三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序列及分子鉴定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及DNA条形码领域，具体是三峡库区沿江口岸4种主要鼠类cytB特异序 列及分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002] Hebert等在2003年明确提出DNA条形码的概念，DNA条形码就是通过对一个标准 目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的方法。COI，cytB，16sRNA等基因均可以 被选做条形码。
[0003] 相较于传统形态学方式，DNA条形码拥有如下优势：①分子鉴定技术可以鉴定鼠 体不完整的标本，理论上只需要提取足够PCR扩增反应的组织就可以鉴定种群；②技术简 便，简捷快速，易于构建统一的DNA条形编码数据库。可以实现门、纲、目、科、属、种、亚种等 不同分类水平物种的鉴定，且具有高度的可重复性；③DNA条形码技术不需要像形态学鉴 定那样需要较多经验积累。传统的形态学鉴定依靠外形、头骨、牙齿等特征，十分依赖和模 式标本的对比，专业性强。
[0004] 目前文献显示，国内鼠类分子鉴定多选用COI基因作为条形码序列，通过保守通 用引物从目标鼠 DNA扩增获得COI基因，测序后对序列进行检索，比对，能成功地鉴定目标 种类的种属情况。但是COI基因相对较保守，对于亚种，地理种等鉴定效果不佳，且进化速 度较慢，不能对种内不同地理种，不同个体进行区别。
[0005] 三峡库区是三峡工程建设后形成的特殊区域，生态环境及鼠类种群分布存在其特 殊性。库区口岸主要鼠类有黄胸鼠，褐家鼠，小家鼠和黑线姬鼠等。随着库区口岸开放程度， 截获入境鼠类数量越来越多。目前，鼠类鉴定仍以形态学鉴定为主，但不同区域的同一种鼠 类存在遗传差异，明确其分子鉴定标签基因特征对鼠类快速鉴定十分必要，同时可弥补传 统形态学鉴定的不足。了解本地主要鼠类分子鉴定特征十分重要。
【发明内容】
[0006] 鉴于以上缺陷，本发明的第一目的是提供三峡库区沿江口岸4种鼠类cytB特异序 列，第二目的是利用上述4种鼠类cytB特异序列鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠 的分子鉴定方法。
[0007] 为了实现上述第一目的本发明采用的技术方案是：三峡库区沿江口岸4种鼠类 cytB特异序列，包括DNA序列为SEQ ID NO. 1的黄胸鼠 cytB基因序列；DNA序列为SEQ ID NO. 2的小豕鼠 cytB基因序列；DNA序列为SEQ ID NO. 3的褐豕鼠 cytB基因序列；DNA序列 为SEQ ID NO. 4的黑线姬鼠 cytB基因序列。
[0008] 为了实现上述第二目的本发明采用的技术方案是：上述4中基因序列在使用分子 鉴定方法鉴定黄胸鼠、小家鼠、褐家鼠以及黑线姬鼠中的应用，包括以下步骤：
[0009] (I)DNA模板的制备按照DNeasy Blood&Tissue试剂盒使用说明书提取待测标本 的肝脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA ;或者采用酚-氯仿抽提法提取待测标本的肝 脏、肌肉、皮毛或骨骼DNA，获取模板DNA ;
[0010] (2)?0?扩增？0?反应扩增体积为25 4 1^，其中10\缓冲液2.5 4 1^，1〇111111〇1/1(1犯13 2 μ L，25 μ mol/L的DNA序列为SEQ ID NO. 5的正向引物和DNA序列为SEQ ID NO. 6的反向 引物各 1 μ L，5U/ μ L Taq 酶 0· 2 μ L，模板 DNA 2 μ L，CldH2O 16. 3 μ L ;
[0011] PCR 反应条件为：95°C预变性 5min，94°C变性 30s，55°C退火 60s，72°C延伸 60s，35 个循环，最后再72°C延伸IOmin ;
[0012] (3)PCR产物检测取5 μ LPCR扩增产物，用1 %琼脂糖凝胶电泳（120V电压，电泳 30min)，溴化乙锭或Goldview核酸染料染色，荧光成像系统检测，取电泳效果较好的PCR扩 增产物送由生物公司纯化后测序；
