龄没有相关性。
[0137] 实施例3Linc00657在乳腺癌组织及正常组织之间的表达差异性分析（图8)
[0138] 本实验利用OriGenebreastcancereDNAarrays进行RT-PCR实验，对RT-PCR所 得的实验数据进行分析，得出乳腺癌组织和正常组织样本中的相对变化倍数，再利用SPSS 统计分析软件中的独立样本T检验，分析Linc00657在实验中的41例乳腺癌组织样本和7 例正常组织样本中的表达，Linc00657在乳腺癌组织中表达量比正常组织中高1. 95倍，且 具有统计学意义（P= 〇. 01)。该实验进一步验证了TCGAdatabaseanalysis的959个乳 腺病人的测序实验结果。
[0139] (1)检测引物组合。委托Invitrogen北京分公司合成以下用于检测的引物。
[0140] 引物组合：
[0141] 逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；
[0142]
[0143] (2)乳腺肿瘤及对照组织样本的获得及总RNA提取
[0144] 获得经手术分离的乳腺癌乳腺肿瘤组织样本41个，癌旁正常组织样本7个，用 N0RGEN公司的动物组织RNA纯化试剂盒提取总的RNA，对提取的总RNA进行定量。
[0145] 3.实时荧光定量RT-PCR检测Linc00657在乳腺肿瘤样本中的表达
[0146] 利用实时荧光定量RT-PCR检测步骤2中获得的41个乳腺肿瘤样本及7个癌旁组 织样本中Linc00657的表达情况，具体步骤如下：
[0147] 1)RNA逆转录：使用天根生化科技公司的逆转录试剂盒（TIANScript M-MLV，cat:ER104-03)进行RNA样本的逆转录反应，具体按照试剂盒说明书的方法进 行，步骤如下：取1微克提取的总RNA样本，加入2μ1(10μΜ)6碱基随机逆转录引物， 2μ1dNTP(lOmM)，混匀后置70°C水浴变性5分钟；冰上放置3分钟后取出，加入4μ1 5XFirst-StrandBuffer,0. 5μ1RNaseinhibitor(40U/μ1) , 1μ1M-MLV(200U/ μ1)，总体积为20μ1 ;混勾后短暂离心，置于EppendorfPCR仪中进行逆转录反应，反 应参数为25 °C，10分钟；42 °C，50分钟；95°C，5分钟；随后置于4°C保存。其中，RNase inhibitor(cat#N211)为Promega公司的产品。
[0148]2)实时荧光定量PCR:使用天根生化科技公司的的HotMasterTaqDNA polymerase(cat#:ET106-01_01)对样本中Linc00657的表达进行定量检测，具体方法按产 品说明书进行，步骤如下：取2μ1逆转录产物，加入2.5μ1lOXHotMasterTaqBuffer， 0· 5μ1 (10μM)上游引物，0· 5μ1 (10μM)下游引物，1μldNTP混合物（各 2· 5μΜ)， ΙμLSYBRGreenI(5Χ), 0.2μLHotMasterTaqDNApolymerase(2·5ιι/μ1)，最后加入 17. 3μ1ddH20,反应总体积为25μ1。混匀后短暂离心，置于EppendorfPCR仪中进行PCR 扩增反应，反应参数为95 °C预变性2分钟，95 °C变性15秒，58 °C退火15秒，72 °C延伸30秒； 循环次数为40个循环。每个反应设置3个重复。
[0149] 3)数据分析：对同一样本分别检测其中目标RNA及内参RNA的表达，用引物组合 一检测Linc00657的表达；以内参的表达量为基准，对目标RNA的表达进行归一化处理；随 后使用本领域通常使用的delta delta Ct法对目标RNA的表达量进行定量。本实验的内参 为beta-actin。具体方法和步骤可以参见文献：Livak KJ and Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2 (-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 200IDec ;25 (4):402-408。
[0150] 实施例4.Linc00657在乳腺癌细胞及正常上皮细胞之间的表达变化（图9)
