一种测定嗜盐古生菌噬菌体snj1效价的引物及方法
【专利摘要】一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJ1效价的引物及方法，该引物包括上游引物5’-ACGAGTGGCGGCAGGTTT-3’、下游引物5’-TCCCGATGATGCGGTTGT-3’，利用上述引物测定嗜盐古生菌噬菌体SNJ1效价的方法时，先将待测噬菌体保存液与上游引物、下游引物、定量PCR试剂盒以及无菌水混合进行定量PCR反应，再于反应结束后测定Ct值，最后根据Ct值计算出嗜盐古生菌噬菌体SNJ1的效价。本发明不仅简便快速，而且特异性强、准确度高、重现性好。
【专利说明】一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJ1效价的引物及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及噬菌体效价的测定方法，具体涉及一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl 效价的引物及方法。
【背景技术】
[0002] 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，专一寄 生，个体微小，不具有完整细胞结构，只含有单一核酸。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能 生长，也不能复制。作为整个生态系统的一个重要组成部分，噬菌体在基因的转移、生物的 进化等方面展示了重要的意义。同时，噬菌体在遗传学方面的研究以及分子生物学等方面 的研究都起到了十分重要的作用。
[0003] 长期以来对噬菌体效价的测定采用传统的双层平板噬菌斑计数法，通过噬菌斑的 数量推测环境中噬菌体的效价。但是在用双层平板法测效价受到很多因素的干扰，如敏感 菌株的生理状态、噬菌体的吸附环境、噬菌斑形成条件等，如果某个环节出现失误会导致结 果出现很大的偏差，而且用双层平板检测噬菌体的效价是一个费时、费力的工作。因此，建 立一种简单、高效的测定噬菌体效价的方法非常必要。
[0004] 定量PCR (Polymerase Chain Reaction)技术是指以外参或内参为标准，通过对 PCR终产物的分析或PCR过程的监测，进行PCR起始模板量的定量，也可利用外标法通过监 测PCR过程（监测扩增效率）达到精确定量起始模板数的目的，同时以内对照有效排除假 阴性结果（扩增效率为零）。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术中存在的费时费力、重现性较差的问题，提供一种 特异性强、简单快速、重现性好的测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的引物及方法。
[0006] 为实现以上目的，本发明提供了以下技术方案：
[0007] -种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的引物，所述引物包括：
[0008] 上游引物：5, -ACG AGT GGC GGC AGG TTT-3，、
[0009] 下游引物：5' -TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3'。
[0010] 一种利用上述引物测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的方法，该方法是指：先将待 测噬菌体保存液与上游引物5'-ACG AGT GGC GGC AGG TTT-3'、下游引物5'-TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3'、定量PCR试剂盒以及无菌水混合进行定量PCR反应，再于反应结束后测定 Ct值，最后根据Ct值计算出嗜盐古生菌噬菌体SNJl的效价。
[0011] 所述方法依次包括以下步骤：
[0012] 标准曲线的建立：先取已知浓度的嗜盐古生菌噬菌体SNJl的标准保存液用无菌 水依次稀释10倍、100倍、IO 3倍、IO4倍、IO5倍，再向PCR扩增管中加入稀释后的标准保存 液、上游引物、下游引物、定量PCR试剂盒以及无菌水后进行定量PCR反应，并于反应结束后 测定Ct值，最后以稀释倍数的倒数的常用对数为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标拟合标准 曲线方程；
[0013] 噬菌体效价的测定：向PCR扩增管中加入待测噬菌体保存液、上游引物、下游引 物、定量PCR试剂盒以及无菌水后进行定量PCR反应，并于反应结束后测定Ct值，然后将测 定的Ct值带入标准曲线方程中计算出嗜盐古生菌噬菌体SNJl的效价。
[0014] 所述定量PCR反应条件为：先于95°C下变性4min，然后依次进行34个PCR循环，最 后于KTC停止PCR反应，其中，每个所述PCR循环都依次包括95°C变性15s、56°C退火30s、 72°C延伸 30s。
[0015] 所述标准曲线的建立步骤中，稀释后的标准保存液的体积为1 μ L，上游引物、 下游引物的浓度均为5μπι〇1/1，它们的体积均为lyL，定量PCR试剂盒为2XTaq PCR MasterMix，其体积是10 μ L，无菌水的体积为7 μ L ;
