专利名称：杂色鲍不同群体的微卫星鉴别方法
技术领域：
本发明涉及杂色鲍，尤其是涉及一种杂色鲍不同群体的微卫星鉴别方法。
背景技术：
杂色鲍(Haliotis diversicolor)是我国南方重要的水产养殖种类，主要分布于 热带、亚热带海域。现有的养殖种多为1990年代初从台湾引进群体的后代。伴随着杂色鲍 养殖产业的迅猛发展，大规模流行性疾病不断发生，杂色鲍养殖产量急剧下降。导致病害流 行的原因，除了技术和环境之外，养殖鲍种质的退化是根本性问题。因此，研究开发杂色鲍 的种质改良技术、培育杂色鲍新品种是当务之急，同时也是解决这一问题的根本途径。但在 实际的养殖生产中，因为养殖户和苗种企业普遍缺乏种质资源的保护意识，所以导致很多 养殖群体谱系不清楚，容易引起某一品种的退化和混乱，要维持杂色鲍养殖产业的持续发 展和种质资源的保护，急需对杂色鲍的群体遗传结构进行分析鉴定。在水产动物生产和育 种中，准确的系谱鉴定对于确定个体选留、培育优良苗种也非常重要，同时对于一些育种工 作来说，准确地鉴定群体的遗传结构，才能充分地发挥利用杂种优势来培育新品种具有的 重要意义。“东优1号”杂色鲍系利用杂色鲍台湾群体选育系作为母本，日本群体选育系作为 父本，采用杂交技术培育出的具有明显杂种优势的新品种，该新品种于2009年通过全国水 产原种和良种审定委员会审批，获得国家级水产新品种证书。“东优1号”杂色鲍目前已在 福建、广东和海南多个鲍鱼养殖集中区进行示范推广养殖。示范养殖结果表明，该品种抗病 力强、养成存活率较对照组提高35%以上，增产效果明显。鉴于“东优1号”杂色鲍养殖的 实际情况，采用简单快捷的方式来鉴定“东优1号”及其双亲群体一杂色鲍台湾群体和杂色 鲍日本群体，具有非常重要的意义。在水产养殖领域，微卫星标记的开发和应用日趋增多。在海洋贝类，近年来国 夕卜也相继 艮道了太平洋牡贩(Crassost reagigas) (Magoulas A, Gjetvaj B, Terzoglou V, et al. Three polymorphic microsatellites in the Japanese oyster, Crassost reagigas (Thunberg) [J]. Anim Genet, 1998,29 :69-70.) > @ yjfl 牛土 M (Ost reaedulis) (Naciri Y, Vigouroux Y, Dallas J,et al. Identification and inheritance of (GA/TC) η and (AC/GT)η repeats in the European flat oyster Ost reaedulis(L. )[J]. Mol Mar Biol Biotechnol，1995，4 :83-89.)、自皮纹盘鲍(Haliotis discus hannai) (Li Q, Park C, Kijima A. Isolation and characterization of microsatellite loci in the Pacific abalone, Haliotis discus hannai [J] .J Shellfish Res, 2002, 21 :811_815)等多种贝类 微卫星标记的分离，并已应用于种群结构分析、种质鉴定、遗传图谱构建等研究领域。Huang 等(Huang B X，Peakall R, Hanna P J. Analysi s of genetic structure of blacklip abalone (Haliotis rubra)populations using RAPD, minisatellite and microsatellite markers [J] · Mar Biol, 2000,136 207-216.)用 3 个微卫星、2 个小卫星 和RAPD分析了澳大利亚沿海10个地理种群的100个黑唇鲍个体，发现种群之间存在显著的遗传分化° Launey 等(Launey S, Ledu C, Boudry P, et al. Geographic structure in the European flat oyster, Ost reaedulis L. ， as revealed by microsatellite polymorphism [J], J Hered，2002，93 =331-351)用5个微卫星标记分析了从挪威至黑海的 欧洲沿海15个欧洲牡蛎种群的遗传分化，结果表明，杂合度期望值差异明显，种群间存在 显著的地理隔离。