[0151] 本实验验证Linc00657在乳腺癌细胞中是否有差异表达，选取了乳腺上皮细胞 HMLE和乳腺癌细胞MCF7,MDA-MB-231。如图9所示，Linc00657在乳腺癌细胞中显著高表 达，其中在MCF7细胞中比乳腺上皮细胞高2. 81倍，在MDA-MB-231中高2. 69倍。
[0152] 实施例5.用于检测Linc00657表达水平的实时荧光定量RT-PCR试剂盒
[0153] 用于检测Linc00657表达水平的实时荧光定量RT-PCR试剂盒包括以下成分：
[0154] 1.逆转录酶及其反应缓冲液，缓冲液成分及浓度如下：1MTris(pH8. 5)，10mM;1M HC1,2. 94mM；1MKCl,50mM；1MMgCl2,2. 5mM；10mMdNTP, 200μΜ；50XR0X, 0. 02X；ddH20 ；
[0155] 2. Linc00657的逆转录及PCR扩增引物组合：
[0156] 逆转录引物：6碱基随机逆转录引物；
[0157] 正向引物：5 '-AGATTCCCATTTTGGCTTTG;
[0158] 反向引物：5 '-GGTGACATGGTGCTGTTTCA;
[0159] 3.DNA聚合酶；
[0160] 4.参考样本；
[0161] 5.试剂盒使用说明书。
[0162] 除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形 成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
【主权项】
1. 一种LncRNA分子，其特征在于：所述核酸分子选自： 1) 、序列表中 SEQ ID Nol、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5 所示的 核酸分子； 2)、与序列表中 SEQ ID Nol、SEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5 所示 的核酸序列具有90%或以上同源性的核酸分子。2. 根据权利要求1所述的LncRNA分子作为乳腺肿瘤预后标志物的应用。3. -种检测如权利要求1所述的LncRNA分子的方法，其特征在于：在分离的乳腺肿瘤 样本中检测LncRNA分子的方法采用杂交法、扩增法或测序法。4. 根据权利要求3所述的LncRNA分子的检测方法，其特征在于：所述杂交法为 Northern杂交、基因芯片杂交及原位杂交法。5. 根据权利要求3所述的LncRNA分子的检测方法，其特征在于：所述扩增法为实时荧 光定量聚合酶链式反应。6. 根据权利要求3所述的LncRNA分子的检测方法，其特征在于：所述的乳腺肿瘤样本 是乳腺肿瘤组织样本、血清、血浆、口腔粘液、尿液或体液。7. -种探针，其特征在于：该探针能够检测所述的LncRNA分子。8. 根据权利要求7所述的探针，其特征在于：所述探针具有SEQ ID No 6所示的核酸 序列，同时包括由权利要求 1 中 SEQ ID NoUSEQ ID No2、SEQ ID No3、SEQ ID No4、SEQ ID No5设计的探针序列。9. 根据权利要求7或8所述的探针，其特征在于：所述探针在制备乳腺肿瘤预后检测 试剂中的应用。10. -种诊断乳腺肿瘤的预后检测系统，其特征在于：该检测系统包含所述的探针。
【专利摘要】本发明公开了一种检测乳腺肿瘤预后生物标记物LncRNA的方法及临床应用，提供了一组新的LncRNA，该组LncRNA具有SEQ？ID？No1、SEQ？ID？No2、SEQ？ID？No3、SEQ？ID？No4、SEQ？ID？No5所示的序列。本发明是一种利用乳腺癌病人样本(样本可以是组织、血清、尿样、体液等)及对应的癌旁样本或者正常样本中特定的LncRNA作为乳腺癌预后辅助检测的生物标记物以及检测标记物的方法、相关试剂盒及高通量测序筛选方法。通过鉴定乳腺癌样本与对应的癌旁样本或者正常样本中的LncRNA表达量的差异变化，在体外诊断和判断乳腺癌癌变发生和进程。本发明还提供了LncRNA用作乳腺肿瘤标志物的用途，以及检测LncRNA的探针和引物。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12N15/113
【公开号】CN105238782
【申请号】CN201510565525
【发明人】丁先锋, 莫寅元
【申请人】杭州壹锋生物科技有限公司, 丁先锋
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年9月8日