本发明涉及生物
技术领域：
中，靶DNA富集探针的制备方法。
背景技术：
：随着越来越多生物基因组测序的完成,生物医学研究已进入后基因组时代。随着二代测序的成本不断的降低，早在2014年，美国illumina公司已经推出全新高通量测序仪器，可以将测序成本降低到1000美元，基因检测的普及和随之加速，利用高通量测序技术在科学研究和临床检测上。目前，对于全基因组测序虽然成本已经到达1000美元，但在对于需要超高深度测序的临床或科技研究领域，特别是肿瘤检测中，高深度测序面临的测序成本以及高通量数据的处理带来的成本，不能广泛的用于临床检测及相关研究中，所以就产生了基因捕获技术，所谓基因捕获，就是针对所需要关注或研究的目的区域设计相应的捕获探针，利用杂交技术，将目的片段从全基因组中富集出来，将这些片段再进行高通量测序，既能满足研究需要深度要求，同时也能实现不增加成本，目前基因捕获技术已经在克隆、发现新基因及揭示基因功能方面具有独特的优点,已成为功能基因组时代研究的有力工具,在生物医学研究各个领域的应用日趋广泛。目前基因捕获中用到的探针为cDNA单链探针和RNA探针。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是如何制备可以捕获靶DNA的探针。为解决上述技术问题，本发明首先提供了靶DNA富集探针的制备方法。本发明所提供的靶DNA富集探针的制备方法，包括：制备N个亚探针，连接所述N个亚探针，得到靶DNA富集探针；所述N个亚探针满足所述N个亚探针能覆盖所述靶DNA的全部序列。其中，N为大于等于2的一个自然数。N的数值具体可根据所述靶DNA的长度和所述亚探针的长度确定，将所述靶DNA的长度(bp)与所述亚探针的长度(bp)的比值记为n，当n为非整数时，N＝n的整数部分+1；当n为整数时，N＝n。如果所述N个亚探针中存在序列完全相同的探针，在实际应用中还可以将去掉重复的亚探针，使所述亚探针的数量只要能满足覆盖所述靶DNA的全部序列即可。在本发明的一个实施例中，通过计算得到的N值为208，但在这208个亚探针中，第207个与第208个亚探针完全相同，在进行具体的实验中，可只制备第1-207条亚探针。所述N个亚探针均为单链DNA或双链DNA。所述N个亚探针能覆盖所述靶DNA的全部序列的含义为如下H1或H2：H1、当所述N个亚探针均为单链DNA时，所述N个亚探针能与所述靶DNA的两条单链DNA或一条单链DNA结合形成双链DNA；当所述N个亚探针均只与所述靶DNA的一条单链DNA结合时，该所述靶DNA的单链DNA不存在不能与所述N个亚探针中的亚探针结合的位点；当所述N个亚探针与所述靶DNA的两条单链DNA结合时，在所述靶DNA的任何一个位点均有一条链能与所述N个亚探针中的亚探针结合；也就是说，当所述N个亚探针均为单链DNA时，所述N个亚探针均与所述靶DNA的两条单链DNA或一条单链DNA互补；当所述N个亚探针只与所述靶DNA的一条链DNA互补而与所述靶DNA的另一条链DNA均不互补时，与所述N个亚探针互补的所述靶DNA的那条单链DNA中不存在不与所述N个亚探针中的亚探针互补的位点；当所述N个亚探针能与所述靶DNA的两条链中的DNA片段互补时，所述靶DNA的任何一个位点均有一条链与所述N个亚探针中的亚探针互补；H2、当所述N个亚探针均为双链DNA时，所述N个亚探针能与所述靶DNA的两条单链DNA结合形成双链DNA，所述靶DNA的两条单链DNA均不存在不能与所述N个亚探针中的任一条单链DNA结合的位点；也就是说，当所述N个亚探针均为双链DNA时，所述N个亚探针中每个亚探针的两条单链分别与所述靶DNA的两条单链DNA在同一位点互补，所述靶DNA的两条单链DNA均不存在不与所述N个亚探针互补的位点。在连接所述N个亚探针前还可包括将所述芯片上的所述N个亚探针洗脱下来。洗脱所述所述芯片上的所述N个亚探针可利用氨水进行。所述氨水的摩尔浓度可为35％。从所述芯片上洗脱下来的所述N个亚探针可利用超纯水溶解。所述制备N个亚探针可在芯片上原位合成所述N个亚探针。上述靶DNA富集探针的制备方法中，在所述靶DNA上任何两个相邻的亚探针均可满足上游亚探针的下游有一个或多个核苷酸与下游亚探针的上游重叠(即序列相同)。上述靶DNA富集探针的制备方法中，所述一个或多个核苷酸的数量可根据具体情况确定，所述一个或多个核苷酸的数量使所述N个亚探针的长度满足具体实验的要求。在本发明的一个实施例中，所述一个或多个核苷酸的数量使所述N个亚探针的长度均为108bp。上述方法中，所述一个或多个核苷酸的序列均为所述靶DNA上的序列，所述一个或多个核苷酸的序列为所述亚探针在所述靶DNA上延伸的序列。上述靶DNA富集探针的制备方法中，所述N个亚探针的长度均可为50-150bp。所述N个亚探针的长度具体均可为108bp。