一种用于身份鉴定的复合分型系统的制作方法

本发明属于法医学身份鉴定
技术领域：
，涉及一种用于身份鉴定的复合分型系统，具体涉及482个SNP位点及其在身份鉴定中的应用。
背景技术：
：法医学DNA分析是应用现代DNA分析技术，分析DNA遗传标记在群体中的分布与传递规律，确定分析样品的一致性与亲缘关系，从而对样品来源样本进行身份鉴定，为侦查破案和司法审判等提供技术支持。其分析对象主要涉及人体各种体液(斑)、组织、毛发以及表皮脱落细胞等。目前法医学DNA分析中用于身份鉴定的技术主要是针对短串联重复序列(Shorttandemrepeats，STR)以及单核苷酸多态性(Singlenucleotidepolymorphisms，SNP)分型。STR广泛存在于人类基因组中，具有高度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了人群中这些重复序列的多态性。由于人类基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同。SNP被称为“第三代DNA遗传标记”，与被称为“第二代遗传标记”的STR相比具有截然不同的特点：分布密集、数量庞大(在人类基因组中被认为有300万个以上的SNP遗传标记，这可能达到了人类基因组多态位点数目的极限)、频率高、属二态性标记、存在相对稳定，因此被认为是应用前景最好的遗传标记物。目前，基于SNP和STR发展出了多种用于身份鉴定或亲缘关系鉴定的分型体系或试剂盒。例如，中国专利申请201310125171公开了20个X-SNP位点多色荧光复合检测的分型方法，所述20个X-SNP位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs5916197，rs757018，rs2071182，rs5951622，rs4898214，rs5963947，rs5906341，rs4826645，rs3860291，rs5912774，rs1988916，rs5941046，rs4463614，rs5916844，rs6568051，rs2522169，rs5930646，rs5929739，rs5908051，rs6627351。中国专利申请201010265870公开了一种用于个体识别的44个SNPs位点多色荧光复合检测试剂盒和检测方法，44个SNP基因位点在NCBI中SNP数据库的rs号分别为rs1109037，rs3780962，rs987640，rs9951171，rs430046，rs338882，rs2342747，rs10092491，rs1821380，rs321198，rs7041158，rs13218440，rs560681，rs445251，rs8078417，rs10488710，rs7520386，rs214955，rs4530059，rs13182883，rs722290，rs6811238，rs279844，rs9905977，rs6955448，rs4288409，rs315791，rs740598，rs2272998，rs7205345，rs10773760，rs221956，rs576261，rs1498553，rs2399332，rs1058083，rs993934，rs1336071，rs1294331，rs1523537，rs2269355，rs12997453，rs1736442和rs10776839。再例如，J.M.Butler和B.Budowle等人公开了使用了传统的19个STR基因座进行分型和身份鉴定(J.M.Butler,R.Schoske,P.M.Vallone,J.W.Redman,M.C.Kline,Allelefrequenciesfor15autosomalSTRlocionU.S.CaucasianAfricanAmerican,andHispanicpopulations,J.ForensicSci.48(2003)908–911；J.Ge,B.Budowle,R.Chakraborty,ChoosingrelativesforDNAidentificationofmissingpersons,J.ForensicSci.56(2011)；B.Budowle,F.R.Bieber,A.J.Eisenberg,Forensicaspectsofmassdisasters:strategicconsiderationsforDNA-basedhumanidentification,LegalMed.7(2005)230–243)，这19个STR基因座为CSF1PO、D12S391、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D2S1338、D3S1358、D5S818、D6S1043、D7S820、D8S1179、FGA、PentaD、PentaE、THO1、TPOX以及vWA。虽然目前已开发了众多用于身份鉴定和个体识别的遗传标记分型体系，然而对于血统较远的一些亲缘关系，现有的遗传标记复合分型体系无法做出令人满意的家系身份鉴定结论。例如，在实际应用，现有分型体系对一些诸如祖孙、叔侄或半同胞等亲缘关系的分型鉴定效果并不理想，而此类亲缘关系的鉴定也是实际应用中经常面临的问题。因此，对于此类亲缘关系的鉴定体系或技术有着相当程度的实际需要。综上所述，开发一套分型效能和应用范围更加强大的复合分型系统是法医学身份鉴定、个体识别和亲缘关系判定领域中亟待解决的重要问题。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是提供一套用于身份鉴定的，尤其适用于诸如祖孙、叔侄或半同胞等亲缘关系鉴定的，具备更加强大的分型效能和应用范围的复合分型系统。