一种细菌结合蛋白、其编码基因、以此基因为目的基因生产的融合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种细菌结合蛋白、其编码基因、以此基因为目的基因生产的融合蛋白及其应用，此融合蛋白可结合细菌。本发明的细菌结合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；该细菌结合蛋白的编码基因的DNA序列如SEQ?ID?NO：1所示；该基因是以白氏文昌鱼的cDNA为模板合成的。本发明提供的以细菌结合蛋白编码基因为目的基因生产的重组融合蛋白可识别并结合不同的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，且结合作用明显，考虑其可应用于开发辅助治疗感染性疾病的药物。
【专利说明】—种细菌结合蛋白、其编码基因、以此基因为目的基因生产的融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种细菌结合蛋白、其编码基因、以此基因为目的基因生产的重组融合蛋白以及该重组融合蛋白的应用。
【背景技术】
[0002]文昌鱼在分类上属于脊索动物门(Chordata)头索动物亚门(Cephalochordata)头索纲鳃口科文昌鱼属，自五亿年前出现至今一直保持着古老的特性及原始的性状，因此被认为是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类型，其形体结构、发育模式和基因组都是脊椎动物最简单模型的代表。近几年的研究表明文昌鱼，除了作为传统的发育生物学研究的模式生物外，正在成为研究免疫系统的理想实验动物模型。
[0003]中国2013年 2月13日公开的专利CN102925449A报道了一种细胞内信号传导蛋白BbSma6/7及其编码基因，该基因来自青岛文昌鱼，其可从理论上提高对免疫系统构成和免疫应答机制的认识，为在基因水平开发细菌防治药物奠定基础。
[0004]现有技术中，中国2013年5月22日公开的专利CN103114094A报道了文昌鱼细胞核内蛋白AmphiAkirin及其编码基因，AmphiAkirin蛋白在细菌冲击成体文昌鱼后表达出现上调，在防治细菌内的浸染方面提供理论依据4!11?1^41^1^11蛋白可以激活即-1^8信号通路，为病害的免疫防治技术提供理论依据和基因来源。
[0005]先天免疫中NF-K B信号通路发挥着重要的作用，它在参与免疫应答和炎症反应过程中通过调节多种效应分子的表达来控制免疫系统的运作。本发明将进一步以文昌鱼为模型，研究新的与NF-κ B信号通路有关的基因及其编码的蛋白，并研究此基因在先天免疫中的功能。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题在于提供一种白氏文昌鱼体内的新细菌结合蛋白、编码该细菌结合蛋白的基因以及该基因的制备方法。
[0007]本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种以上述细菌结合蛋白编码基因为目的基因生产重组融合蛋白的方法以及由该方法生产的重组融合蛋白。
[0008]本发明进一步要解决的技术问题在于提供上述重组融合蛋在制备辅助治疗感染性疾病药物中的应用。
[0009]为解决上述技术问题，本发明提供的细菌结合蛋白bbeWCP，其氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0010]bbeWCP蛋白含249个氨基酸，等电点为3.93，分子量为25，748道尔顿。bbeWCP蛋白克隆到大肠杆菌表达载体pET-32a (+)上，则可以通过重组表达载体PET32a-bbeWCP在大肠杆菌中以可溶形式表达。经SMART在线预测，发现bbeWCP蛋白分子除了含有一段信号肽之外,还有一个WAP (乳清酸性蛋白)结构域和一个VWC结构域。[0011]本发明提供的上述细菌结合蛋白的编码基因，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0012]本发明所提供的bbeWCP蛋白编码基因的制备方法，包括以下步骤:
[0013](I)从已有的中国白氏文昌鱼中提取总RNA ；
[0014](2)以步骤⑴所提取的总RNA为模板，逆转录合成cDNA ；
