专利名称：一种利用高粱粉发酵生产柠檬酸的方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵领域，具体地说，涉及一种利用高粱粉发酵生产柠檬酸的方法。
背景技术：
天然柠檬酸在自然界中分布很广。在植物如柠檬、柑橘、菠萝等果实和动物的骨骼、肌肉、血液中都含有柠檬酸。1784年C.W.舍勒首先从柑橘中提取柠檬酸。他是通过在水果榨汁中加入石灰乳以形成柠檬酸钙沉淀的方法制取柠檬酸的。发酵法制取柠檬酸始于19世纪末。1893年C.韦默尔发现青霉(属)菌能积累柠檬酸。1913年B.扎霍斯基报道黑曲霉能生成柠檬酸。1923年美国菲泽公司建造了世界上第一家以黑曲霉浅盘发酵法生产柠檬酸的工厂。随后比利时、英国、德国、苏联等相继研究成功发酵法生产柠檬酸。1952 年美国迈尔斯试验室采用深层发酵法大规模生产柠檬酸。此后，深层发酵法逐渐建立起来。深层发酵周期短，产率高，节省劳动力，占地面积小，便于实现仪表控制和连续化，现已成为柠檬酸生产的主要方法。中国最早使用发酵法制取柠檬酸的报道为1942年汤腾汉等。1966年后，天津市工业微生物研究所、上海市工业微生物研究所相继开展用黑曲霉进行薯干粉原料深层发酵柠檬酸的试验研究，并获得成功，从而确定了国内通过微生物发酵生产柠檬酸的主要工艺路线。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用高粱粉发酵生产柠檬酸的新方法。为了实现本发明目的，本发明的一种利用高粱粉发酵生产柠檬酸的方法，发酵所采用的微生物为黑曲霉(Aspergillus niger)，发酵培养基的主要原料为液化高粱粉。前述方法中，发酵培养基中还添加了液化玉米粉，且液化高粱粉和玉米粉的重量比为 19-16 1-4。前述方法中，发酵培养基中还添加了氮源。所述氮源为无机氮源，如硫酸铵和/或尿素等。前述方法中，发酵培养基中的高粱粉和玉米粉预先经过液化。液化时添加α-淀粉酶。前述方法中，发酵使用的菌株优选为黑曲霉(Aspergillus niger)FYCA2358。现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2012年8月21日，保藏号CGMCCNO. 6465。发酵条件为温度35 38°C，通入空气与发酵醪液的体积比为(O. I O. 8) 1，转速200 400rpm，发酵50 65小时。前述方法中，发酵培养基中的主要原料高粱粉为高粱经过粉碎后过80目筛。
本发明的目的还可以采用以下的技术措施来进一步实现。包括步骤I)高粱原料预处理高粱先经过粉碎，粉碎后过80目筛。高粱粉加水调浆，按种子罐15 20%的粉浆比、发酵罐25 35%的粉浆比进行配制。2)种子培养将含15 20%的粉浆比的高粱粉液化液作为种子培养基接入黑曲霉孢子，进行种子培养，培养成黑曲霉液体种子。3)发酵培养将培养好的黑曲霉液体种子接入含25 35%的粉浆比的高粱粉液化液的发酵培养基中进行培养。本发明柠檬酸发酵生产菌株可以为黑曲霉FYCA2358或其它黑曲霉菌株。其中，步骤I)中，所述粉浆比是指在100克水中含有的高粱粉的重量(克)。步骤2)中，种子培养基的组成为高粱粉按15 20%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按15 20%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为1-2 4-3。加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入种子罐中灭菌后接种培养。种子培养条件为37°C下通风培养24 30小时。步骤3)中，发酵培养基的组成为高粱粉按25 35%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按25 35%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为19-16 1_4。加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入发酵罐进行发酵。在发酵培养基中可以添加适量的无机氮源，例如硫酸铵、尿素等。所述发酵温度为35 38°C，通入空气与发酵醪液的体积比为(O. I O. 8) 1，搅拌转速为200 400rpm，培养50 65小时，pH值自然。可发酵性还原糖基本耗完后放罐。通过对培养基的优化发现，檬酸发酵的种子培养基以玉米粉培养基为优选，但在实际发酵中发现如果种子培养基只有玉米粉，进入发酵罐后在以高粱粉为主要原料的培养基中适应期比较长，从而延长发酵周期。因此在种子培养基中以玉米粉为主，适量添加高粱粉，菌球生长速度快，适应力增加，缩短了发酵周期。在柠檬酸的发酵培养基中同样添加了适量的玉米粉，其主要作用是调节发酵过程中适宜的碳氮源比例，提高了糖酸代谢速度，有效缩短发酵周期。经过实验发现，利用高粱为原料发酵生产柠檬酸，发酵结束时醪液中柠檬酸酸度可以达到12 15%，糖酸转化率大于90%。本发明方法是以黑曲霉为生产菌株接入以高粱粉为主要碳源的液体发酵培养基中进行柠檬酸的发酵生产，在发酵罐中进行通风培养，发酵液经过提取后可获得无水柠檬酸或一水柠檬酸结晶。采用本发明方法生产柠檬酸，成本低、产率高、质量稳定、生产周期短，是非粮生产柠檬酸的一条重要替代途径，尤其在南美等国家非常适用。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中涉及到的百分号“％”，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指IOOml溶液中含有溶质的克数。以下实施例中使用的黑曲霉(Aspergillus niger)FYCA2358，保藏号为CGMCCNo. 6465。
