专利名称：一种生物法生产γ-环糊精的生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物法生产Y-环糊精的生产工艺，属于环糊精生产技术领域。
背景技术：
环糊精(Cyclodextrins，通常简称为⑶)，是一类由淀粉或多糖在环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的由D-吡喃葡萄糖单元通过α -1,4-糖苷键首尾相连的环状化合物的总称，常见的有6、7和8个葡萄糖单元的分子，分别称为α-、β-和Y-环糊精。环糊精由于其结构的特殊性，可以包埋许多有机物和无机化合物，作为品质改良剂、稳定剂、药物的载体和吸附剂等，所以它在食品、医药、化学、分析化学、农业环保、纺织技术和生物技术等领域都具有广泛的应用。三种常用的环糊精中，β_环糊精水溶解度最小，易于通过分步结晶的方法制得，因此β_环糊精目前在生产中被大量制备和广泛应用，但是β_环糊精 由于溶解度小使其在对药物包合作用方面的应用受到限制，目前科技工作者正致力于提高β-环糊精的溶解度。尽管α-环糊精的需求很大，应用前景看好，但是由于现有CGTase生产α-环糊精时转化率低，产物特异性差，且α-环糊精的溶解度相对较高，不容易通过浓缩、结晶的方法从反应液中分离纯化出来，因此造成生产成本太高，大大限制了其工业大规模应用。相比于α -和β -环糊精，γ -环糊精由于具有更高的溶解度和更大的空腔，能够包接分子量更大的化合物从而增加化合物的溶解度，改善化合物的乳化性等，且毒性最小，刺激性也很小，安全性高。在食品、医药等领域已显示出巨大的优势。虽然市场对Y-环糊精产品需求量大，但由于Y-环糊精转化效率低，导致Y-环糊精价格昂贵，大大限制了它的应用。目前国外也只有Wacker和Cyclolab等少数几家公司生产Y-环糊精，而且产量非常有限。生产Y-环糊精方法目前只有生物法，有关生物法制备α-和环糊精的报道较多，但是关于生物法生产Y-环糊精的报道较少，曹新志等在制备Y-环糊精时，选用来源广、价格便宜的甘薯淀粉为底物，配制5% (w/v)的淀粉液，加入适量来源于Bacillusalcalophilus的Y -CGTase粗酶液后测定Y -环糊精的产量，结果发现甘薯淀粉的转化率最高约为30%，但是后续分离非常困难。(曹新志.环糊精葡萄糖基转移酶和Y-环糊精生物合成的研究[D].无锡，江南大学，2005)。在添加有机溶剂条件下，国外文献报道最高转化率也仅为40%左右。目前生物法生产Y-环糊精的主要问题在于一、缺少性质优良并且具有高酶活的Y-环糊精葡萄糖基转移酶(Y-CGTase) ;二、缺少Y-环糊精相应的生产工艺，针对Y -环糊精在水中溶解度较高的问题，需要制定一套经济高效的分离提取方法。
发明内容
本发明所解决的技术问题是提供了一种生物法生产Y-环糊精的工艺，降低了Y-环糊精的生产成本。为解决上述问题，本发明技术方案为采用来源于嗜碱芽胞杆菌的Y-环糊精葡萄糖基转移酶生产Y-环糊精；按照10-15%的浓度进行淀粉调浆，在60-90°C条件下搅拌5-15分钟；设定温度40-60°C，调ρΗΙΟ. O左右后，按照每克淀粉1-10个单位的量加入Y -环糊精葡萄糖基转移酶，加入2-5% (w/v)的有机溶剂后，充分反应8-10小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到Y-环糊精。所述微生物发酵生产Y -CGTase的方法为，在一定培养条件下，以E. coliBL21(DE3)/pET20b (+)-Y-CGTase (纪丽萍，吴丹，吴敬，陈坚·重组大肠杆菌产Y-环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化中国生物工程杂志，2011,31(10) 50-56)发酵一定时间，得到含有Y-CGTase的发酵液，经过高速离心，去除菌体，上清即为粗酶液。所述在60_90°C条件下搅拌5-15分钟淀粉调浆的目的在于使淀粉颗粒充分溶胀。所述Y -CGTase的最适反应温度为40_50°C左右，温度通过影响酶对底物的催化效率，从而影响酶的活力，温度过高或过低都会影响酶的作用效果。从降低生产成本考虑，生产工艺的温度不应过高或者过低，以降低加入的酶量，从而降低生产成本。