[0015](3)以cDNA为模板、以SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4为上、下游引物，通过PCR扩增得到bbeWCP蛋白的编码基因。
[0016]上述制备bbeAMP基因的方法中，所述总RNA采用Trizol试剂提取，所述cDNA是按照 Τ0Υ0Β0 公司的 First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace- α -TM(codeN0.FSK-100)说明书操作进行逆转录合成的。
[0017]本发明提供的以bbeWCP蛋白编码基因为目的基因生产重组融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:
[0018](I)重组表达质粒的构建:以含有SEQ ID NO:1所示基因的pGEX Teasy质粒为模板，以SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6为上、下游引物进行PCR扩增，将扩增产物克隆到表达载体上pET-32a(+),得到重组表达质粒；
[0019](2)重组融合蛋白的表达:将步骤(1)所述重组表达质粒转化至大肠杆菌中，培养基因工程菌、诱导重组融合蛋白表达；
[0020](3)纯化步骤(2)所得的重组融合蛋白；
[0021](4)将步骤(3)所得纯化融合蛋白的洗脱液透析除盐，浓缩冻干，得到纯的重组融合蛋白。
[0022]上述重组融合蛋白的制备方法，所述重组融合蛋白表达中采用的基因工程菌的培养基为氨苄抗性2XYT培养基，采用的诱导剂为IPTG ;纯化重组融合蛋白采用方法为亲和层析法。
[0023]上述重组融合蛋白的制备方法，通过对培养时间、诱导时间、诱导剂浓度、温度等条件的摸索和优化，发现重组融合蛋白表达的最佳条件为:接单菌落于氨苄抗性2XYT液体培养基中，于37°C温度、250rpm振荡条件下培养过夜；然后取培养物按1:1000比例接种于氨苄抗性2 X YT培养基中，在温度37°C、250rpm振荡条件下扩大培养至0D600 = 0.8 (扩大培养的时间约为4h)。最后加入IPTG至其最终浓度分别为ImM，进行诱导培养，诱导培养温度为18°C，于250rpm振荡条件下培养20h。在此条件下，所述重组融合蛋白的表达量高，并以可溶蛋白形式存在。
[0024]本发明提供的以bbeWCP蛋白编码基因为目的基因生产的重组融合蛋白(即PET32a-bbeWCP表达的蛋白)含401个氨基酸，分子量为45，810道尔顿。
[0025]本发明所提供的以bbeWCP蛋白编码基因为目的基因生产的重组融合蛋白，其与微生物有较为明显的结合作用，考虑其可应用于开发辅助治疗感染性疾病的药物。
[0026]上述以bbeWCP 蛋白编码基因为目的基因生产的重组融合蛋白，所述重组融合蛋白可与革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌结合。
[0027]本发明的有益效果为:本发明的bbeWCP蛋白，由于含有一段信号肽，其能够识别和结合革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌。另外，据中国山东大学报道，中国对虾中含有单一 WAP(乳清酸性蛋白)结构域的抗菌肽可用于饲料、食品及药品的开发；VWC结构域多发现于血浆蛋白补体因子，整合素及胶原蛋白中，而bbeWCP蛋白除信号肽外还含有一个WAP结构域和一个VWC结构域，故本发明的蛋白在养殖业、食品、医药卫生等领域具有广阔的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0028]图1为重组表达质粒pET32a_bbeWCP的构建示意图；
[0029]图2为bbeWCP蛋白编码基因的PCR扩增图；
[0030]图3为pET32a_bbeWCP重组融合蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达、定位图；
[0031]图4为pET32a_bbeWCP重组融合蛋白的纯化图；
[0032]图5为重组融合蛋白pET32a_bbeWCP与细菌结合的Western blot分析图。【具体实施方式】