上述靶DNA富集探针的制备方法中，所述连接所述N个亚探针可包括下述A1)和A2)：A1)连接所述N个亚探针，得到长链DNA和/或环状DNA；A2)将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增，得到靶DNA富集探针。所述靶DNA富集探针为双链DNA。上述靶DNA富集探针的制备方法中，在连接所述N个亚探针前还可包括对所述N个亚探针进行磷酸化修饰。对所述N个亚探针进行磷酸化修饰具体可为在所述N个亚探针的5′端进行磷酸化修饰。所述磷酸化修饰可利用T4多聚核苷酸激酶或NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行。利用NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行所述磷酸化修饰的反应体系可为：所述N个亚探针10μl、10×反应缓冲液5μl、10mMATP5μl、T4多聚核苷酸激酶2.5μl和H2027.5μl。所述反应体系中所述N个亚探针的浓度可为5ng/μl。所述反应体系中10×反应缓冲液、ATP和T4多聚核苷酸激酶均为NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒中试剂。所述磷酸化修饰的反应条件可为37℃30min。所述连接所述N个亚探针可利用ssDNA连接酶或epicentre的ssDNA连接试剂盒(CircLigaseTMIIssDNALigase，epicentre)进行。所述连接的反应体系可为：所述N个亚探针的磷酸化产物或所述N个亚探针20μl、CircLigaseII10×ReactionBuffer5μl、50mMMnCl22.5μl、5MBetaine10μl、CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5μl和H2O10μl。所述连接的反应条件可为60℃60min。上述靶DNA富集探针的制备方法得步骤A2)中，在进行将所述长链DNA或所述环状DNA进行扩增时还可包括利用生物素对扩增产物进行标记。进行所述扩增可采用随机引物进行。所述随机引物可为由A、C、G和T这四个核苷酸随机组成的长度均为6bp的46条单链DNA所形成的混合物。所述随机引物中所有单链DNA的摩尔数均可相同。将所述长链DNA和/或所述环状DNA进行扩增以及利用生物素对扩增产物进行标记可利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应体系可为：所述长链DNA和/或所述环状DNA10μl、2×反应缓冲液25μl、Bio-16-dUTP5μl、Replig_Enzyme1μl和H2O9μl。其中，2×反应缓冲液中含有所述随机引物。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的反应温度可为37℃。利用Qiagen公司的全基因组扩增试剂盒进行反应的时间可不小于16小时。为解决上述技术问题，本发明还提供了捕获靶DNA的方法。本发明所提供的捕获靶DNA的方法，包括所述靶DNA富集探针的制备方法制备的靶DNA富集探针捕获靶DNA。为解决上述技术问题，本发明还提供了靶DNA测序的方法。本发明所提供的靶DNA测序的方法，包括利用所述捕获靶DNA的方法捕获靶DNA，然后对捕获的靶DNA进行测序。上述靶DNA测序的方法中，所述对捕获的靶DNA进行测序可利用现有技术中的测序方法进行，只要能达到对靶DNA测序的目的即可。为解决上述技术问题，本发明还提供可下述X1-X5中的任一应用：X1、所述靶DNA富集探针的制备方法在捕获靶DNA中的应用；X2、所述靶DNA富集探针的制备方法在制备捕获靶DNA产品中的应用；X3、所述靶DNA富集探针的制备方法在靶DNA测序中的应用；X4、所述靶DNA富集探针的制备方法在制备靶DNA测序产品中的应用；X5、所述捕获靶DNA的方法在靶DNA测序中的应用。上述应用中，所述靶DNA测序可采用二代测序方法进行。实验证明，利用本发明的靶DNA富集探针的制备方法制备的捕获人类线粒体全基因的富集探针对人类线粒体基因的捕获达到了100％覆盖，其捕获效率均大于50％，从至少覆盖到4X、10X和20X的参数来看，均达到100％，探针的整体均一性非常好，并且稳定性好。表明，本发明的靶DNA富集探针的制备方法可以用于制备靶DNA富集探针，并进一步对靶DNA进行测序。本发明的靶DNA富集探针的制备方法制备的探针为双链DNA探针，存在以下优势：1、双链DNA探针更加稳定，不易降解；2、双链DNA探针，在制备时，连接完成后，直接进行全基因组扩增，探针的均一性好；3、双链DNA探针，在富集时，捕获双链，更加准确，可以排除单链中PCR带入的碱基错配。附图说明图1为连接产物检测结果。