实施例I将柠檬酸生产菌种黑曲霉FYCA2358孢子接入灭菌后的种子培养基中。种子培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按15%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按15%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为I : 4，加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入种子罐中灭菌。种子培养条件为37°C下通风培养28小时。待液体种子培养结束后,接入灭菌后的发酵培养基培养。发酵培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按25%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按25%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为4 I。加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入500L发酵罐灭菌后进行发酵。在发酵培养基中添加O. 1%硫酸铵的无机氮源。所述发酵温度为36°C，通入空气与发酵醪液的体积比为O. 2 1，搅拌转速为400rpm,培养65小时，pH值自然。可发酵性还原糖基本耗完后放罐。发酵结束时发酵醪液中柠檬酸酸度为12. 5%，糖酸转化率92%。实施例2 将柠檬酸生产菌种黑曲霉FYCA2358孢子接入灭菌后的种子培养基中。种子培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按15%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按15%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为3 7。加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入种子罐中灭菌。种子培养条件为37°C下通风培养28小时。待液体种子培养结束后,接入灭菌后的发酵培养基培养。发酵培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按25%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按25%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为4 I。加入α -淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入500L发酵罐灭菌后进行发酵。在发酵培养基中添加O. 1%硫酸铵的无机氮源。所述发酵温度为36°C，通入空气与发酵醪液的体积比为O. 4 1，搅拌转速为400rpm，培养67小时，pH值自然。可发酵性还原糖基本耗完后放罐。发酵结束时发酵醪液中柠檬酸酸度为12.4%，糖酸转化率92.5%。实施例3将柠檬酸生产菌种黑曲霉FYCA2358孢子在无菌状态下接入灭菌后的种子培养基中。种子培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按15%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按15%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为I : 4，加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入种子罐中灭菌。种子培养条件为37°C下通风培养28小时。待液体种子培养结束后,接入灭菌后的发酵培养基培养。发酵培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按25%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按25%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为9 I。加入α -淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入500L发酵罐灭菌后进行发酵。在发酵培养基中添加1%硫酸铵的无机氮源。所述发酵温度为36°C，通入空气与发酵醪液的体积比为O. 6 1，搅拌转速为400rpm,培养61小时，pH值自然。可发酵性还原糖基本耗完后放罐。发酵结束时发酵醪液中柠檬酸酸度为14. I%，糖酸转化率92. 5%。实施例4将柠檬酸生产菌种黑曲霉FYCA2358孢子在无菌状态下接入灭菌后的种子培养基中。种子培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按15%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按15%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为I : 4，加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入种子罐中灭菌。种子培养条件为37°C下通风培养28小时。待液体种子培养结束后,接入灭菌后的发酵培养基培养。发酵培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按25%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按25%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为4 I。加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入60m3发酵罐灭菌后进行发酵。在发酵培养基中添加0.1%硫酸铵的无机氮源。所述发酵温度为36°C，通入空气与发酵醪液的体积比为0.8 1，搅拌转速为400rpm,培养65小时，pH值自然。可发酵性还原糖基本耗完后放罐。