所述Y -CGTase的最适pH范围为10. 5-11. O, Y -CGTase的活力受pH影响较大，考虑到降低成本，应该将生产工艺的pH选定在酶最适反应pH附近。所述γ-CGTase活力的测定采用溴甲酚绿(BCG)分光光度法在酸性条件下，溴甲酚绿呈现多个不同吸收峰，当加入Y-环糊精时，溴甲酚绿溶液呈现增色效应，最大增色波长为630nm。在波长630nm，一定浓度范围内，溴甲酚绿的增加吸光光度值(ΛΑ)与Y-CGT浓度之间存在着线性关系。将适当稀释的发酵上清液加入预先用50mmol/L Gly-NaOH缓冲液(ρΗΙΟ.Ο)配制的1% (w/v)可溶性淀粉溶液的试管中，在40°C下反应IOmin后，加入50 μ L L0mol/L的盐酸终止反应，再加入2mL0.2mol/L柠檬酸缓冲液(ρΗ4· 2)和80 μ L5mmol/L的溴甲酹绿,室温静置20min左右,在波长630nm下测定吸光度。一个酶活单位(U)定义为在上述条件下每分钟生成Ιμηιο 的Y-环糊精所需的酶量。所述α-、β-和Y -环糊精的分析采用高效液相色谱法。色谱条件:Waters 600HPLC 色谱仪，Waters 自动进样器，色谱柱 ZORBAX NH2 (4. 6mmX 150mm), Waters2410 示差检测器；流动相(v/v)为75%乙腈水溶液，流速I. OmL/min ;柱温40°C。处理样品时，8000r/min离心15min,弃沉淀,上清液中加入0. ImLa-淀粉酶液作用Ih, 0. 45 μ m超滤膜过滤后取10 μ L上机分析。所述有机溶剂为环十二酮。环十二酮不仅能与Y-环糊精特异性的形成包络物沉淀从而提高淀粉总的转化率，而且环十二酮价格相对较低，沸点低，可以通过水蒸气蒸馏几乎全部除去，极少残留在最终的产品中。所述回收有机溶剂，通过结晶手段得到Y-环糊精的具体方法为待反应结束后，将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括未反应的淀粉和有机溶剂与Y-环糊精形成的络合物沉淀；将滤饼用水复溶，然后通过水蒸气蒸馏的方法分离有机溶剂和Y-环糊精。蒸馏结束后，过滤蒸馏液以除去未反应的淀粉，即可得到Y-环糊精的水溶液。最后，将水溶液旋转蒸发浓缩，低温放置得到Y-环糊精的结晶。本发明的技术原理如下γ -CGTase除了能与淀粉发生环化反应产生Y -环糊精外，还能发生偶合、歧化和水解反应，偶合反应是环化反应的逆反应，该反应是打开环糊精的环，然后转移到直链低聚糖上。在一定浓度麦芽低聚糖或葡萄糖等小分子糖的存在条件下，Y -CGTase的环化反应受到抑制，影响最终收率。本发明直接采用糊化的淀粉来生产环糊精，在中温搅拌的条件下，淀粉颗粒充分溶胀，解除了小分子糖对环化反应的抑制，提高了 Y-CGTase的转化率。由于Y-环糊精可以与有机物形成不溶于水的包络物，添加一定比例的有机溶剂可以连续地从反应系统中去除环糊精，使反应向着环糊精的生成方向不断进行，有利于环糊精生产，同时解除了 Y -环糊精对Y -CGTase的产物抑制作用。本发明是根据Y-CGTase以及产物Y-环糊精的特点生产Y-环糊精的工艺，相对于现有技术，具有以下优点I)提供一种高转化率、低成本的Y-环糊精的生产方法，填补了该技术领域内的空白，为生物法大规模生产Y-环糊精奠定基础；2)本反应总的反应周期短，只需要8-10小时；3)酶反应的温度比较低，不需要进行剧烈的温度变化，低能耗，适合工业化生产；
4)直接利用原淀粉作为底物，解除了葡萄糖、麦芽糖等小分子糖对Y-环糊精的生成的抑制作用；添加一定比例的有机溶剂，连续地从反应系统中去除Y-环糊精，使其向生成Y-环糊精的方向不断进行，提高了 Y-环糊的转化率，总转化率最高可达到60%左右，其中Y -环糊精和β -环糊精的比例约为9:1。5)有机溶剂去除过程方法简单，得到的产品纯度高，杂质少，可达90%左右，有机溶剂残留量可用于医药行业等。总体来讲，本发明具有生产周期短、原料转化率高、产品纯度高、工艺流程简、生产成本低等优点。
