：含青霉素 100U/ml，链霉素 100 μ g/ml。
[0053] (4)灭菌的2ml安瓶等。
[0054] 2.操作方法
[0055] (1)去掉细胞培养瓶中的旧的培养液，加入10% FCS-1640液，使细胞悬浮。
[0056] (3) 1000r/min离心10min,去上清。细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制成悬液， 使成LOX IO7细胞/ml。
[0057] (3)取样，台盼兰染色，计数活细胞，应在95%以上。
[0058] (4)用注射器将细胞分装安瓶，每瓶0· 5ml-l. 0ml，熔封安瓶。
[0059] (5)放 4°C2h。
[0060] (6)放液氮罐气态部分（_70°C ) 15h。
[0061] (7)转入液氮部分。
[0062] 实施例2抗HER2的单克隆抗体的制备
[0063] -、抗体制备
[0064] 选择成年BALB/c小鼠，腹腔接种降植烷，每只小鼠0. 5ml。7-10天后腹腔接种第 16代杂交瘤细胞，每只小鼠 IX 106-2X IO6个。间隔5天后，待腹部明显膨大，以手触摸时， 皮肤有紧张感，即可用9号针头采集腹水。
[0065] 将腹水离心（13000r/min30分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清。用 Protein G~S印harose CL-4B进行纯化，上柱液为20mM的PBS缓冲液，柱层析洗脱液为： pH2. 7, 20mM的甘氨酸缓冲液，得到抗HER2的单克隆抗体。
[0066] 二、抗体的鉴定 [0067] 1、抗体纯度鉴定：
[0068] SDS-PAGE电泳鉴定，纯度在95%以上。（图2)
[0069] 2、抗体类及亚类鉴定：
[0070] 采用间接ELISA法，使用抗小鼠各种Ig亚型的抗体鉴定上述杂交瘤细胞产生的抗 体的Ig亚型，结果显不，clone6B2和clone4G8均为IgG2b (图3)。
[0071] 3、克隆6B2和克隆4G8的可变区序列测定
[0072] 将两个克隆的细胞提取mRNA，反转录为cDNA，使用可变区通用引物进行高保真 PCR扩增，将PCR产物片段插入到T载体内进行DNA序列测定，并将获得的序列翻译成蛋 白质的氨基酸序列。单抗clone6B2和clone4G8的可变区氨基酸序列：clone6B2的轻链 可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。 clone4G8的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。将该序列进行比对后未显示有相同序列，说明所获得的序列为两个克隆各自 特异的序列。
[0073] 实施例3纯化抗体的亲合力实验
[0074] 一、细胞 ELISA 法
[0075] 应用clone6B2和clone4G8抗体做细胞亲和力试验，确定其与HER2阳性SK-BR-3 细胞的结合EC50值。（表2)
[0076] 检测方法：第一天进行SK-BR-3细胞铺板准备，选取生长良好的SK-BR-3细胞，无 菌PBS洗3次，加入0. 1 %的胰蛋白酶消化细胞1-3分钟，加入含10% FBS的DMEM培养基 5ml,离心后收获细胞,细胞计数后调成IX 105/ml,每孔200 μ 1铺于96孔中，过夜培养。次 日，去掉细胞培养上清后，PBS洗2次，加入95%的酒精固定15min。固定细胞后，无菌水清 洗细胞2次后加入200 μ 1/孔5%的脱脂牛奶封闭lh。PBS清洗3次后，加入梯度稀释的 Clone6B2, Clone4G8, 37°C孵育Ih后，PBS清洗3次后加入HRP (辣根过氧化物酶）标记的 鼠二抗（1:2000)孵育Ih后，PBS清洗5次（前三次5min，最后2次IOmin)加入显色剂显 色15min上机检测0D 45。。
[0077] 其中显色剂A液配方为每1000 mL水中加入过氧化脲lg，10. 3g柠檬酸，35. 8g Na2HPO4 · 12H20,吐温-20100 μ L，pH5 ;B液配方为每1000 mL蒸馏水中加入四甲基联苯胺 (TMB) 7〇Omg (40mL DMSO 溶解），10. 3g 柠檬酸，pH2· 4。
[0078] 检测clone6B2和clone4G8的EC50值皆达到I. 3nM，显示较高的亲和力。
[0079] 二、流式细胞仪检测
[0080] 细胞准备：取对数期生长的SK-BR-3细胞，吸除细胞上清，5-10mlPBS清洗一次。加 入2ml0. 1 %胰酶37°C消化5min，加入含10% FBS的DMEM终止消化，1400转离心3min收集 细胞。加入无胎牛血清的DMEM清洗细胞三次后，PBS重悬细胞后1400转离心3min收集细 胞，加入20ug/ml抗体后4°C孵育lh。1400转离心3min收集细胞，PBS清洗细胞三次后，加 入FITC标记鼠二抗（1:100) 4°C孵育30min后，400转离心3min收集细胞。PBS清洗三次 后，上流式细胞仪检测收集荧光信息。
[0081] 检测如图4所示，clone6B2和clone4G8能够结合SK-BR-3细胞上的HER2。
[0082] 实施例4纯化抗体的中和活性检测
[0083] 一、抑制高表达HER2细胞SK-BR-3细胞的增殖
[0084] 细胞准备：