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。本发明所提供的靶DNA富集探针的制备方法，包括：制备N个亚探针，连接N个亚探针，得到长链DNA和环状DNA；将长链DNA和环状DNA进行扩增，得到靶DNA富集探针。下面以人类线粒体全基因为靶DNA为例，来具体阐述如何利用本发明的靶DNA富集探针的制备方法制备可以捕获人类线粒体全基因的富集探针。实施例1、可以捕获人类线粒体全基因的富集探针的制备1、单链亚探针的序列设计及制备作为靶DNA的人类线粒体全基因的序列如序列表中序列1所示。靶DNA的长度为16569bp，将靶DNA分为208个片段，其中，第1-207个片段的长度均为80bp，第208个片段的长度为9bp，每两个相邻的片段均符合上游片段的末位与下游片段的首位相连，即，第1个片段的序列为序列1的第1-80位，第2个片段的序列为序列1的第81-160位，……，第207个片段的序列为序列1的第16481-16560位，第208个片段的序列为序列1的第16561-16569位。根据靶DNA的这208个片段设计能覆盖全靶DNA的单链亚探针，将这208个片段的序列分别向其上下游延伸，使最终得到的序列长度均为108bp，具体如下：将第1个片段的序列向其下游延伸28bp、将第2-206个片段的每个片段的序列分别向两端延伸14bp、将第207个片段的序列向其上游延伸19bp向其下游延伸9bp(因为其下游不足14bp)、将第208个片段的序列向其上游延伸99bp，得到208条长度均为108bp的序列。其中，第1条序列为序列1的第1-108位，第2条序列为序列1的第67-174位，第3条序列为序列1的第147-254位，第n条序列为序列1的第(80(n-1)-13)位至第(80n+14)位，n为4-205中的任一个自然数，第206条序列为序列1的第16387-16494位，第207条序列为序列1的第16462-16569位，第208条序列为序列1的第16462-16569位，第207条序列与第208条序列完全相同。利用原位合成的方法，根据序列分别为上述第1-207条序列在芯片合成寡核苷酸探针，即207条单链亚探针。利用35％的氨水，将固定在芯片上的207条单链亚探针洗脱下来，收集到离心管中，利用真空浓缩仪浓缩后，加入500μl超纯水溶解，成为一个靶DNA207条单链亚探针的混池；测定浓度，并稀释到25ng/μl。2、可以捕获人类线粒体全基因的富集探针的制备1)单链亚探针的5′磷酸化修饰：利用NEB的T4多聚核苷酸激酶试剂盒进行。5′磷酸化修饰的反应体系如下：组分体积(μl)207条单链亚探针的混池(50ng/μl)1010×反应缓冲液(ReactionBuffer)510mMATP5T4PolynucleotideKinase(T4多聚核苷酸激酶)2.5H2027.5总反应体积50μl，该反应体系中，除207条单链亚探针的混池和H2O外的试剂均为T4多聚核苷酸激酶试剂盒中试剂。混合均匀后，恒温加热器或PCR仪器上37℃恒温孵育30min。反应结束后，利用微量PCR产物回收试剂盒按照其操作流程进行产物纯化回收，洗脱体积20μl，得到磷酸化产物；2)连接反应：将步骤1)得到的磷酸化产物，利用商业的ssDNA连接试剂盒(CircLigaseTMIIssDNALigase，epicentre)连接，连接反应体系如下：组分体积(μl)步骤1)得到的磷酸化产物20CircLigaseII10×ReactionBuffer550mMMnCl22.55MBetaine10CircLigaseIIssDNALigase(100U)2.5H2O10总反应体积为50μl，该反应体系中，除步骤1)得到的磷酸化产物和H2O外的试剂均为ssDNA连接试剂盒中试剂。混合均匀后，60℃反应1小时。反应产物利用微量DNA回收试剂盒按照其操作流程进行产物纯化回收，回收产物，得到连接产物(长链DNA和环状DNA)。通过凝胶电泳，鉴别连接产物片段，结果如图1所示，图1中1号泳道为DNA分子量标准，2号为泳道为连接产物，结果显示，得到了成功连接的连接产物。3)标记生物素与扩增：利用Qiagen公司的商业化全基因组扩增试剂盒，反应体系如下：组分体积(μl)步骤2)得到的连接产物102×反应缓冲液(2×ReactionBuffer)25Bio-16-dUTP5Replig_Enzyme1H2O9总体积50μl，该反应体系中，除步骤2)得到的连接产物和H2O外的试剂均为全基因组扩增试剂盒中试剂，其中，2×反应缓冲液中含有随机引物，随机引物为由A、C、G和T这四个核苷酸随机组成的长度均为6bp的46条单链DNA所形成的混合物，该混合物中所有单链DNA的摩尔数均相同。混合均匀后，37度恒温孵育16小时以上。反应产物采用DNA回收试剂盒，按照试剂盒的标准操作流程，进行DNA纯化，得到靶DNA富集探针。