具体实施例方式实施例I :原料预处理按照10%的浓度进行马铃薯淀粉调浆，在65°C条件下搅拌10分钟，使淀粉颗粒充分吸水溶胀；酶法生产工艺预处理后将温度设定为50°C，调ρΗΙΟ. O后，按照每克淀粉6个单位的比例加入Y-CGTase,然后加入5% (w/v)的环十二酮后,充分反应9h ;Y-环糊精的提取工艺沸水浴灭酶后，将反应液过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括环十二酮与Y-环糊精形成的沉淀以及未反应的淀粉；将滤饼重新用水复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去环十二酮，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到Y -环糊精的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到Y-环糊精的结晶。所述α _、β -和Y -环糊精的分析采用高效液相色谱法。色谱条件=Waters 600HPLC色谱仪，Waters自动进样器，色谱柱ZORBAX NH2 (4. 6mmX 150mm)，Waters2410示差检测器；流动相(v/v)为75%乙腈水溶液，流速I. OmL/min ;柱温40°C。处理样品时，8000r/min离心15min,弃沉淀,上清液中加入O. ImLa-淀粉酶液作用Ih, O. 45 μ m超滤膜过滤后取10 μ L上机分析。结果见表I，淀粉总转化率可达60%，产品中Y-CGT所占比例为55. 4%，β -CGT 占 4· 6%，表I不同实施例下Y-CGT的生产情况
权利要求
1.一种生物法生产Y-环糊精的生产工艺，其特征在于，采用来源于嗜碱芽胞杆菌(Alkalophilic Bacillus clarkii 7364)的Y -环糊精葡萄糖基转移酶生产Y-环糊精；按照10%的浓度进行淀粉调浆，在60-90°C条件下搅拌5-15分钟；设定温度40_60°C，调ρΗΙΟ. O左右后，按照每克淀粉1-10个单位的量加入Y -环糊精葡萄糖基转移酶，加入2-5% (w/v)的有机溶剂后，充分反应8-10小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到Y-环糊精。
2.根据权利要求I所述的生产工艺，其特征在于所述回收有机溶剂、结晶方法为将反应液直接过滤，滤饼用蒸馏水清洗2-3次，收集滤饼，其中包括有机溶剂与Y -环糊精形成的络合物沉淀以及没有反应的淀粉；将滤饼重新复溶，然后采用水蒸气蒸馏除去有机溶剂，待蒸馏结束后，过滤蒸馏液除去没有反应的淀粉，即可得到Y -环糊精的水溶液；将水溶液蒸发浓缩，低温放置即可得到Y-环糊精的结晶。
3.根据权利要求I或2所述的生产工艺，其特征在于，所述的有机溶剂为环十二酮。
全文摘要
本发明涉及一种生物法生产γ-环糊精的生产工艺，属于环糊精生产技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种生物法生产γ-环糊精的工艺，降低了γ-环糊精的生产成本，技术方案为采用来源于嗜碱芽胞杆菌的γ-环糊精葡萄糖基转移酶生产γ-环糊精；按照10％的浓度进行淀粉调浆，在60-90℃条件下搅拌5-15分钟；设定温度40-60℃，调pH10.0左右后，按照每克淀粉1-10个单位的量加入γ-环糊精葡萄糖基转移酶，加入2-5％(w/v)的有机溶剂后，充分反应8-10小时；回收有机溶剂，采用结晶方法得到γ-环糊精。
文档编号C12P19/18GK102827900SQ201210347398
公开日2012年12月19日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者吴敬, 王磊, 吴丹, 陈坚 申请人:江南大学