在皱纹盘鲍的相关研究中，Li等(Li Q，Park C，Endo Τ, et al. Loss of genetic variation at microsatellite loci in hatchery strains of the Pacific abalone(Haliotis discus hannai) [J] · Aquaculture，2004，235 :207_222)用 6 个微卫星 标记分析了 3个皱纹盘鲍养殖群体和2个野生群体的共380个个体，结果表明所有养殖种 群的等位基因数和平均杂合度期望值都显著低于野生种群，其中等位基因数平均减少了 76%，证实了皱纹盘鲍养殖种群建立时瓶颈效应的发生。Evans等(Evans B, Bartlett J， Sweijd N, et al. Loss of genetic variation at microsatellite loci in hatchery produced abalone in Australia(Haliotis rubra)and South Africa(Haliotis midae) [J], Aquaculture, 2004, 233 :109-127)分别用3和5个微卫星标记研究了南非的中间鲍 Haliotis midae和澳洲黑唇鲍Haliotis rubra的6个养殖种群，发现同野生种群相比所 有养殖种群的遗传多样性都普遍下降，等位基因数减少了 35% 62%。从上述结果可以看 出，在育苗生产中进行人工苗种的遗传监测，对于保护贝类养殖种群的遗传多样性至关重 要。迄今为止，未见能够同时鉴定不同地理群体的杂色鲍的研究结果，因此，筛选能够 同时鉴别杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体和“东优1号”杂色鲍微卫星标记对于杂色鲍种 质资源的保护和新品种的推广都具有十分重要的意义。目前，杂色鲍不同群体的鉴定方法主要是通过杂色鲍足部肌肉颜色、壳形等形态 学方法鉴定，受环境和人为因素影响较大；相比较而言，以DNA为基础的分子标记技术如微 卫星(SSR)技术，由于其呈共显性遗传，具有检测位点多、多态性好、结果可重复性强、不受 人为因素和环境影响等优点，而广泛应用于动植物的DNA指纹图谱和种质鉴定方面。另外， 本专利采用的DNA池法，可以使PCR扩增的模板数目数十倍的降低，大大减少PCR反应次 数，减少实验人员工作量和实验中药品的消耗。2步PCR法可以将不同退火温度的引物在相 同的PCR反应程序中进行，缩短实验时间。DNA池法和2步PCR法的有机结合，在大大提高 引物筛选效率、保证引物筛选的准确性的同时，节约了实验成本。
发明内容
本发明的目的是提供一种不仅具有客观、快速、准确、经济等优点，而且对于种质 资源的保护、遗传育种、“东优1号”新品种的推广有着重要意义的杂色鲍不同群体的微卫星 鉴别方法。本发明包括以下步骤1)采用碧云天基因组DNA小量抽提试剂盒提取杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群 体、杂色鲍“东优1号”群体这三个群体的基因组DNA ；2)采用2步PCR法进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的引物序列为引物3_52，正向引物TCGTAAACGTGTTCTCTGCG；
反向引物TCGCGAAAAGTGTAATATCGAA；3)将PCR扩增反应产物进行毛细管电泳，得杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体和 “东优1号” 3个群体的特异性等位基因。在步骤2)中，所述PCR扩增反应的反应总体积可为10μ 1，采用杂色鲍的群体 DNA池作为PCR扩增反应的模板，在每个PCR扩增反应体系中加入20 40ng，10XPCR缓 冲液(Tris-HCl pH8. 5 100mmol/L、KCl 500nmol/L、MgCl2 15nmol/L, ) 1 μ 1, Mg2+(25mmol/ L)0. 6μ 1，dNTP (2. 5mmol/L)0. 8μ 1,反向引物(lOOng/μ 1) 0· 6 μ 1，正向引物(lOOng/ μ 1)0. 4 μ 1，rTaq(5U/y 1)0. 1 μ 1，加双蒸水补体系至10 μ 1 ；所述PCR扩增反应的程序可 为94°C 5min — (94°C 30s — 57°C 30s ^ 72°C 30s) X 20 个循环一(94°C 30s ^ 53°C 30s — 72°C 30s) X 15 个循环—72°C 15min — 10°C保存。