[0033]下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。本发明表达质粒的复制方法--参照Sambrook(Sambrook,et al.1989,Molecular cloning.Cold Spring Harbor LaboratoryPress.USA)方法，用CaCl2的方法将质粒转化至E.col1.DH5或BL21 (DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100g/mL)的2YT培养基培养转化菌株，用Omega公司试剂盒提取质粒。 [0034]实施例1:细菌结合蛋白bbeWCP
[0035]细菌结合蛋白bbeWCP的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0036]实施例2:bbeffCP蛋白编码基因及其制备方法
[0037]bbeWCP蛋白的编码基因，其DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
[0038]bbeWCP蛋白编码基因的制备方法为:
[0039](I)取来自广东湛江水域的白氏文昌鱼(Branchiostoma belcheri)全鱼，米用Trizol试剂，按照中国2013年5月22日公开的专利CN103114094A所述方法提取总RNA ；
[0040](2)以步骤⑴所提取的总RNA为模板，逆转录合成cDNA，具体方法为:取Iug总RNA,按照 Τ0Υ0Β0 公司的 First Strand cDNA Synthesis Kit ReverTra Ace- α -TM(codeN0.FSK-100)说明书操作进行逆转录合成第一链(此cDNA存在于白氏文昌鱼的消化道内)；
[0041](3)以cDNA为模板、设计bbeWCP蛋白编码基因序列扩增的引物，通过PCR扩增得到beeAMP基因。
[0042]bbeWCP蛋白编码基因的PCR引物分别为
[0043]5' -ATGATGGTGCTGGCTGCACTTCTTC-3'(如 SEQ ID NO:3 所示)和
[0044]5' -TTAACATGTCAATAAAGATAAAAAC-3'(如 SEQ ID NO:4 所示)。
[0045]PCR过程中，采用Takara的LA Taq聚合酶，设置退火温度为55°C，72°C延伸Imin扩增bbeWCP的全基因，扩增结果如图2所示。在图2中，I表示扩增样品；M表示DNA分子量标准(DL2000)。结果表明，bbeWCP基因在750bp处有一明显的扩增带，其大小与预测基因大小相符。
[0046]将扩增得到的目的片段在连接酶缓冲液中按1:3的比例与pGEX Teasy vector混匀，用T4连接酶16°C连接6h，然后转化至大肠杆菌DH5 α中，挑选重组克隆测序，结果表明获得了 bbeWCP蛋白编码基因全长序列。
[0047]实施例3:以bbeWCP蛋白编码基因为目的基因生产重组融合蛋白的方法[0048]以bbeWCP蛋白编码基因为目的基因生产的重组融合蛋白，其生产方法包括如下步骤:
[0049](l)pET32a-bbeffCP重组表达质粒的构建
[0050]重组表达载体pET32a_bbeWCP的构建过程如图1所示，具体方法为:
[0051]根据bbeWCP蛋白编码基因的序列合成一对引物，上游引物含EcoR I切割位点，下游引物含Xho I切割位点。
[0052]上游引物(bbeffCP-upperl7-U)如SEQ ID NO:5 所示:
[0053]5’ -CCGGAATTC CTTCAGGACTCTTCCCAGTG-3 ’(下划线为 EcoR I 切割位点)
[0054]下游引物(bbeffCP-lowerl7-L)如SEQ ID NO:6 所示:
[0055]5’ -CC GCTCGAGT ACATGTCAATAAAGATAAAA-3 ’(下划线为 Xho I 切割位点)
[0056]以含有bbeWCP蛋白编码基因的pGEX Teasy质粒为模板，17_U/17_L为引物进行PCR扩增，米用Takara的prime STAR聚合酶及5Xbuffer,每50ul扩增体系加入0.2ulprime STAR酶，设置退火温度为55°C，72°C延伸Imin扩增，得到目的片段。用EcoR I和XhoI对目的片段和pGEX Teasy载体质粒(预先提取并纯化)进行酶消化，回收酶切产物后采用紫外分光光度计测定浓度，按照1:5的摩尔比混合目的片段与pET_32a(+)载体(Novagen公司)，加入IulT4DNA连接酶，于16°C过夜连接。将连接产物转化至E.coli DH5a，筛选阳性克隆进行测序鉴定，结果表明得到重组的原核表达质粒pET32a-bbeWCP。