一个方面，本发明提供了一组遗传标记组合，所述的遗传标记组合包括以下482个SNP位点中的至少214个；作为优选，所述的遗传标记组合包括以下482个SNP位点中的至少366个；作为进一步优选，所述的遗传标记组合包括以下482个SNP位点中的至少405个。所述的482个SNP位点在美国国立生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)的SNP数据库中的rs号分别为：rs1490413、rs4654468、rs7520386、rs17351137、rs10927438、rs7517833、rs798066、rs1524180、rs1281611、rs10874326、rs10801788、rs7546709、rs770927、rs187823、rs6684718、rs2036173、rs10748478、rs4847034、rs560681、rs10494685、rs7542498、rs922715、rs10495407、rs891700、rs1413212、rs876724、rs1109037、rs2372009、rs954789、rs863022、rs10203786、rs12617928、rs13395411、rs6547037、rs12622186、rs4849589、rs11888583、rs1881881、rs6541835、rs294643、rs993934、rs1251098、rs6711922、rs13383710、rs1540482、rs10189619、rs12464448、rs2368108、rs12997453、rs1598075、rs13408249、rs850889、rs1440059、rs2392819、rs1443664、rs4074882、rs907100、rs1357617、rs2030874、rs4283565、rs4684919、rs1121305、rs4857969、rs4493387、rs4364205、rs9843337、rs9814482、rs9873254、rs9866013、rs17792804、rs6549661、rs9878912、rs6810199、rs6437890、rs11921425、rs1436345、rs12639347、rs12488989、rs2399332、rs1872575、rs6785912、rs1600137、rs150205、rs10936362、rs1384823、rs1017953、rs1355366、rs779306、rs6444724、rs2046361、rs6846909、rs1356468、rs1452556、rs2324149、rs11940554、rs6826047、rs11096766、rs1822676、rs279844、rs2570070、rs13151209、rs13134862、rs6823094、rs2648037、rs10019345、rs11098234、rs1483597、rs167503、rs619042、rs1948210、rs4473636、rs6813291、rs1554472、rs10024103、rs6838690、rs35034620、rs6811238、rs921691、rs36029731、rs10520447、rs9684753、rs6552515、rs1979255、rs7718226、rs11133954、rs717302、rs7714769、rs417513、rs2928231、rs2257128、rs159606、rs182842、rs10035361、rs10052385、rs641437、rs10072283、rs767715、rs2406113、rs171227、rs12374491、rs412683、rs12153737、rs10478183、rs7717565、rs2408032、rs13182883、rs7704770、rs4543310、rs828720、rs315791、rs154367、rs251934、rs338882、rs1029047、rs1409096、rs13218440、rs9358112、rs7382170、rs2025679、rs10947859、rs4711791、rs663933、rs9349534、rs2811231、rs9345749、rs7772342、rs818269、rs12206819、rs16883568、rs6902855、rs9451593、rs1030428、rs1336071、rs9363138、rs9494677、rs200810、rs12198721、rs7769811、rs12662867、rs4946582、rs1884255、rs1478829、rs1358856、rs2503107、rs1360947、rs1452989、rs2272998、rs214955、rs6911233、rs4585574、rs1584535、rs2820408、rs9347854、rs727811、rs6955448、rs917118、rs1406627、rs10228127、rs1019029、rs991471、rs6965666、rs7797272、rs7805962、rs9969372、rs9642306、rs10263034、rs452247、rs6973042、rs1230531、rs10265025、rs10487320、rs1548395、rs321198、rs737681、rs1861751、rs10092491、rs4237030、rs1377247、rs2368508、rs7831841、rs1