0mmol/L的Tris-HCl(Trishydroxymethylaminomethane，即三轻甲基氨基甲烧盐酸盐 溶液）、浓度为30mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0. 2% 的曲拉通溶液和体积比为10%的甲酰胺溶液。
[0046] 更进一步，本发明实施例提供的检测试剂盒中的脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、 dCTP、dGTP、dUTP或dTTP。
[0047] 本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒还包括酶 混合液，所述酶混合液包括1U/μ1~5U/μ1的耐热DNA聚合酶（Taq酶）和(λ05U/μ1~ 0. 2U/μ1尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）。酶混合液中的UNG酶能够降解含dU的DNA链， 而dUTP与UNG酶的组合使用能够预防前次PCR产物的污染，防止样本检测假阳性。
[0048] 优选地，本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒 还包括阳性对照，该阳性对照为包含内标目的序列片段的质粒和BCR-ABL融合基因T315I 突变位点所在区域片段质粒的混合物。
[0049] 优选地，本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒 还包括阴性对照，该阴性对照为灭菌水稀释的内标目的序列片段的质粒。
[0050] 本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒用于检测 石蜡切片所提取的核酸样本中的BCR-ABL融合基因突变情况的操作步骤为：
[0051] S01 :取出包装盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，将各组分分别混 匀，备用；
[0052]S02:根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，取体积比为43 :2的T315I突变 检测反应液和酶混合液，充分混和均匀并形成PCR-mix，瞬时离心后备用；
[0053]S03:使用商业化的石蜡切片核酸提取试剂盒提取DNA，备用；
[0054] S04 :根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量向每个反应管中加入45μ1的 PCR-mix，并取步骤S03备用的的样本DNA、阴性对照、阳性对照各5μ1加入到上述PCR-mix 中，盖好管盖，形成待测样品；
[0055]S05:将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪上进行测试。
[0056] 进一步，将待测样品放置在荧光定量PCR扩增仪（以ABI7500仪器为例）上进行 测试包括以下步骤：
[0057] (1)将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置待测样本名称浓度；
[0058] (2)焚光检测通道选择：选择FAM通道（Reporter:FAM,Quencher:None);内标选 择HEX或VIC通道（Reporter:VIC,Quencher:None)。参比焚光（PassiveReference)设置 为R0X〇
[0059] (3)荧光定量PCR反应条件请参见表1。
[0060] 表1 :荧光定量PCR反应条件
[0061]
[0062] (4)设置完毕，保存文件，运行反应程序。
[0063] 结果分析
[0064] 反应结束后，仪器自动保存结果，可以利用仪器自带的软件进行自动分析（也可 以手动调苄基线的开始值、结束值以及阈值线值进行分析），然后记录样本Ct值和结果。扩 增曲线与阈值线的交点，称为Ct(即cyclethreshold，指PCR反应管内的荧光信号达到设 定的阈值时所经历的循环数值）；仪器软件根据各样本Ct值大小，可以判断检测结果。如 果样本扩增曲线呈S型，有Ct值且Ct值< 39,可判断为阳性；如果样本扩增曲线平直，且 无Ct值显示（Undet)显示，可以判为阴性。
[0065] (1)特异性试验
[0066] 使用本发明实施例提供的检测试剂盒对阴阳性企业工作参考品进行了检测，在本 次试验中，阴性工作参考品是浓度为25ng/μL的野生型人DNA;阳性工作参考品是浓度分 别为 6000copies/μL、1500copies/μL和 112. 5copies/μL的Τ315Ι突变质粒。通过上述 测试所得到的检测结果为阴阳性参考品符合率为100 %，符合质量标准，这说明本发明实施 例提供的检测试剂盒具有很好的特异性。
[0067] (2)精密度试验
[0068] 本发明实施例提供的检测试剂盒对弱阳性精密度参考品和强阳性精密度参考品 分别进行荧光PCR反应测试，且该测试每组重复10次，反应的测试结果请参考附图1和附 图2。在本试验中，弱阳性精密度参考品为野生型人DNA和Τ315Ι突变质粒的混合物，其中 丁3151突变的百分率为1.5%;强阳性精密度参考品为野生型人0嫩和13151突变质粒的混 合物，其中含Τ315Ι突变的百分率为80%。从附图1和附图2中能够看出，两次测试均出 现Ct值，且附图1中的Ct值从33-45具有很好的扩增曲线，附图2中的Ct值从25-45具 有很好的扩增曲线，且线性范围良好，批内和批间的重复性好，ct值的变异系数均〈5%，由 此可以说明本检测试剂盒具有很好的精密度。
[0069] (3)灵敏度及野生型耐受性
[0070] 请参考附图3和附图4，附图3和附图4示出了本发明实施例提供的BCR-ABL融合 基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒对野生型人DNA和含1 %T315I突变的人DNA进行荧 光PCR反应测试的扩增曲线图。
[0071] 从附图3中可以看出，本发明实施例提供的检测试剂盒通过对野生型人DNA进行 荧光PCR反应测试时未见扩增曲线，且符合率为100%。从附图4中可以看出，本发明实施 例提供的检测试剂盒通过对含1%T315I突变的人DNA进行荧光PCR反应测试时出现明显 的扩增曲线，且扩增曲线的重复性很好，且符合率为100%。通过上述两项测试的比较可以 得出，本发明实施例提供的检测试剂盒不能检测出野生型人DNA，且在人DNA的T315I突变 浓度很小的情况下仍能检测出，并出现扩增曲线，由此可以说明本发明所提供的检测试剂 盒具有较高的灵敏度以及极强的抗干扰能力，大大降低了假阳性率，从而达到直接区分突 变型和野生型基因的目的。