[0057](2) pET32a-bbeffCP重组融合蛋白的表达
[0058]将pET32a_bbeWCP质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中，培养基因工程菌，诱导融合蛋白表达。
[0059]基因工程菌的培养条件为:接单菌落于氨苄抗性2XYT液体培养基中，于37°C温度、250rpm振荡条件下培养过夜；然后取培养物按1:1000比例接种于氨苄抗性2XYT培养基中，在温度37°C、250rpm振荡条件下扩大培养至0D600 = 0.8 (扩大培养的时间约为4h)。最后加入IPTG至其最终浓度分别为ImM，进行诱导培养，诱导培养温度为18°C，于250rpm振荡条件下培养20h，离心菌液收集菌体。实验过程中对培养时间，诱导时间，诱导剂浓度、温度等条件进行了摸索和优化，经SDS-PAGE电泳分析表明，在所述培养条件下pET32a-bbeffCP融合蛋白的表达量较高，且蛋白处于可溶状态。
[0060]超声裂解上述基因工程菌，经SDS-PAGE电泳分析诱导培养前、后的整菌及超声裂解后的上清液和沉淀，实验结果如图3所示。图3中，I表示诱导前的整菌；2表示诱导后的整菌；3表示诱导后的超声上清；4表示诱导后的超声沉淀。实验结果表明，菌株经诱导后在超声裂解沉淀中有明显的特异表达产物带，分子量与预测的理论值相符。
[0061](3)采用 Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow 亲和层析纯化融合蛋白
[0062]本发明还摸索和优化了 pET32a_bbeWCP重组融合蛋白的纯化条件，发现菌体进行超声破碎后，离心取上清，将蛋白上清过镍离子螯合琼脂糖快流速亲和层析柱进行纯化，可以得到较纯的蛋白。纯化该融合蛋白的具体方法为:
[0063]镍离子螯合琼脂糖层析柱的处理:用0.2M NiSO4溶液与琼脂糖柱料孵育，使琼脂糖结合Ni2+;用10倍VC(柱体积)的ddH20(重蒸水)清洗柱料，以除去游离的Ni2+;再用5倍VC的TBS缓冲液平衡柱料。
[0064]融合蛋白样品的处理:先用预冷的TBS溶液重悬上述步骤(2)中诱导培养后所收集的菌体，离心弃上清；称量菌体重量，按照Ig湿菌:10ml超声缓冲液的比例加入预冷的TBS缓冲液；采用超声波细胞粉碎机破碎细菌细胞，离心取上清(可溶蛋白)，制得融合蛋白样品。
[0065]纯化融合蛋白:将上述制得的融合蛋白上清液与已处理好的镍离子螯合琼脂糖层析柱的柱料孵育，使柱料结合目的蛋白；用TBS加不同浓度梯度的咪唑溶液缓冲液洗涤柱料至紫外吸收峰达到基线水平，收集蛋白穿流峰溶液，并取少量制备电泳样品；分别用不同浓度(50mM、100mM、250mM)咪唑-TBS缓冲液洗脱蛋白，每个浓度咪唑溶液都洗至蛋白紫外吸收峰的平台期为止，收集洗脱峰溶液并制备电泳样品。采用SDS-PAGE方法进行检测，实验结果如图4所示。图4中，I表示蛋白诱导前样品；2表示诱导后样品；3表示镍柱上样样品；4表示穿流峰溶液；5表示50mM咪唑-TBS洗脱峰溶液；6_7表示IOOmM咪唑-TBS洗脱峰溶液；8_10表示250mM咪唑-TBS洗脱峰溶液；M为蛋白质marker。
[0066](4) pET32a-bbeffCP重组融合蛋白透析除盐及浓缩
[0067]将步骤(3)中所得纯化蛋白的咪唑洗-TBS脱液样品加入透析袋中，将透析袋放入有TBS缓冲液(PH7.5)大烧杯里，隔8h换一次缓冲液，于4°C冷室搅拌过夜。透析后的蛋白通过IOKD Millipore超滤离心管浓缩，冻干后保存。
[0068]实施例4:pET3 2a-bbeffCP重组融合蛋白与细菌结合的活性分析
[0069]本实施例中使用的细菌包括:革兰氏阴性细菌大肠杆菌(Escherichia coli)、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter caloacetius)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)和副溶血弧菌(Vibro paraheamoIyticus);革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)和幾肠球菌(Enterococcus faecium)。