[0085] 取对数期生长的SK-BR-3细胞，吸除细胞上清，5-10ml PBS清洗一次。加入 2ml0. 1 %胰酶37°C消化5min，加入含10 % FBS的DMEM或F-12终止消化，1400转离心3min 收集细胞。加入8ml含10% FBS的DMEM稀释细胞，台盼蓝细胞计数法计数细胞，并用含10% FBS的DMEM稀释细胞成2X104/ml。96孔板中每孔铺入100μ 1即2000/孔，37°C，5% CO2 贴壁培养4h。
[0086] 检测样本：
[0087] 在无菌EP管中，不同浓度抗体加入到细胞孔中，每孔100 μ 1。继续培养4d，期 间观察细胞的生长。去除细胞培养上清，加入配制好的CCK-8 (按1:10的比例与DMEM混 合）100 μ 137°C，5% CO2继续培养l-4h。在酶标仪中读取OD45。。若暂时不测定OD值，可以 向每孔中加入10 μ L0.1 M的HCL溶液或1 % w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条 件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
[0088] 检测结果如图5所示，clone6B2和clone4G8能够结合SK-BR-3细胞且抑制其增 殖，其中clone6B2抑制SK-BR-3细胞的增殖达到40%。
[0089] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 抗HER2中和活性单克隆抗体clone6B2,其特征在于， i) 其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个 或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 ii) 其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或该序列经替换、缺失或添加一 个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。2. 产生权利要求1所述单克隆抗体clone6B2的杂交瘤细胞。3. 权利要求1所述单克隆抗体clone6B2的制备方法，其特征在于，以HER2为靶蛋白， 设计合成含有J1ER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为 免疫原，免疫小鼠制备获得； 所述多肽的氨基酸序列为：PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG。4. 权利要求1所述单克隆抗体clone6B2在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应 用。5. 含有权利要求1所述单克隆抗体clone6B2的药物、检测试剂或试剂盒。6. 抗HER2中和活性单克隆抗体clone4G8,其特征在于， i) 其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示，或该序列经替换、缺失或添加一个 或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 ii) 其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示，或该序列经替换、缺失或添加一 个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。7. 产生权利要求6所述单克隆抗体clone4G8的杂交瘤细胞。8. 权利要求6所述单克隆抗体clone4G8的制备方法，其特征在于，以HER2为靶蛋白， 设计合成含有J1ER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为 免疫原，免疫小鼠制备获得； 所述多肽的氨基酸序列为：PALVTYNTDTFESMPNPEGRYTFG。9. 权利要求6所述单克隆抗体clone4G8在制备以HER2为靶标的疾病治疗药物中的应 用。10. 含有权利要求6所述单克隆抗体cl〇ne4G8的药物、检测试剂或试剂盒。
【专利摘要】本发明提供一种抗HER2(人表皮生长因子受体2)中和活性单克隆抗体及其应用。结合蛋白信息学与免疫学，设计合成含有HER2胞外区Domain2第266-296位氨基酸的多肽，与载体蛋白KLH偶联作为免疫原，免疫小鼠制备获得多株杂交瘤细胞分泌可以特异性识别乳腺癌细胞表面HER2且具有中和活性的单克隆抗体。本发明的单抗与HER2结合的亲和力介于1-4nM，结合到肿瘤细胞表面的HER2后，能够有效抑制肿瘤细胞的增殖，成为非常理想的生物靶向治疗抗体。
【IPC分类】C12N5/20, G01N33/574, A61K39/395, A61P35/00, G01N33/577, G01N33/68, C07K16/32
【公开号】CN105017425
【申请号】CN201410183637
【发明人】孙乐, 张翠娟, 张小刚, 孙哲, 樊贵宝, 王炜, 张萍萍
【申请人】京天成生物技术(北京)有限公司
【公开日】2015年11月4日
【申请日】2014年4月30日
【公告号】WO2015165368A1