[0013] (4)序列分析将步骤⑶测得的序列与DNA序列为SEQ ID NO. 1的黄胸鼠 cytB基 因序列，DNA序列为SEQ ID NO. 2的小家鼠 cytB基因序列，DNA序列为SEQ ID NO. 3的褐家 鼠 cytB基因序列和DNA序列为SEQ ID NO. 4的黑线姬鼠 cytB基因序列，进行对比分析，判 断待测标本的种属情况。
[0014] 本实发明具有以下有益技术效果：本发明获得三峡库区主要鼠类cytB特征序列， 为入境截获鼠类种群分子鉴定提供了数据参考，能快速进行遗传分析以确定截获鼠类是否 为本地鼠类。还能对种内不同地理种，不同个体进行区别。
[0015] 本发明提高了鼠类组织DNA提取的效率。新鲜的鼠类肝脏和肌肉组织DNA提取效 率较高，试剂盒法和酚-氯仿抽提法都能获得质量较高的DNA。对于腐烂标本，因杂质较多， 试剂盒法提取效果较差，DNA量不能满足后续试验要求，采用酚-氯仿抽提法，可以在较大 量的腐烂标本中提取足够的DNA用于后续试验，提取成功率大于80%。
【附图说明】
[0016] 图1为鼠 cytB基因电泳图；
[0017] 图中：M :marker DL2000,1-6 :鼠类 cytB 目标条带。
【具体实施方式】
[0018] 1、标本采集与保存。采用鼠笼法或鼠夹法采集捕获鼠类标本，也可以收集毒饵法 灭鼠后的死鼠，自然死鼠及腐败变干的死鼠残体等。将活鼠用氯仿或乙醚熏死，取约1-2克 肝脏或肌肉组织冷冻保存。如果为已经腐败的死鼠，取相对完整的皮毛或骨骼冷冻保存，取 样时避免污染。同时保存整体死鼠标本以做形态学鉴定。
[0019] 2、DNA模板的制备。（1)试剂盒提取：取出收集的肝脏或肌肉标本，剪碎置于干 净的2mL离心管中，皮毛或骨骼标本剪碎后加石英砂液氮冷冻研磨后置于干净的2mL离心 管中，按照DNeasy Blood&Tissue试剂盒（Qiagen)使用说明书提取DNA，获得DNA模板， 于-20°C保存备用。（2)酚-氯仿抽提法提取：液氮速冻收集的待测样本组织并研磨，转移 至 IOmL 的离心管，加入 DNA 提取液（Tris-HCl 400mM(pH 8.0);NaCl 150mM;EDTA 60mM; Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) lOg/L ;提取 DNA 组织与 DNA 提取液比例约 0· lg/2mL)，混 勾，冰上放置；加入等体积的酸：氯仿：异戊醇（25:24:1)，剧烈的祸旋5min ;8000rpm，4°C， 5min离心，取上清液，再加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1)抽提；重复加入等体积的氯仿： 异戊醇（24:1)抽提步骤，取上清液至新离心管中；加入所取上清液2. 5倍体积无水乙醇，轻 柔混匀，-20°(：沉淀301^11;10000印111，4°(：，离心101^11收集沉淀；75%乙醇漂洗沉淀，空气干 燥后，用ddH20溶解沉淀，即得模板DNA。
[0020] 3、引物合成，以下为鼠类cytB通用引物，由华大生物技术有限公司合成。
[0021] DNA序列为SEQ ID NO. 5正向引物：
[0022] 5' -ACCAATGACATGAAAAATCATCGTT-3'
[0023] DNA序列为SEQ ID NO. 6反向引物：
[0024] 5' -TCTCCATTTCTGGTTTACAAGAC-3'。
[0025] 4、PCR 扩增
[0026] PCR 反应扩增体积为 25 μ L，其中 10 X 缓冲液 2. 5 μ L，lOmmol/L dNTP 2 μ L， 25 μ mol/L的DNA序列为SEQ ID NO. 5的正向引物和DNA序列为SEQ ID NO. 6的反向引物 各 1 μ L，5U/ μ L Taq 酶 0· 2 μ L，模板 DNA 2 μ L，CldH2O 16. 3 μ L ;PCR 反应条件为：95°C预变 性5min，94°C变性30s，55°C退火60s，72°C延伸60s，35个循环，最后再72°C延伸10min。
[0027] 5、PCR产物检测