采用Nanodrop2000进行定量，并将靶DNA富集探针稀释到150ng/μl，形成最终的靶DNA富集探针溶液。3、靶DNA富集探针的质量评估实验重复三次，每次重复试验的具体步骤如下：1)测试实验方案：选择10个人的全基因组文库样本，每个样本均分成两组，两组分别通过不同的批次进行验证实验。利用靶DNA富集探针捕获上述10个样本中的靶DNA：将靶DNA富集探针与DNA全基因组文库混合，样本中的线粒体基因就被杂交到探针上，通过生物素和链霉亲和素磁珠结合吸附，经洗脱处理将非目标区域的DNA片段去除，从而富集人类线粒体全基因，利用新一代测序仪IlluminaNexseq500进行2X150bp高通量测序。具体步骤如下：a1)制备以下混合体系：取500ngDNA全基因组文库(20μl,25ng/μl)，10μlBufferBL，5μl步骤2得到的靶DNA富集探针溶液，6μlBlockingOligoMix；a2)将步骤a1)的混合体系PCR仪上：95℃，7min，之后65℃，2min；a3)取65℃预热的BufferHY23μl加入到步骤a2)反应结束的体系中,然后于PCR仪上65℃杂交22小时。a4)取出MyOnebeads(Invitrogen)，漩涡震荡使磁珠充分悬浮，短暂离心，使管盖上的beads离心至管底部。a5)取50μlMyOnebeads到新的1.5ml的离心管中，漩涡震荡至少5s，使磁珠充分悬浮，短暂离心后放入磁力架上一分钟。a6)离心管在磁力架上保持静止(不要旋转离心管)，小心吸弃上清。a7)取下离心管，加入50μl的1XBindingBuffer(binding缓冲液)，旋窝震荡至少5s，短暂离心后放入磁力架上静止一分钟，小心吸弃上清。a8)重复步骤a6)和a7)两次(一共三次)。a9)取下离心管，加入100μl2XBindingBuffer(binding缓冲液)，旋窝震荡至少5s，短暂离心后完全转入一个新的离心管中。a10)将步骤a3)的产物完全转入beads的离心管中(总体积约200μl，同时处理多个样本时，混合后轻弹几下混匀)，旋窝震荡至少5s(不用离心)，置于Rotator上室温旋转1小时。a11)上述步骤后，利用WB1buffer室温清洗beads一次，15minutes，然后在WB3buffer中洗3次，65℃，15minutes/次。a12)绑定的DNA利用BufferElute洗脱。洗脱的DNA最终扩增15循环，利用如下程序:98℃，30s(1cycle)；98℃，25s,65℃，30s,72℃，30s(15cycles)；72℃，5min(1cycle)对洗脱的DNA进行PCR扩增。a13)PCR产物利用SPRIbeads(BeckmanCoulter)根据实验手册纯化，得到富集线粒体基因片段文库。其中，各试剂的配方如下：采用Nextseq500(illumina)测序平台进行测序，验证其探针的重复性与稳定性。2)测序数据的分析：首先，利用Trim-Galore程序过滤低质量的序列；然后，用Trim-Galore中的Cutadapt程序去掉3′端和5′端的通用引物序列，保留读出质量大于20bp和读取长度大于80bp的序列。过滤的序列用BWA程序匹配到人类基因组上，然后使用GATK软件包对质量值进行校准，而后重新匹配到参考序列上。重复读取用序列比对/匹配工具(SAMtools)3去掉后，只有唯一匹配的读取序列被用于后续分析。最后对测序的数据进行质量控制，数据见表1。表1、测序数据表1中参数说明：A.测序数据量是指完成靶DNA捕获的样本进行测序时产生的总的测序数据；B.目的碱基数：指探针设计所要覆盖到的目的区域的总碱基数；C.覆盖目的碱基数：指经过富集测序后，能够成功比对到设计所要覆盖的碱基区域的碱基数；D.覆盖率：覆盖目的碱基数/目的碱基数；E.捕获效率(有效数据量)：覆盖目的碱基数/测序数据量F.测序平均深度：指目的区域测序时，平均所读取到的次数；G.平均覆盖4X比例：指最少读到4次以上的碱基数占比；H.平均覆盖10X比例：指最少读到10次以上的碱基数占比；I.平均覆盖20X比例：指最少读到20次以上的碱基数占比；探针质量评估：靶DNA富集探针对人类线粒体基因的捕获达到了100％覆盖，其捕获效率均大于50％，从至少覆盖到4X、10X和20X的参数来看，均达到100％，探针的整体均一性非常好；通过重复实验和数据的结果显示，探针的具有很好的稳定性。表明，本发明的靶DNA富集探针的制备方法可以用于制备靶DNA富集探针，并进一步对靶DNA进行测序。<110>北京迈博恒业科技有限责任公司<120>靶DNA富集探针的制备方法<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>16569<212>DNA<213>人（Homosapiens）<220><221>misc_feature<222>(3107)..