芝麻花序有限基因Sidt1及其SNP标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子遗传育种技术领域，具体涉及一种芝麻花序有限基因57出1及其 SNP 标记 5YDt27-l。
【背景技术】
[0002] 芝麻L，2n=26)是世界上最古老的优质油料作物之一，也是我 国的特色农产品，在食品加工中具有重要地位。自解放以来，我国共育成芝麻品种约140 个，在很大程度上推动了我国芝麻生产的快速发展。但是与其他油料作物相比，芝麻仍属于 低产作物。
[0003] 芝麻是花序无限型且生育期较短的农作物，通常我国芝麻品种的生育期在85-95 天。植株生长发育过程的表现主要包括：植株花序无限，花期较长，约为25-35天。下部蒴 果成熟开裂时，多数植株的顶端仍在进行花芽分化，植株蒴果成熟度不一致，从而影响到芝 麻的产量和产品质量。
[0004] 目前，在世界芝麻生产中，收获指数低、籽粒成熟度不一致、抗病抗逆性差等是限 制芝麻高产稳产的主要因素，开展高产高抗病抗逆、适于机械化生产的芝麻新材料创制和 新品种选育是当前我国芝麻育种研究工作的重点。
[0005] 在此背景下，自2007年起，河南省农业科学院芝麻研究中心积极开展了芝麻EMS 诱变育种和种质创制工作。2009年采用EMS诱变方法，从我国主导芝麻品种豫芝11号中诱 变创制出了花序有限型芝麻优异新品系，命名为豫芝DS899。该突变体在田间表现主要包括 以下方面：（1)植株单杆，一叶三花，蒴果四棱，下部叶片较大，叶片深绿、肥厚，叶绿素含量 高，光和效率强；（2)花序有限，植株具有典型的有限生长习性，株高130-150厘米；在黄淮 区，该品种生长发育形成15-20个节位后，植株顶端生长点停止生长并自动封顶；封顶后顶 端形成4-6个蒴果群；该特性受隐性单基因控制，能稳定遗传，繁殖后代中有限习性植株达 到98%以上；（3)该品系生长发育速度快，现蕾早，花期20-25天，结蒴集中，无空稍尖，生育 期80天左右；平均单株结蒴60-80个；平均蒴粒数50-55粒，千粒重4. 0-4. 5g，籽粒含油量 51. 43%，蛋白质含量26. 75% (2014年郑州收获种子)，属于高蛋白型优质育种新材料。（4) 品种对茎点枯病和枯萎病抗性高；适于密植和机械化管理与收获。
[0006] 除豫芝DS899外，在当前世界芝麻种质资源库中，还保存另一类花序有限型芝麻 种质（河南省农科院芝麻研究中心芝麻种质资源库存编号为08TP092)。该种质的田间性状 主要表现为：植株分支型，花序有限，蒴果节位数为2-3节，单株蒴果数30-40个，结蒴性低， 不适宜直接用于生产，该种质花序有限性状受单隐性基因控制。
[0007] 基于现有的有限花序的芝麻种质资源进行分析，对芝麻有限花序基因进行分析和 标记，对于培育新的芝麻种子资源具有十分重要研究和应用价值。
【发明内容】
[0008] 本发明主要目的是提供一种芝麻花序有限基因57出1的基因序列，同时提供了该 有限基因基因序列的cDNA序列；本发明另一目的是提供了对有限基因基因序 列的SNP标记5?Ζ??27-1，从而便于新品种的筛选和培育。
[0009] 下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。
[0010] 芝麻花序有限基因该基因有1809bp，包含4个外显子和3个内含子，位于 芝麻第4条染色体上，在芝麻SNP遗传图谱中的位置为第8连锁群，18. 0-19. 2cM，对花序有 限性状的解释率为100% (Vg/Vp);其DNA序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 芝麻花序有限基因的CDNA序列，长度为531 bp，编码176个氨基酸，具体如 SEQ ID. 2 所示。
[0012] 需要说明的是，与正常株（dtO)基因序列的唯一不同点就在于，花序有限基因 的cDNA序列中，第236位核苷酸由G突变成了 A ;当G变为A时，导致编码蛋白的第 79个氨基酸序列由丝氨酸（S)突变为了天冬酰胺（N)，植株花序就由无限（dtO型）变成了 dtl有限型。
[0013] 所述芝麻花序有限基因的SNP分子标记5YDt27-l，有92bp，为花序有限基 因中第378至469处碱基序列，具体序列为： CCTGATGTTCCTGGTCCTAATGATCCATATCTGAGGGAGCACCTGCACTGGTATGCTTTCATTTTTAACTGCT TAAGACCTGATTGATTTAA。
