等程序，对环境卫生造成不良的后果，影响周围市民的生活，同时，由于天气的变化，尿液亦极易变质，从而直接影响生产的产量，如此种种的缘因，使溶栓制剂的产量，质量皆受到制约。
本发明基于目前溶栓酶制备的状况，研制一种溶栓制剂的原料来源广泛，制备容易，纯化方便，价格较便宜，而制剂的治疗效果又较显著，且有特异性无副作用，具有治疗和予防的双重功能的一种溶栓制剂。
本发明的技术特征在于用微生物发酵方法，经菌种接种培养发酵，分离纯化等步骤，使工艺简化，产品的产量、质量均能达到要求。
本发明的内容涉及到从土壤、干(枯)草、豆制食品中定向分离一大批细菌，并从中筛选到一株能大量产生并分泌到体外的具有强烈降解纤维蛋白的蛋白水解酶菌株，将此菌株接种于一定培养基中进行发酵，发酵液经过适当予处理后，再经过一定浓度的硫酸铵沉淀、离心后获得沉淀物，然后再经溶解、透析、浓缩、干燥等工序，制得溶栓酶的粗制品，粗制品经离子交换，凝胶过滤等过程，制得溶栓酶制剂。
本发明所制得的溶栓酶制剂，按陈奇方法(中药药理研究方法学，北京人民卫生出版社，1994年第一版)测定溶栓制剂溶解人纤蛋白的结果表明该制剂有很强的溶解人纤维蛋白的能力，将人血凝块0.1克放入溶栓剂溶液中，37℃保温1小时，可将血块完全溶解。将溶栓制剂给大白鼠口服2-3天后，测定大白鼠血浆优球蛋白溶解时间(ELT)，表示ELT明显缩短，纤溶活性提高41％～51％，对48-65岁人群自顾口服溶栓剂试验结果表明，人血浆中ELT缩短33％-50％，这显示本发明溶栓剂能明显地提高人体的纤溶活性，从而起到防止血栓形成的功效。
本发明制备的溶栓剂为口服制剂或静脉注射剂型，克服现有溶栓剂多为静脉滴注，它存在着只能用于治疗而不能用于予防作用的缺点，而本发明的溶栓制剂，却具有予防、治疗的双重功能。
实施例1.将精选的优质大豆用自来水浸泡12-24小时，沥干水份，装入盛器中，经过1.1-1.2kg/cm2压力，高压灭菌20-45分钟，接种本发明筛选出的菌株，其接种量为102-103个菌/克豆，置于25-45℃条件下恒温培养12-24小时，取出置于4℃-5℃条件下继续发酵12-24小时，加入2-10倍体积含有0.9％NaCl PH7.2的生理盐水，浸泡提取1-10小时，间隔搅拌，过滤弃沉淀，加入固体氯化钠，溶解，使其浓度达到4％-10％，4℃静置12-24小时后，用3000-7000转/分，4℃离心10-30分钟，弃沉淀，取上层清液，继而加入分析纯固体硫酸铵，使其浓度达到25％-85％的饱和度，在4℃下静置12小时，保持同样温度，在3000-5000转/分下离心30分钟，弃上层清液，取沉淀，将其溶解在含有2-10mMCaCL2的0.01MTris-HCLPH7.0-7.5的缓冲液中，装入透析袋中，并用同样的缓冲液，在4℃下透析12-36小时，将透析液进行浓缩，冷冻干燥，制得粗制溶栓制剂。
2.按实施例1所叙述的方法，以1.0-10.0％(W/V)的大豆或大豆粉加入盛有PH6.0-8.0的水溶液(内含0.5％-2％混合盐溶液)中，加热灭菌后，接种本发明筛选的菌株，在25-40℃下经通气培养12-48小时后，离心弃沉淀，得上层清液。经测定溶栓酶活性为100-200u/ml(尿激酶单位)，此上层清液，可按实施例1方法制备成溶栓酶制剂，也可直接制备成溶栓酶口服液。
3.按照实施例1，2所叙述的方法，将制备获得的溶栓酶粗制品溶解于0.01MTris-HCl PH7.5缓冲液(内含2-10mMCaCl2)中，上SephadexG100和SephacrylS-200凝胶柱，用同样的缓冲液平衡和洗脱，用部分收集器收集洗脱液，测定每一分部溶栓酶活性。收集有活性部分洗脱液，再经固体硫酸铵沉淀，透析，浓缩干燥等工序，制得精制溶栓酶制剂。
权利要求
1.本发明系一种溶栓酶制剂制备方法，其特征在于从土壤、干(枯)草、豆制品中定向分离出一批细菌，并从中筛选到一株能大量产生、并分泌到体外的蛋白水解酶菌株，此菌株在培养基中进行培养发酵，经分离处理后，即制得特异降解纤维蛋白的溶栓酶制剂。
2.根据权项要求1所叙的一种溶栓酶制剂制备方法，其特征在于筛选的菌株在固体或液体培养基中培养发酵，制备溶栓酶制剂。
3.根据权项要求1、2所叙述的一种溶栓酶制剂的制备方法，其特征在于发酵溶液经离心分离后，在清液中加入固体硫酸铵，沉淀分离，沉淀再经溶解、透析，凝胶分离等，制取纯化溶栓酶制剂。
全文摘要
本发明涉及到由细菌在以大豆、无机混合盐为基础的固体和液体培养基中经发酵,产生并制备溶栓酶制剂的方法。经体外纤维蛋白平板、动物和人群体体内体外试验表明,此溶栓酶有很强溶解纤维蛋白,特别是溶解交联纤维蛋白的能力,特异性强,无副作用,而且口服有效。本发明的酶生产方法所需原料来源广泛,很有希望开发成一种可用于预防和治疗心脑血管病,特别是栓塞性疾病的药物。
文档编号C12N1/20GK1201070SQ9710644
公开日1998年12月9日 申请日期1997年5月30日 优先权日1997年5月30日
发明者吴自荣, 戚蓓静, 彭欣夏 申请人:华东师范大学