发酵结束时发酵醪液中柠檬酸酸度为14. 5%，糖酸转化率93%。实施例5将柠檬酸生产菌种黑曲霉FYCA2358孢子在无菌状态下接种灭菌后的种子培养基中。种子培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按15%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按15%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为I : 9。加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入种子罐中灭菌。种子培养条件为37°C下通风培养28小时。待液体种子培养结束后,接入灭菌后的发酵培养基培养。发酵培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按25%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按25%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为4 I。加入α -淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入500L发酵罐灭菌后进行发酵。在发酵培养基中添加1%硫酸铵的无机氮源。所述发酵温度为36°C，通入空气与发酵醪液的体积比为O. 5 1，搅拌转速为300rpm,培养69小时，pH值自然。可发酵性还原糖基本耗完后放罐。发酵结束时发酵醪液中柠檬酸酸度为12.5%，糖酸转化率92%。实施例6将柠檬酸生产菌种黑曲霉FYCA2358孢子在无菌状态下接种灭菌后的种子培养基中。种子培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按15%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按15%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为I : 4，加入α-淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入种子罐中灭菌。种子培养条件为37°C下通风培养28小时。待液体种子培养结束后,接入灭菌后的发酵培养基培养。发酵培养基的配制为高粱粉(过80目筛)按25%的粉浆比用自来水配制，玉米粉按25%的粉浆比用自来水配制。其中高粱粉与玉米粉的重量比为4 I。加入α -淀粉酶进行液化(完全液化的标准为碘液测试不变蓝)后，进入60m3发酵罐灭菌后进行发酵。在发酵培养基中添加0.1%硫酸铵的无机氮源。所述发酵温度为36°C，通入空气与发酵醪液的体积比为0.6 1，搅拌转速为300rpm，培养72小时，pH值自然。可发酵性还原糖基本耗完后放罐。发酵结束时发酵醪液中柠檬酸酸度为15. I%，糖酸转化率92. 7%。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种利用高粱粉发酵生产柠檬酸的方法，发酵所采用的微生物为黑曲霉(Aspergillus niger),其特征在于，以液化高粱粉作为发酵培养基的主要原料。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，发酵培养基中还添加了液化玉米粉。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，发酵培养基中还添加了氮源。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述氮源为无机氮源。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述无机氮源为硫酸铵和/或尿素。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用α-淀粉酶进行液化。
7.根据权利要求2-6任一项所述的方法，其特征在于，发酵培养基中液化高粱粉和玉米粉的重量比为19-16 1-4。
8.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，发酵菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)FYCA2358，保藏号为 CGMCC No. 6465。
9.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，发酵条件为温度35 38°C，通入空气与发酵醪液的体积比为(O. I O. 8) 1，转速200 400rpm，发酵50 65小时。
10.黑曲霉(Aspergillusniger)FYCA2358，其保藏号为 CGMCCNo. 6465。
全文摘要
本发明提供了一种利用高粱粉发酵生产柠檬酸的方法，以黑曲霉为生产菌株，将其接入以高粱粉为主要碳源的液体发酵培养基中进行柠檬酸的发酵生产，在发酵罐中进行通风培养，发酵液经过提取后可获得无水柠檬酸或一水柠檬酸结晶。采用本发明方法生产柠檬酸，成本低、产率高、质量稳定、生产周期短，是非粮生产柠檬酸的一条重要替代途径，尤其在南美等国家非常适用。
文档编号C12P7/48GK102864185SQ201210347960
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月19日 优先权日2012年9月19日
发明者李荣杰 申请人:安徽丰原发酵技术工程研究有限公司