[0016] 所述噬菌体效价的测定步骤中，待测噬菌体保存液的体积为1 μ L，上游引物、 下游引物的浓度均为5μπι〇1/1，它们的体积均为lyL，定量PCR试剂盒为2XTaq PCR MasterMix，其体积是10 μ L，无菌水的体积为7 μ L。
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0018] 1、本发明一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的引物包括上游引物5'-ACG AGT GGC GGC AGG TTT-3'、下游引物5'-TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3'，该引物根据嗜盐古生菌 噬菌体SNJl的基因组设计得到，特异性较强，有效保证了嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价测定 结果的准确性。因此，本发明保证了嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价测定的准确性。
[0019] 2、本发明一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的方法将待测噬菌体保存液与上 游引物、下游引物、定量PCR试剂盒以及无菌水混合进行定量PCR反应，并根据测定的Ct值 计算出嗜盐古生菌噬菌体SNJl的效价，即采用定量PCR技术实现了噬菌体效价的测定，该 法不仅简单快速，而且具有较高的准确度和检测效率、重现性好。因此，本发明不仅简单快 速，而且准确度高、重现性好。
[0020] 3、本发明一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的方法采用先建立嗜盐古生菌噬 菌体SNJl浓度相对于Ct值的标准曲线方程，然后将检测的Ct值带入上述标准曲线方程得 到嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的方法，即利用嗜盐古生菌噬菌体SNJl的DNA含量与嗜盐 古生菌噬菌体SNJl的含量成正比，通过DNA含量来确定噬菌体的效价，标准曲线方程的线 性相关性达到0. 999,该法的有效性良好。因此，本发明方法的有效性良好。
【具体实施方式】
[0021] 下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
[0022] -种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的引物，所述引物包括：
[0023] 上游引物：5' -ACG AGT GGC GGC AGG TTT-3'、
[0024] 下游引物：5' -TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3'。
[0025] -种利用上述引物测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的方法，该方法是指：先将待 测噬菌体保存液与上游引物5'-ACG AGT GGC GGC AGG TTT-3'、下游引物5'-TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3'、定量PCR试剂盒以及无菌水混合进行定量PCR反应，再于反应结束后测定 Ct值，最后根据Ct值计算出嗜盐古生菌噬菌体SNJl的效价。
[0026] 所述方法依次包括以下步骤：
[0027] 标准曲线的建立：先取已知浓度的嗜盐古生菌噬菌体SNJl的标准保存液用无菌 水依次稀释10倍、100倍、IO 3倍、IO4倍、IO5倍，再向PCR扩增管中加入稀释后的标准保存 液、上游引物、下游引物、定量PCR试剂盒以及无菌水后进行定量PCR反应，并于反应结束后 测定Ct值，最后以稀释倍数的倒数的常用对数为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标拟合标准 曲线方程；
[0028] 噬菌体效价的测定：向PCR扩增管中加入待测噬菌体保存液、上游引物、下游引 物、定量PCR试剂盒以及无菌水后进行定量PCR反应，并于反应结束后测定Ct值，然后将测 定的Ct值带入标准曲线方程中计算出嗜盐古生菌噬菌体SNJl的效价。
[0029] 所述定量PCR反应条件为：先于95°C下变性4min，然后依次进行34个PCR循环，最 后于KTC停止PCR反应，其中，每个所述PCR循环都依次包括95°C变性15s、56°C退火30s、 72°C延伸 30s。
[0030] 所述标准曲线的建立步骤中，稀释后的标准保存液的体积为1 μ L，上游引物、 下游引物的浓度均为5μπι〇1/1，它们的体积均为lyL，定量PCR试剂盒为2XTaq PCR MasterMix，其体积是10 μ L，无菌水的体积为7 μ L ;
[0031] 所述噬菌体效价的测定步骤中，待测噬菌体保存液的体积为1 μ L，上游引物、 下游引物的浓度均为5μπι〇1/1，它们的体积均为lyL，定量PCR试剂盒为2XTaq PCR MasterMix，其体积是10 μ L，无菌水的体积为7 μ L。