[0014] 利用所述SNP分子标记SiDt27-l检测芝麻花序有限基因57出1的检测方法，具体 包括以下步骤： (1) 提取待测芝麻种质资源的基因组DNA ; (2) 以步骤（1)中所提取DNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增时，采用如下引物序列： 正向引物 HSDtOl-IF 序列：5' CCTGATGTTCCTGGTCCGAA 3' ； 正向引物 HSDt01-2F 序列；5' CTATTCCTGATGTTCCTGGTCCGAG3' ； 反向引物 HSDtOl- R 序列：5' TAAATCAATCAGGTCTTAAGCAGT 3' ； 对PCR扩增产物进行凝胶电泳，判断待测芝麻种质资源的基因组DNA中是否含有SNP 分子标记SiDt27-l，判断规则如下： 如果仅含有SNP分子标记5YDt27-l标记位点，当采用引物HSDtOl-IF与HSDtOl- R配 对进行PCR扩增时，能扩增出条带大小为92bp的产物，则该待测种质属于dtl型，花序有 限，可用于培育花序有限型芝麻新品种； 如果不含有SNP分子标记5YDt27-l标记位点，当采用引物HSDtO 1-2F与HSDtOl- R配 对进行扩增时，能扩增出条带大小为97bp的产物，则该待测种质属于dtO型，花序无限，不 能用于培育花序有限型芝麻新品种； 如果所扩增条带大小既有92bp的产物，也有97bp的产物，则该待测种质属于杂合型， 花序无限，但其后代可以出现形状分离，从后代中可进一步获得花序有限型材料以便用于 新品种的培育； (3) 为进一步准确判断待测种质资源是否含有花序有限基因57出1，可以步骤（1)中所 提取的基因组DNA为模板，PCR扩增特定序列，PCR扩增时，采用如下引物序列： 正向引物 Dtl Primer F 序列为：5'_ ATGGCAAAAATGTCATCGGACC -3' ； 反向引物 Dtl Primer R 序列为：5'_ CTAGCGCCTTCTAGCAGCAGTC -3' ； 对PCR扩增产物进一步进行测序，并与花序有限基因的基因序列（即SEQ ID NO. 1中的序列)进行比对，如果相同，则待测种质属于花序有限，可用于培育新的芝麻品种。
[0015] 2012年，发明人将豫芝DS899 (单杆，节位15-20个）和08TP092 (分支，节位2-3 个）配置了杂交组合并调查了 Fl、F2代特征特性。结果显示，Fl后代均表现为花序有限， 节位3-5个；F2后代均表现为花序有限，节位3-15个不等。同其他研究结果相结合，发明 人认为，在豫芝DS899和08TP092两个花序有限型芝麻材料中，花序有限性状受同一基因位 点控制，但突变性状表现有一定差异。因此，推测2种花序有限型种质在花序有限基因的序 列上可能有一定差异。随之，将2个种质中的花序有限基因分别命名为57出7(来源于豫芝 DS899)和(来源于08TP092)。相应地，豫芝DS899和08TP092突变体分别为dtl型 和dt2型，花序无限型正常株为dtO型。
[0016] 后期研究结果显示，dtl型和dt2型有限种质之间的差异在于，基因在序列的 不同碱基片段发生了变异。2013年以来，发明人利用已构建的豫芝DS899(dtl型）XJS012 (dtO型）的F2群体，参考芝麻群体作图、芝麻基因组精细图和重测序技术（Zhang et al.， 2013; Miao and Zhang, 2014; Li et al·，2013)，成功克隆了豫芝 DS899 的花序有限基 因在芝麻基因组注释中，该基因命名为5? ?/7。最终，发明人确定了芝麻花序有限的 突变基因位点，为下一步探明芝麻花序发育调控机理、选育dtl型花序有限芝麻新品种奠 定了坚实基础，并较好地推动了芝麻分子辅助育种研究的发展。
[0017] 在此基础上，本发明针对获得的芝麻花序有限基因进行分子标记开发和应 用，为加快芝麻重要性状遗传基础和新品种选育提供技术支撑。
[0018] 本发明创新点主要体现在以下几个方面： (1) 本发明对花序有限型芝麻突变体豫芝DS899开展了基因组重测序和芝麻种质资源 遗传图谱构建，克隆提供了一种芝麻花序有限基因57出7,开发了其SNP标记5YDt27-l，同 时提供了一种鉴定种质资源中是否含有该基因及标记位点的PCR鉴定方法，该方法可以较 为便捷和快速地初步确定待测芝麻品种的花序类型，为新品种培育提供参考； (2) 本发明所获得的芝麻花序有限基因 57出7及SNP标记5YDt27-l序列明确，检测结 果稳定可靠；本发明所涉及的花序有限基因对芝麻产量、品质以及芝麻生产等具有重要影 响，并对开展芝麻等农作物花发育机理研究以及培育适于机械化生产的芝麻新品种具有重 要意义； (3) 本发明所提供的芝麻花序有限基因及其SNP标记5YDt27-l的检测方法，技 术成熟，检测结果稳定性好，对提高芝麻育种工作效率、提升我国芝麻遗传育种研究技术水 平具有重要意义。
[0019] 与现有芝麻育种方法相比，本发明优点可以概括为： (1) 本发明首次发现了芝麻花序有限基因 (2) 本发明开发了芝麻花序有限基因的SNP标记5YDt27-l，为分