[0072] 本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒包括 T315I突变检测反应液，且所述T315I突变检测反应液包括10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷 三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的特异性引物ARMS的上游引物以及下游引物和用于检测靶 多核苷酸的探针。本发明所提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒是基 于实时荧光定量PCR技术和ARMS-PCR技术的检测试剂盒，本检测试剂盒能够在50ng/反应 的野生型DNA背景下实现1%突变型人T315I基因100%检出且野生型人ABL基因零检出， 从而说明本检测试剂盒具有很好的特异性以及极强的抗干扰能力，大大降低了假阳性率， 且操作快速、方法简便、检测精度高，同时在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假 阴性。本发明实施例提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒在批内和批 间的重复性好，且Ct值的变异系数〈5 %。
[0073] 以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明 的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂 盒包括T315I突变检测反应液，且所述T315I突变检测反应液包括10XPCR缓冲液、脱氧核 糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探 针； 所述用于检测靶多核苷酸的探针的碱基对序列为： 5' FAM-TTCATGACCTACGGGAACCTCCTGGA-BHQ13'。2.根据权利要求1所述的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物的碱基对序列为： 上游引物：5' -GAGCCCCCGTTCTATATCATGAT-3'； 下游引物：5' -AGCACCACGGCGTTCACC-3'。3.根据权利要求2所述的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述检测试剂盒还包括内标，所述内标为BCR-ABL融合基因中ABL基因4号外显子， 且所述内标的序列为： 5' -GCCGAGTTGGTTCATCATCATTCAACGGTGGCCGACGGGCTCATCACCACGCTCCATTATCCAGCCCCAA AGCGCAACAAGCCCACTGTCTATGGTGTGTCCCCCAACTACGACAAGTGG-3'。4.根据权利要求3所述的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述T315I突变检测反应液还包括用于检测内标的探针，所述检测内标的探针的碱 基对序列为： 5' HEX-CACGCTCCATTATCCAGCCCCAAA-BHQ13'。5.根据权利要求4所述的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述T315I突变检测反应液还包括用于扩增内标的上游引物以及下游引物；所述上 游引物以及下游引物的碱基对序列为： 上游引物：5' -GCCGAGTTGGTTCATCATCATT-3'； 下游引物：5' -ATAGACAGTGGGCTTGTTGCG-3'。6.根据权利要求5所述的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述10XPCR缓冲液包括pH值为7. 5的200mmol/L的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶 液、浓度为30mmol/L的氯化镁溶液、浓度为500mmol/L的氯化钾溶液、体积比为0.2%的曲 拉通溶液和体积比为10%的甲酰胺溶液。7.根据权利要求5所述的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述脱氧核糖核苷三磷酸为dATP、dCTP、dGTP、dUTP或dTTP。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试 剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包括酶混合液，所述酶混合液包括1U/ μ 1~5U/ μ 1 的耐热DNA聚合酶和0. 05U/ μ 1~0. 2U/ μ 1尿嘧啶DNA糖基化酶。9.根据权利要求8所述的BCR-ABL融合基因Τ315Ι突变荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述检测试剂盒还包括阳性对照，所述阳性对照为包含内标目的序列片段的质粒和 BCR-ABL融合基因T315I突变位点所在区域片段质粒的混合物。10.根据权利要求8所述的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述检测试剂盒还包括阴性对照，所述阴性对照为灭菌水稀释的内标目的序列片段 的质粒。
【专利摘要】本发明提供了一种BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒，所述检测试剂盒包括T315I突变检测反应液，且所述T315I突变检测反应液包括10×PCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、用于扩增靶多核苷酸的上游引物以及下游引物和用于检测靶多核苷酸的探针。本发明所提供的BCR-ABL融合基因T315I突变荧光PCR检测试剂盒是基于实时荧光定量PCR技术和ARMS-PCR技术的检测试剂盒，该检测试剂盒具有很好的特异性，且操作快速、方法简便、检测精度高，同时在反应体系中增加的内标能够有效防止检测呈假阴性。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105349681
【申请号】CN201510888491
【发明人】戴立忠, 吴康, 汤链, 黄临迷
【申请人】湖南圣维基因科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月7日