515685、rs1589196、rs7015305、rs7819544、rs7015145、rs4487715、rs10095524、rs1383474、rs4288409、rs41376144、rs6577791、rs6577808、rs2056277、rs7820230、rs11781232、rs10092983、rs4606077、rs3858029、rs1015250、rs7042478、rs7049164、rs10756505、rs1410035、rs2270529、rs10738497、rs1970064、rs7871735、rs1318664、rs2383542、rs7041158、rs10813060、rs4879342、rs400426、rs7855727、rs11137900、rs1887719、rs4486277、rs10867685、rs6559615、rs10746789、rs1160209、rs2786797、rs1327804、rs10818193、rs2781116、rs1335220、rs1463729、rs1360288、rs10776839、rs962759、rs826472、rs7909413、rs735155、rs7067974、rs7899028、rs3780962、rs7921673、rs2066058、rs2394137、rs10887346、rs1933957、rs1410059、rs481179、rs1326357、rs10748937、rs10884478、rs1336414、rs740598、rs1541179、rs748309、rs720416、rs964681、rs10765075、rs7898450、rs10768550、rs10500617、rs1498553、rs901398、rs11023546、rs1386734、rs11027682、rs2861329、rs7934283、rs2461678、rs794533、rs7929050、rs6591147、rs10488710、rs1557451、rs4938230、rs590162、rs4054951、rs2032414、rs12576089、rs2076848、rs2107612、rs2942582、rs7957282、rs1038666、rs1909149、rs7980737、rs7299072、rs2171841、rs11836065、rs2111980、rs12812747、rs10773760、rs1335873、rs1886510、rs9506765、rs528756、rs1538001、rs9315314、rs7333999、rs2677595、rs9316628、rs6561816、rs2780326、rs1340301、rs359371、rs7321823、rs9564415、rs9541364、rs4883864、rs9542407、rs337964、rs6562645、rs495593、rs1146888、rs7323290、rs2783082、rs4885690、rs1215468、rs2794251、rs1932807、rs7990715、rs9546538、rs9546953、rs2341300、rs12856670、rs9301207、rs7992038、rs1058083、rs7981712、rs1330527、rs1865350、rs701565、rs6491913、rs354439、rs9514807、rs1228539、rs1454361、rs1955877、rs1951055、rs2781333、rs7159343、rs722290、rs2358481、rs4899801、rs2998319、rs10150656、rs9323780、rs879803、rs873196、rs4530059、rs2016276、rs1821380、rs8037429、rs1528460、rs9944198、rs4887279、rs7181498、rs16975446、rs2159620、rs729172、rs2342747、rs7205345、rs4787112、rs12597901、rs16862、rs8056924、rs430046、rs1382387、rs9905977、rs740910、rs4796362、rs1860555、rs2175957、rs8070085、rs1004357、rs1027895、rs1897859、rs4080890、rs11077529、rs8081246、rs4793377、rs8078417、rs2291395、rs4789798、rs689512、rs3744163、rs2292972、rs1493232、rs3906004、rs16943205、rs1624032、rs9951171、rs7229946、rs273696、rs10502503、rs7232841、rs12967345、rs2949539、rs12457638、rs1943539、rs985492、rs7240706、rs1567612、rs1196588、rs9959097、rs7244456、rs4506998、rs17696192、rs521861、rs7243527、rs1626480、rs1736442、rs154889、rs8092618、rs1906774、rs17176581、rs1244834、rs1024116、rs719366、rs576261、rs1031825、rs445251、rs12480506、rs2567608、rs1005533、rs1523537、rs722098、rs2824224、rs2825957、rs2826366、rs2829225、rs2829292、rs464663、rs2830795、rs2831700、rs2833736、rs914165、rs221956、rs9606186、rs5746846、rs2073383、rs733164、rs987640、rs5749850、rs2040411、rs1028528、rs5769866。