在步骤3)中，所述将PCR扩增反应产物进行毛细管电泳，可采用QIAxcel公司生 产的型号为5370的毛细管电泳仪，电泳卡夹可购自QIAGEN公司，电泳卡夹可选择高分辨率 (1200Runs)卡夹，电泳分型方法可采用机器自带软件BioCalculator中0M800. mtd方法， PCR产物分型结果使用BioCalculator软件分析，数据统计。所得杂色鲍台湾群体特异性等位基因范围为258 271bp。所得杂色鲍日本群体特异性等位基因为195bp。所得“东优1号”杂色鲍群体特异性等位基因为223bp。由于本发明采用DNA池法和2步PCR法，结合分子标记技术、毛细管电泳技术等， 找到杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体、杂色鲍“东优1号”群体的特异性片段，进而鉴别杂 色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体、杂色鲍“东优1号”群体，因此本发明的结果可靠，可重复 性好。实验结果表明，引物3-52可以准确地区分杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体和“东优 1号”杂色鲍3个杂色鲍群体。
图1为杂色鲍台湾群体引物3-52PCR扩增反应结果峰图。在图1中，左峰为 258. 4bp，右峰为 270. 5bp。图2为杂色鲍日本群体引物3-52PCR扩增反应结果峰图。在图2中，峰为195. Ibp0图3为杂色鲍“东优1号”群体引物3-52PCR扩增反应结果峰图。在图3中，左峰 为 208. 9bp，右峰为 222. 5bp。
具体实施例方式实施例1从杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体和杂色鲍“东优1号”这3个群体中，每个群体 分别选取32个个体，提取基因组DNA，测定DNA浓度，将每个群体的32个个体的基因组DNA 等量混合成群体DNA池，PCR扩增反应的反应总体积为10 μ 1，采用杂色鲍的群体DNA池作 为PCR扩增反应的模板，在每个PCR扩增反应体系中加入28ng，10XPCR缓冲液(Tris-HCl pH8. 5 100mmol/L、KCl 500nmol/L、MgCl2 15nmol/L, ) 1 μ 1, Mg2+(25mmol/L) 0. 6 μ 1, dNTP (2. 5mmol/L)0. 8μ 1,反向引物(lOOng/μ 1) 0. 6 μ 1，正向引物(lOOng/μ 1)0. 4 μ 1， rTaq (5U/ μ 1) 0. 1 μ 1，加双蒸水补体系至10 μ 1。
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引物序列为引物3-52:正向引物TCGTAAACGTGTTCTCTGCG反向引物TCGCGAAAAGTGTAATATCGAAPCR 扩增反应程序为94°C 5min — (94°C 30s — 57°C 30s — 72°C 30s) X 20 个 循环—(94°C 30s — 53°C 30s — 72°C 30s) X 15 个循环一72°C 15min — 10°C保存。PCR扩增反应产物进行毛细管电泳，仪器使用QIAxcel公司生产的毛细管电泳 仪(型号5370)，电泳卡夹(购自QIAGEN公司)选择高分辨率(1200RimS)卡夹，电泳 分型方法为机器自带软件BioCalculator中0M800.mtd方法，PCR产物分型结果使用 BioCalculator软件分析，得到杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体和“东优1号”3个群体的 特异性等位基因。①日本群体特异性等位基因为195bp。②“东优1号”实验组特异性等位基因为223bp。③台湾群体特异性等位基因范围为258 265bp。实施例2从杂色鲍台湾群体、日本群体和“东优1号”这三个群体中，每个群体分别选取 45个个体，提取基因组DNA，测定DNA浓度，将每个群体的45个个体的基因组DNA等量 混合成群体DNA池，PCR扩增反应的反应总体积为10 μ 1，采用杂色鲍的群体DNA池作为 PCR扩增反应的模板，在每个PCR扩增反应体系中加入35ng，10 X PCR缓冲液(Tr i s-HC 1 pH8. 5 100mmol/L、KCl 500nmol/L、MgCl2 15nmol/L, ) 1 μ 1, Mg2+(25mmol/L) 0. 6 μ 1, dNTP (2. 5mmol/L)0. 8μ 1,反向引物(lOOng/μ 1) 0. 6 μ 1，正向引物(lOOng/μ 1) 0. 4 μ 1， rTaq (5U/ μ 1) 0. 1 μ 1，加双蒸水补体系至10 μ L·引物序列为引物3-52:正向引物TCGTAAACGTGTTCTCTGCG