[0032] 本发明的原理说明如下：
[0033] 本发明采用定量PCR法取代传统的双层平板噬菌斑计数法来测定嗜盐古生菌噬 菌体SNJl的效价，具有简便、快速、准确、重现性好等特点。为了保证测定方法的准确性和 重现性，本发明将定量PCR反应条件为：先于95°C下变性4min，然后依次进行34个PCR循 环，最后于KTC停止PCR反应，其中，每个所述PCR循环都依次包括95°C变性15s、56°C退火 30s、72°C延伸 30s。
[0034] 本发明中所述嗜盐古生菌噬菌体SNJl的保藏号为CCTCC No. AB91141，选用的定 量PCR试剂盒2 X Taq PCR MasterMix购自天根生化科技（北京）有限公司。
[0035] 实施例1 :
[0036] -种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的引物，所述引物包括：
[0037] 上游引物：5, -ACG AGT GGC GGC AGG TTT-3，、
[0038] 下游引物：5' -TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3，。
[0039] -种利用上述引物测定嗜盐古生菌噬菌体SNJl效价的方法，该方法依次包括以 下步骤：
[0040] 标准曲线的建立：先将嗜盐古生菌噬菌体SNJl的标准保存液用无菌水依次稀释 10倍、100倍、IO 3倍、IO4倍、IO5倍，再向PCR扩增管中加入稀释后的标准保存液1 μ L、浓度 均为 5 μ mol/L 的上游引物 5'-ACG AGT GGC GGC AGG ΤΤΤ-3'和下游引物 5'-TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3'各 1 μ L、2XTaq PCR MasterMixlOyU无菌水 7μ L后进行定量 PCR 反应， 然后于反应结束后测定Ct值，每个浓度重复三次取平均值，测定结果如下表：
[0041]
【权利要求】
1. 一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJ1效价的引物，其特征在于： 所述引物包括： 上游引物：5' -ACG AGT GGC GGC AGG TTT-3'、 下游引物：5' -TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3'。
2. -种利用权利要求1所述引物测定嗜盐古生菌噬菌体SNJ1效价的方法，其特征在 于： 该方法是指：先将待测噬菌体保存液与上游引物5'-ACG AGT GGC GGC AGG TTT-3'、下 游引物5'-TCC CGA TGA TGC GGT TGT-3'、定量PCR试剂盒以及无菌水混合进行定量PCR 反应，再于反应结束后测定Ct值，最后根据Ct值计算出嗜盐古生菌噬菌体SNJ1的效价。
3. 根据权利要求2所述的一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJ1效价的方法，其特征在于： 所述方法依次包括以下步骤： 标准曲线的建立：先取已知浓度的嗜盐古生菌噬菌体SNJ1的标准保存液用无菌水依 次稀释10倍、100倍、1〇3倍、1〇4倍、1〇5倍，再向PCR扩增管中加入稀释后的标准保存液、上 游引物、下游引物、定量PCR试剂盒以及无菌水后进行定量PCR反应，并于反应结束后测定 Ct值，最后以稀释倍数的倒数的常用对数为横坐标，以对应的Ct值为纵坐标拟合标准曲线 方程； 噬菌体效价的测定：向PCR扩增管中加入待测噬菌体保存液、上游引物、下游引物、定 量PCR试剂盒以及无菌水后进行定量PCR反应，并于反应结束后测定Ct值，然后将测定的 Ct值带入标准曲线方程中计算出嗜盐古生菌噬菌体SNJ1的效价。
4. 根据权利要求2或3所述的一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJ1效价的方法，其特征在 于： 所述定量PCR反应条件为：先于95°C下变性4min，然后依次进行34个PCR循环，最后于 10°C停止PCR反应，其中，每个所述PCR循环都依次包括95°C变性15s、56°C退火30s、72°C 延伸30s。
5. 根据权利要求3所述的一种测定嗜盐古生菌噬菌体SNJ1效价的方法，其特征在于： 所述标准曲线的建立步骤中，稀释后的标准保存液的体积为1UL，上游引物、下游引物 的浓度均为5iimol/L，它们的体积均为liiL，定量PCR试剂盒为2XTaq PCRMasterMix，其 体积是10 U L,无菌水的体积为7 ii L ; 所述噬菌体效价的测定步骤中，待测噬菌体保存液的体积为1 U L，上游引物、下游引物 的浓度均为5iimol/L，它们的体积均为liiL，定量PCR试剂盒为2XTaq PCRMasterMix，其 体积是10 U L,无菌水的体积为7 ii L。
【文档编号】C12Q1/68GK104328217SQ201410583708
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月27日 优先权日:2014年10月27日
【发明者】梅运军, 何聪聪, 黄咏驰 申请人:武汉轻工大学