所述的482个SNP位点的遗传信息如表1所示：表1应当指出的是，以上SNP位点是根据NCBI的SNP数据库的命名方式来表示的，该方式是以rs或者ac加数位阿拉伯数字来表示一个确定的SNP位点。本领域技术人员知道，一个SNP位点还可以有其它表示方式，如以HGVS命名法标注某位点在参考gDNA上的位置来表示。采用其他命名方式来标注指代与本发明一样的SNP位点或SNP位点组合也属于本发明的范围。上述482个SNP位点的获得方式是：通过对NCBIdbGaP数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap)的分析，收集了其中11,989份全基因组关联分析(Genome-wideAssociationStudy，GWAS)研究的SNP位点分型结果，对其经过Hardy-Weinberg平衡检验的筛选后，获得1,842,870个SNP位点作为候选SNP位点。分别利用千人基因组计划(the1000GenomesProject)中的853个来自不同群体的无关个体样本和英国万人计划(theUK10Kproject)中的4,000个个体样本的上述1,842,870个SNP位点的多态性数据，以等位基因频率(MinorAlleleFrequency，MAF)大于等于20％和固定指数(FixationIndex，FRT)小于等于0.03作为筛选标准，对上述1,842,870个SNP位点进行筛选，获得12,942个SNP位点；以连锁不平衡(LD)的r2大于等于0.01为筛选标准，最终获得本发明所述的482个SNP位点。遗传分型也称基因型分型，是利用生物学检测方法测定个体基因型(Genotype)的技术。遗传分型在群体遗传学和法医学领域有广泛的应用，是进行如身份鉴定、亲子鉴定、个体识别、尸源鉴定、犯罪认定、失踪人口认定和案件排查等工作的有力工具。随着PCR技术和高通量测序技术的发展，进行遗传分型的方法也发展和完善，目前遗传分型的方法主要有：直接测序法、高通量测序法、片段长度多态性法、荧光标记的片段长度多态性法、飞行质谱检测法、TaqMan荧光探针法、多重SNaPShot检测方法、连接酶检测反应法、改进的连接酶检测法、基因芯片法、SNPscan分型法、高分辨率熔解曲线法和基于qPCR方法的SNP分型法。遗传分型的检材可以从任何生物学材料得来，例如血液、精斑、唾液、牙齿、骨骼、指甲、毛发、皮肤、口腔拭子、脱落细胞以及心脏、肝脏、脾脏、肺、胃、肾脏、胰腺、脑、肠和胆等器官。本发明还提供了上述一组遗传标记组合在身份鉴定中的应用。所述的应用指：利用遗传分型确定所述的遗传标记组合中的SNP位点的基因型，从而对个体进行身份鉴定。上述应用中，所述的个体可以为亚洲人、美洲人或欧洲人，但不限于上述人群。上述应用中，所述的遗传分型的方法包括但不限于：直接测序法、高通量测序法、片段长度多态性法、荧光标记的片段长度多态性法、飞行质谱检测法、TaqMan荧光探针法、多重SNaPShot检测方法、连接酶检测反应法、改进的连接酶检测法、基因芯片法、SNPscan分型法、高分辨率熔解曲线法和基于qPCR方法的SNP分型法；优选为高通量测序法和基因芯片法。在本发明一个较佳的实施例中，利用高通量测序法对含有本发明所述的482个SNP位点的遗传标记组合进行遗传分型，可同时获得上述482个SNP位点的基因型信息。另一个方面，本发明提供了一种分型试剂盒，所述的分型试剂盒包含用于对本发明所述的一组遗传标记组合中的SNP位点进行遗传分型的试剂。所述的分型试剂盒用于对个体的进行身份鉴定。所述的分型试剂盒中还可以包含用于扩增一组遗传标记组合中的SNP位点的PCR引物。本发明还提供了所述的分型试剂盒在个体识别、亲缘关系判定、案件排查、尸源认定、亲子鉴定、罪犯认定和失踪人口认定中的应用。本发明还提供了一套用于身份鉴定的复合分型系统，所述的复合分型系统包含本发明所述的分型试剂盒和利用高通量测序法检测SNP位点基因型所需的仪器、软件、和/或模块。再一个方面，本发明还提供了一种个体基因型身份证，所述的个体基因型身份证包含芯片，所述的芯片上储存有该个体的遗传标记位点的基因型信息，所述的遗传标记位点指本发明所述的遗传标记组合中的SNP位点。所述的个体基因型身份证的结构样式可以为卡片式、硬盘式或光盘式，但不限于上述3种结构样式。本发明还提供了所述的个体基因型身份证在身份鉴定中的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)、本发明提供的一组遗传标记组合和复合分型系统中，由于其包含的SNP位点数量多，因此具有现有遗传标记组合所不能比拟的分型效能；覆盖包含全球各大主要人群，对不同人群的适用范围较现有技术更加广泛；通过对超过4000个无关个体的基因型数据进行分析获得的482个SNP位点，对个体身份鉴定的结果较现有技术更加可靠。(2)、本发明提供的一组遗传标记组合和一种分型试剂盒对于血统较远的一些亲缘关系进行家系身份鉴定的效果明显优于现有技术，对于一些诸如亲缘关系类中的祖孙、叔侄、半同胞关系进行身份鉴定的区分度和准确性明显优于现有技术。(3)、本发明提供的一种分型试剂盒和复合分型系统能够实现对上述482个SNP位点的同时扩增，通过一管反应即可获得包含482个SNP位点的扩增产物，方便高效。(4)、本发明利用高通量测序技术实现对上述482个SNP位点的分型，能够同时获得482个SNP位点的基因型，能够实现一管反应即可获得单一个体的测序文库，使得对个体的身份鉴定更加简洁高效可靠。