反向引物TCGCGAAAAGTGTAATATCGAAPCR 扩增反应程序为94°C 5min — (94°C 30s — 57°C 30s — 72°C 30s) X 20 个 循环—(94°C 30s — 53°C 30s — 72°C 30s) X 15 个循环一72°C 15min — 10°C保存。PCR扩增反应产物进行毛细管电泳，仪器使用QIAxcel公司生产的毛细管电泳 仪(型号5370)，电泳卡夹(购自QIAGEN公司)选择高分辨率(1200RimS)卡夹，电泳 分型方法为机器自带软件BioCalculator中0M800.mtd方法，PCR产物分型结果使用 BioCalculator软件分析，得到杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体和“东优1号”3个群体的 特异性等位基因。①日本群体特异性等位基因为195bp。②“东优1号”实验组特异性等位基因为223bp。③台湾群体特异性等位基因范围为260 271bp。
权利要求
杂色鲍不同群体的微卫星鉴别方法，其特征在于包括以下步骤1)采用碧云天基因组DNA小量抽提试剂盒提取杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体、杂色鲍“东优1号”群体这三个群体的基因组DNA；2)采用2步PCR法进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的引物序列为引物3 52，正向引物TCGTAAACGTGTTCTCTGCG；反向引物TCGCGAAAAGTGTAATATCGAA；3)将PCR扩增反应产物进行毛细管电泳，得杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体和“东优1号”3个群体的特异性等位基因。
2.如权利要求1所述的杂色鲍不同群体的微卫星鉴别方法，其特征在于在步骤2)中， 所述PCR扩增反应的反应总体积为10 μ 1，采用杂色鲍的群体DNA池作为PCR扩增反应的 模板，在每个PCR扩增反应体系中加入20 40ng，10XPCR缓冲液，所述10XPCR缓冲液 的组成为 Tris-HCl pH8. 5 100mmol/L、KCl 500nmol/L、MgCl2 15nmol/L, 1 μ 1,Mg2+25mmol/ L 0. 6μ 1, dNTP 2. 5mmol/L 0. 8 μ 1，反向引物 IOOng/μ 1 0. 6 μ 1，正向引物 IOOng/μ 1 0· 4 μ 1，rTaq 5U/μ 1 0· 1 μ 1，加双蒸水补体系至 10 μ 1。
3.如权利要求1或2所述的杂色鲍不同群体的微卫星鉴别方法，其特征在于在步骤2) 中，所述 PCR 扩增反应的程序为94°C 5min— (94°C 30s-57 °C 30s-72 °C 30s)X20 个 循环—(94°C 30s — 53°C 30s — 72°C 30s) X 15 个循环一72°C 15min — 10°C保存。
4.如权利要求1所述的杂色鲍不同群体的微卫星鉴别方法，其特征在于在步骤3)中， 所述将PCR扩增反应产物进行毛细管电泳，是采用QIAxcel公司生产的型号为5370的毛 细管电泳仪，电泳卡夹购自QIAGEN公司，电泳卡夹选择分辨率为1200Runs的卡夹，电泳 分型方法采用机器自带软件BioCalculator中0M800. mtd方法，PCR产物分型结果使用 BioCalculator软件分析，数据统计。
全文摘要
杂色鲍不同群体的微卫星鉴别方法，涉及杂色鲍。提供一种不仅具有客观、快速、准确、经济等优点，而且对于种质资源的保护、遗传育种、“东优1号”新品种的推广有着重要意义的杂色鲍不同群体的微卫星鉴别方法。采用碧云天基因组DNA小量抽提试剂盒提取杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体、杂色鲍“东优1号”群体这三个群体的基因组DNA；采用2步PCR法进行PCR扩增反应，所述PCR扩增反应的引物序列为引物3-52；将PCR扩增反应产物进行毛细管电泳，得杂色鲍台湾群体、杂色鲍日本群体和“东优1号”3个群体的特异性等位基因。
文档编号C12Q1/68GK101956001SQ20101024913
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者战欣, 柯才焕, 游伟伟, 范飞龙, 骆轩 申请人:厦门大学