专利名称：菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白及其制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程，具体的说是一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白及其制备和应用。
背景技术：
细胞因子(cytokine)由免疫活性细胞和其它细胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白质的统称，是参与固有免疫应答功能最多样且最重要的一类免疫效应分子。目前已发现上百种细胞因子，并对其来源、分子结构、相应的受体、信号转导、生物学功能以及与临床关系进行了大量研究，特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已成功应用于肿瘤、 炎症、造血功能障碍等疾病治疗，具有非常广阔的应用前景。鉴于细胞因子广泛的免疫调节作用、在病害防治方面潜在的巨大应用价值及其在揭示免疫系统演化等方面的重要意义，在更低等的生物中寻找细胞因子，一直是免疫学的热点问题。近年来，通过基因组学的研究，陆续发现果蝇、海胆、海鞘中存在一种重要细胞因子类型一肿瘤坏死因子(TNF)。TNF是机体免疫调控的关键组分，其功能活性包括诱发细胞凋亡、介导细胞毒反应、提高吞噬细胞吞噬活性、诱导相关细胞因子和免疫效应物质的表达等多种功能，在机体的正常或病理条件下均发挥着重要的调控作用。然而，与高等动物广泛深入的研究状态相比，无脊椎动物TNF的研究刚刚起步，目前除了个别物种中的基因序列， TNF其他信息严重匮乏，尤其缺乏对其功能的明确认识。贝类是我国优势海水养殖对象，2007年的产量达1067万吨，占全国海水养殖总产量的77%，其中双壳贝类产量占海水贝类养殖产量的95%以上。贝类养殖在我国沿海经济社会发展中占据举足轻重的地位，并具有巨大的发展潜力，但良种缺乏和病害问题的困扰一直是产业进一步发展的主要制约因素。从贝类自身的免疫防御系统入手，阐明重要效应分子TNF的基因结构和功能，将有助于深入探讨贝类免疫防御机制，为病害防治和良种选育提供新思路。
发明内容
本发明目的在于提供一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白及其制备和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白=RpTNF基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO. 1 中氨基酸序列所示。菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白的制备1)以菲律宾蛤仔RpTNF编码区为模板，采用Pl和P2为引物进行PCR扩增，待用；2) PCR扩增产物与PMD18-T载体通过T4连接酶连接，而后将连接产物与pET21a载体经Nde，XhoI双酶切后连接；3)将上述构建载体转入BL21(DE3)plysS菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性， 即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF ；
所述因为Pl 和 P2 分别为 Pl :5，-CATATGAAACCAGCTGCAAAACT-3，;P2 :5，-CTCGAGT TAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTATCAGATTTACTCC-3’。所述步骤幻经诱导培养后采用镍柱纯化获得变性重组蛋白，而后透析复性。所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF具有杀伤肿瘤细胞的作用。本发明所具有的优点1.适用范围广。本发明可用于多种具有潜在活性蛋白的重组表达。2.过程简单高效。本发明操作简单，只需常规的连接、转化以及测序筛选就可完成载体构建的过程；且获得的重组蛋白活性特征明显，如本发明中的RpTNF蛋白就是第一个有生物学活性的海洋无脊椎动物细胞因子。3.构建的载体对表达蛋白干扰小。利用本发明获得的重组蛋白没有表达载体上多余肽段或氨基酸残基，不影响其活性，且不需要酶切就可以直接进入下一步实验，如抗体制备，晶体结构分析等。
图1为本发明实施例采用MTT法检测不同浓度RpTNF重组蛋白对肿瘤细胞生长的抑制率。
具体实施例方式实验例1菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白，序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示。SEQ ID NO. 1MDKKLKNISMFVLLLVVVCLMAVLALVWSMPDIPKTVKTSELCLPSEIGLLKCGSTVDLLHDYLEREIATKYDEVKRQNQKKQENHLKEVSARLMNIYDKSFWEMKPAAKLTGKEQPDLRKTDSNADMVPIREWRNGRELYDTKGFIRYGIRYRNGRLVVPVDGTYFIYSNIDFFESCNPSSGLPDIKDINKPIKHGIFKFNILEGEENELVSNVQPHTISTNRYYNSYSSYVSSLAELKA⑶ELSVKVSNITYIRYTRDNYFGVNLI(a)序列特征 长度268个氨基酸 类型蛋白 链型双链(b)分子类型双链DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源菲律宾蛤仔(f)特异性名称PRT菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白的构建1.重组载体的构建本发明中采用的重组载体为Novagen公司的pET21a(+)原核表达载体。通过PCR技术，使用末端分别添加了 NdeJhoI特定酶切位点的基因特异性引物 Pl(5，-CATATGAAACCAGCTGCAAAACT-3，)和 P2(5，-CTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTATCAGATTTACTCC-3’)扩增菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF基因含TNF结构域的编码区片段。