[0070]上述细菌的前处理:用TBS (pH7.5)缓冲液洗涤上述各菌，重复洗涤两次后稀释至0D600约为1.0，离心收集菌体沉淀。
[0071]在两组1.5ml EP管中加入50yg目的蛋白、2X107个经上述前处理的各菌，再分别加入CaCl2和EDTA (CaCl2和EDTA的最终浓度均为IOmM)，充分混匀后置4°C摇床轻柔振荡孵育过夜；次日，将孵育过夜所得溶液在4°C温度下以6000rpm的速度离心6min，收集菌体沉淀；沉淀用800ul TBS缓冲液(pH7.5)重复洗涤4遍以除去非特异结合蛋白，最后一次离心弃去上清后，用50 μ I TBS重悬菌体，加入10 μ 16 X SDS上样缓冲液，混匀后沸煮lOmin，制备电泳样品，用ant1-His单克隆抗体进行蛋白质印记(Western blot)分析。
[0072]以pET32a_TRX蛋白为阴性对照开展平行对照实验，实验结果如图5所示。在图5中，1-4所表示的分别为革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、粪肠球菌；5-8表示的分别为革兰氏阴性细菌大肠杆菌、醋酸钙不动杆菌、肺炎克雷伯氏菌、副溶血弧菌；9表示的为10 μ g重组蛋白作为对照，来证明TRX蛋白与微生物没有结合的结果不是由于操作不当造成的。结果表明，PET32a-bbeWCP重组融合蛋白可以结合革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌，且在钙离子存在下结合能力增强。
[0073]最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
【权利要求】
1.一种细菌结合蛋白，其特征在于:所述细菌结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.权利要求1所述细菌结合蛋白的编码基因，其特征在于:所述细菌结合蛋白的编码基因的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
3.制备权利要求2所述细菌结合蛋白的编码基因的方法，其特征在于:所述编码基因的制备方法包括以下步骤: (1)从已有的中国白氏文昌鱼中提取总RNA; (2)以步骤(1)所提取的总RNA为模板，逆转录合成cDNA； (3)以cDNA为模板、以SEQID NO:3、SEQ ID NO:4为上、下游引物，通过PCR扩增得到细菌结合蛋白的编码基因。
4.根据权利要求3所述的制备细菌结合蛋白的编码基因的方法，其特征在于:所述总RNA采用Trizol试剂提取。
5.以权利要求 2所述基因为目的基因生产重组融合蛋白的方法，其特征在于:所述生产重组融合蛋白的方法包括以下步骤: (1)重组表达质粒的构建:以含有SEQID N0:1所示基因的pGEX Teasy质粒为模板，以SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6为上、下游引物进行PCR扩增，将扩增产物克隆到表达载体上pET_32a (+),得到重组表达质粒； (2)重组融合蛋白的表达:将步骤(1)所述重组表达质粒转化至大肠杆菌中，培养基因工程菌、诱导重组融合蛋白表达； (3)纯化步骤(2)所得的重组融合蛋白； (4)将步骤(3)所得纯化融合蛋白的洗脱液透析除盐，浓缩冻干，得到纯的重组融合蛋白。
6.根据权利要求5所述的生产重组融合蛋白的方法，其特征在于:所述重组融合蛋白表达过程中，基因工程菌在氨苄抗性2X YT培养基中培养，采用的诱导剂为IPTG。
7.根据权利要求5所述的生产重组融合蛋白的方法，其特征在于:所述纯化重组融合蛋白的方法为亲和层析法。
8.一种采用权利要求5至7中任一项所述方法制备的重组融合蛋白。
9.权利要求8所述的重组融合蛋白在制备辅助治疗感染性疾病药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的重组融合蛋白在制备辅助治疗感染性疾病药物中的应用，其特征在于:所述重组融合蛋白可与革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌结合。
【文档编号】C12N15/70GK103965341SQ201410195692
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】徐安龙, 元少春, 胡金茹 申请人:中山大学