(3107)<223>n为a,c,g或t<400>1gatcacaggtctatcaccctattaaccactcacgggagctctccatgcatttggtatttt60cgtctggggggtatgcacgcgatagcattgcgagacgctggagccggagcaccctatgtc120gcagtatctgtctttgattcctgcctcatcctattatttatcgcacctacgttcaatatt180acaggcgaacatacttactaaagtgtgttaattaattaatgcttgtaggacataataata240acaattgaatgtctgcacagccactttccacacagacatcataacaaaaaatttccacca300aaccccccctcccccgcttctggccacagcacttaaacacatctctgccaaaccccaaaa360acaaagaaccctaacaccagcctaaccagatttcaaattttatcttttggcggtatgcac420ttttaacagtcaccccccaactaacacattattttcccctcccactcccatactactaat480ctcatcaatacaacccccgcccatcctacccagcacacacacaccgctgctaaccccata540ccccgaaccaaccaaaccccaaagacaccccccacagtttatgtagcttacctcctcaaa600gcaatacactgaaaatgtttagacgggctcacatcaccccataaacaaataggtttggtc660ctagcctttctattagctcttagtaagattacacatgcaagcatccccgttccagtgagt720tcaccctctaaatcaccacgatcaaaaggaacaagcatcaagcacgcagcaatgcagctc780aaaacgcttagcctagccacacccccacgggaaacagcagtgattaacctttagcaataa840acgaaagtttaactaagctatactaaccccagggttggtcaatttcgtgccagccaccgc900ggtcacacgattaacccaagtcaatagaagccggcgtaaagagtgttttagatcaccccc960tccccaataaagctaaaactcacctgagttgtaaaaaactccagttgacacaaaatagac1020tacgaaagtggctttaacatatctgaacacacaatagctaagacccaaactgggattaga1080taccccactatgcttagccctaaacctcaacagttaaatcaacaaaactgctcgccagaa1140cactacgagccacagcttaaaactcaaaggacctggcggtgcttcatatccctctagagg1200agcctgttctgtaatcgataaaccccgatcaacctcaccacctcttgctcagcctatata1260ccgccatcttcagcaaaccctgatgaaggctacaaagtaagcgcaagtacccacgtaaag1320acgttaggtcaaggtgtagcccatgaggtggcaagaaatgggctacattttctaccccag1380aaaactacgatagcccttatgaaacttaagggtcgaaggtggatttagcagtaaactaag1440agtagagtgcttagttgaacagggccctgaagcgcgtacacaccgcccgtcaccctcctc1500aagtatacttcaaaggacatttaactaaaacccctacgcatttatatagaggagacaagt1560cgtaacatggtaagtgtactggaaagtgcacttggacgaaccagagtgtagcttaacaca1620aagcacccaacttacacttaggagatttcaacttaacttgaccgctctgagctaaaccta1680gccccaaacccactccaccttactaccagacaaccttagccaaaccatttacccaaataa1740agtataggcgatagaaattgaaacctggcgcaatagatatagtaccgcaagggaaagatg1800aaaaattataaccaagcataatatagca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