(5)、本发明提供的一种个体基因型身份证中储存有个体的基因型信息，即本发明所述的482个SNP位点的基因型信息，能够有效方便的作为个体身份认证的工具。(6)、本发明提供的一组遗传标记组合和复合分型系统在用于身份鉴定时，真实样本与无关对照样本的区分度优异，明显优于现有技术中常用的STR基因座组合或SNP位点组合。由此可知，基于本发明提供的一组遗传标记组合的一种分型试剂盒和一套复合分型系统在用于身份鉴定时，同样也具有比现有技术更高的区分度；因而，在用于亲子鉴定、个体识别、尸源鉴定、犯罪认定、失踪人口认定和案件排查等方面具有比现有技术更高的准确性。附图说明图1为实验例1中的组合2得出的似然率LR比较结果。图2为实验例1中的组合2得出的似然率LR比较结果。具体实施方式以下实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的下述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属
技术领域：
的普通技术人员通常理解的相同意义。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。本发明实施方式中核酸的定量采用NanoDrop2000超微量分光光度计，产品编号ND2000c，购自赛默飞世尔公司(ThermoFisherScientific)；GenEluteTM血液基因组DNA试剂盒货号为NA2010-1KT，购自SIGMA-ALDRICH公司；实施例1一组遗传标记组合该遗传标记组合包含本发明所述的482个SNP位点，所述的482个SNP位点的rs号和遗传信息如表1所示。实施例2一种分型试剂盒该分型试剂盒包含：(1)、测序文库制备试剂；(2)、高通量测序试剂。实施例1对存在16个亲属关系的家庭成员进行随机样本试验和结果分析。个体样本：包括父母小孩、兄弟、姐妹、堂兄弟姐妹、祖孙和叔侄等在内的16个亲属关系的共计47个家庭成员；检材为血液样本。实验过程：对以上47个个体进行静脉采血，获得47份血液样本，对其进行随机编号，进行双盲实验：(1)、DNA提取：使用GenEluteTM血液基因组DNA试剂盒分别从47份血液样本提取基因组DNA，获得47份血液基因组DNA样本，具体提取过程参照试剂盒使用说明；(2)、文库制备：A、PCR扩增：分别以本实施例步骤(1)获得的47份血液基因组DNA样本作为PCR模板，设计引物，采用IonAmpliSeqTMLibraryKit2.0试剂盒(购自LifeTechnologies公司，货号为Cat.no4475345)扩增样本中的482个SNP位点，获得47个扩增产物；PCR扩增体系：成分加入量5×IonAmpliSeqTMHiFiMix(redcap)4μL血液基因组DNA1ng扩增引物10μLNuclease-freeWater补齐至20μLPCR扩增程序：B、使用IonXpressTMBarcodeAdapters1–96Kit试剂盒(购自ThermoFisher公司，货号为Cat.no.4474517)分别对本实施例步骤(2)-A获得的47个扩增产物连接特异性接头，获得47个不同的接头-扩增产物，具体连接过程参照试剂盒使用说明；C、使用XPKit试剂盒(购自BeckmanCoulter公司，货号为A63880或A63881)对本实施例步骤(2)-B获得的的47个不同的接头-扩增产物进行纯化，使用实时荧光定量核酸扩增检测方法对纯化后的接头-扩增产物进行定量后，混合47个接头-扩增产物，构成测序文库；(3)、使用IONPGM测序仪对本实施例步骤(2)-C获得的测序文库进行测序，具体操作流程参见IONPGM测序仪操作说明；(4)、结果分析：根据47份血液基因组DNA样本的分型结果，随机进行样本聚类得到的个体家系关系结果，符合之前采样的预期。目前现有分型试剂盒或用于分型的遗传标记组合对本实施例中关于祖孙和叔侄关系的个体样本获得的个体家系关系结果，不符合采样预期。例如使用传统的19个STR基因座作为一组遗传标记组合对本实施例相关样本进行样本聚类得到的个体家系关系结果中，祖孙和叔侄关系的样本结果不符合之前采样的预期。说明本发明在用于对于一些诸如亲缘关系中的祖孙、叔侄、半同胞关系等进行身份鉴定的效果优于现有技术。实验例1区分度对比分别利用传统的19个STR基因座作为遗传标记组合(以下简称组合1)和利用本发明提供的482个SNP位点作为遗传标记组合(以下简称组合2)对个体进行身份鉴定，并对鉴定结果进行比较。采用高通量测序技术分别对组合1和组合2进行遗传分型，并利用Elston-Stewart算法模型计算真实亲缘关系的似然率LR，将其与无关群体的似然率LR分布进行比较。若真实亲缘关系的LR值能够显著大于无关群体的似然率LR分布，则能够进行相关的认定。组合1得出的似然率LR比较结果如图1所示，图中横轴为似然率LR标度，两条平行竖线代表真实亲缘关系的似然率LR，灰色区域为无关群体的分布。其结果无法分开，说明19个STR在该亲缘关系下的鉴定效力不足。组合2得出的似然率LR比较结果如图2所示，可以看出，其结果的真实亲缘关系似然率LR显著(p值<0.01)大于无关群体分布，从而能够做出相关认定。由本实验例可以明显看出本发明提供的482个SNP位点组成的遗传标记组合对于身份鉴定的效果明显优于现有技术。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例中，而是可以应用于符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的更宽的范围。当前第1页1 2 3