[0028] 取5 μ L PCR扩增产物，用1 %琼脂糖凝胶电泳（120V电压，电泳30min)。溴化乙 锭或Goldview核酸染料染色，荧光成像系统检测，检测结果见附图1。
[0029] 6、基因序列测定
[0030] 选取1到2个效果较好的PCR扩增产物送由生物公司纯化后测序（测序所用引物 与PCR所用引物相同），所得基因序列经拼接校正后即为目标鼠 cytB序列。
[0031] 7、序列分析
[0032] 将目标鼠 cytB序列在GenBank中与其他鼠 cytB基因序列进行Blast比对确定目 标鼠种属情况。将同类目标鼠 cytB序列进行比对分析，确定三峡库区主要鼠类cytB特征 序列。
[0033] 以下是三峡库区4种主要鼠类cytB特征序列
[0034] 黄胸鼠 cytB基因序列，SEQ ID NO. 1 :
[0035] ATGACAACATCCGAAAATCTCACCCCCTATTCAAAATCATCAACCACTCCTTTATCGACCTCCCCGCCC CATCTAACATCTCATCATGATGAAACTTCGGTTCTCTACTAGGAGTATGCCTCATAGTACAAATCCTCACAGGCTTA TTCCTAGCAATACACTACACGTCTGATACCATAACAGCATTTTCATCAGTCACCCACATCTGCCGAGACGTAAACTA CGGCTGACTAATCCGATACCTACACGCCAACGGCGCCTCAATATTTTTCATCTGCCTATTCCTCCATGTGGGACGAG GACTATACTATGGATCCTACACTTTCCTAGAAACCTGAAACATTGGGATCATTCTACTATTTGCAGTCATAGCAACT GCATTCATGGGCTATGTACTCCCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCTACAGTAATTACAAACCTATTATCAGC TATCCCTTACATTGGAACTACCCTAGTCGAATGAATCTGAGGAGGCTTCTCAGTAGACAAAGCAACCCTAACACGCT TCTTCGCATTCCACTTCATCCTCCCATTCATTATCGCCGCCCTTGCAATTGTACATCTTCTTTTCCTCCACGAAACA GGATCAAATAACCCCACAGGATTAAACTCCGACGCAGACAAAATCCCATTCCATCCATATTATACAATTAAAGACCT CCTAGGTGTATTTATATTACTATTATTCCTAATAACCCTAGTACTATTCTTCCCAGACCTACTAGGAGACCCAGACA ATTATACACCCGCTAACCCCCTCAACACCCCACCCCACATCAAACCAGAATGATATTTTCTCTTTGCCTACGCTATT CTACGCTCCATTCCCAACAAACTAGGAGGAGTCATAGCCCTAATCTTATCAATCCTAATCTTAGCCTTCCTACCATT CCTGCATACTTCAAAACAACGCAGCTTAACATTCCGCCCAATCACCCAAATCCTTTACTGAATCCTAGTAGCCAACC TCCTAGTCTTAACATGAATCGGAGGCCAACCAGTAGAACACCCATTTATCATTATTGGCCAACTAGCCTCCATCAGC TACTTTTCAATTATCCTCATTCTCATACCAATCTCTGGAATTGTTGAAGACAAAATGTTAAAATGAAAT
[0036] 小家鼠 cytB基因序列，SEQ ID NO. 2 :
[0037] GTAGCTACTGACAACATCCGAAAAACTCACCCCCTATTTAAAATCATTAACCACTCTTTCATCGACCTC CCTGCCCCATCTAACATCTCATCCTGATGAAACTTTGGCTCCCTCCTAGGTCTATGCCTCGTAATTCAAATTCTTAC AGGCTTATTCCTAGCCATACACTACACATCAGACACAATAACAGCATTTTCATCAGTTACACACATTTGCCGAGACG TAAACTATGGATGACTAATTCGATATATACACGCT