反应条件为首先94°C预变性5分钟，然后进入下列循环94°C变性30秒，60°C退火30秒，72°C 延伸30秒，共进行35个循环，最后72°C延伸7分钟。将PCR产物纯化回收，与pMD18_T载体连接。转化后，挑取单克隆利用上述载体引物M13-47 5' CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3 ‘和RV-M 5 ‘ GAGCGGATAACAATTTCACACAGG进行菌落PCR筛选并测序，验证测序正确后用质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒(大连宝生物工程有限公司)，待用；使用Nde，XhoI双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产物纯化回收； 纯化片段与经Nde，XhoI双酶切的表达载体pET-21a连接，完成载体的构建。2.重组蛋白的表达以BL21(DE3)-plysS为重组表达菌株，将上述构建的重组载体和空载体转化到表达宿主菌，挑取单克隆，提取质粒，测序验证读码框正确。挑取单克隆， 接种于50mL LB液体培养基中，37°C震荡摇床中培养12-16小时，然后以1 100的比例接种于200mL LB液体培养基中，37°C培养至0D600 = 0. 5-0. 7。加入IPTG，使终浓度达到 Immol/mL，继续培养4h。4°C，5000rpm，离心lOmin，收集菌体，于_20°C冻存备用。取Iml菌液离心，弃去上清后，加入80 μ L水和20yL 5X蛋白上样缓冲液(购自碧云天生物公司)， 100°C沸水煮沸10分钟，离心，SDS-PAGE检测表达产物。3.重组蛋白的纯化与复性将上述所得蛋白采用镍琼脂糖凝胶FF纯化获得了变性重组蛋白，用透析缓冲液透析复性。用具体操作步骤如下镍琼脂糖凝胶FF色谱分离带His标签的重组蛋白(1)镍琼脂糖凝胶FF装柱，1. 6 X 20cm,柱床体积为IOml ；(2)用缓冲液 1 (1. 14g L-lNaH2P04,14. 5g L-1 Na2HP04,29. 3g L,aCL，480g L—1 尿素；.平衡2-5个床体积，流速为2mLmirT1 ；(3)将 20ml 细胞破碎液(50mM PBS, ρΗ7· 4，0. 5Μ NaCl) 0. 45 μ m 滤膜过滤，上样， 流速为ImL mirT1 ；(4)用缓冲液1再洗2-5个床体积，流速为mL mirT1 ；(5)用分别含10、20、50、100、200、300、400mM的咪唑的缓冲液3进行阶段洗脱，流速为2mL mirT1，收集各阶段洗脱峰，用SDS-PAGE检测融合蛋白的表达；(6)用纯水流洗5个柱床体积，再用20 %的乙醇流洗3个柱床体积，流速为2mL mirT1，柱子置于4°C环境中保存变性状态下提纯的重组蛋白需要在适当的复性缓冲液中通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠。变性纯化产物经2mM的还原谷胱甘肽、0. 2mM氧化谷胱甘肽、ImM EDTA、50mM Tris-HClUOOmM NaCl、10%甘油、1 %甘氨酸及梯度降低的尿素透析复性，尿素浓度从起始的6M逐渐替换到4M、3M、2M、0M，最后一次透析至无尿素的透析液时不加甘油。每次在4°C透析12h，即得到菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白。实例2重组蛋白的抗肿瘤生长活性分析以肿瘤细胞7402为靶细胞，检测实施例1所得RpTNF蛋白对肿瘤细胞的杀伤作用。调整肿瘤细胞浓度为l_5X105/ml，取96孔板每孔加入IOOul细胞悬液，置37°C， 5% CO2及饱和湿度条件的培养箱孵育过夜；第2天预先将不同浓度的重组蛋白为加入细胞培养液，每组设6个复孔，并设细胞对照组(无任何添加)和空白孔(只加培养基)；将培养板放入C02培养箱，在37°C，5% C02及饱和湿度条件下，培养72h ；每孔加入MTT溶液(5mg/ml)10ul，37°C继续培养4h，避光；终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入 150ul DMS0，轻微振荡IOmin ；在酶标仪上选择490nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光值 (A值)。结果如图1。本发明序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF可作为饲料添加剂。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白，其特征在于=RpTNF基因重组蛋白为序列表 SEQ ID NO. 1中氨基酸序列所示。
2.一种按权利要求1所述的菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白的制备，其特征在于1)以菲律宾蛤仔RpTNF编码区为模板，采用Pl和P2为引物进行PCR扩增，待用；2)PCR扩增产物与pMDIS-T载体通过T4连接酶连接，而后将连接产物与pET21a载体经 Nde, XhoI双酶切后连接；3)将上述构建载体转入BL21(DE3)plysS菌株中进行诱导培养，而后纯化、复性，即得到具有序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF ；所述因为 Pl 和 P2 分别为 Pl :5，-CATATGAAACCAGCTGCAAAACT-3，;P2 :5，-CTCGAGTTAGT GGTGGTGGTGGTGGTGTATCAGATTTACTCC-3’。
3.按权利要求1所述的菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白的制备，其特征在于所述步骤3)经诱导培养后采用镍柱纯化获得变性重组蛋白，而后透析复性。
4.一种按权利要求1所述的菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白的应用，其特征在于所述序列表SEQ ID NO. 1中氨基酸序列的重组蛋白RpTNF具有杀伤肿瘤细胞的作用。
全文摘要
本发明涉及基因工程，具体的说是一种菲律宾蛤仔RpTNF基因重组蛋白及其制备和应用。RpTNF基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示。采用通过PCR技术扩增菲律宾蛤仔肿瘤坏死因子RpTNF基因cDNA全长，并对其TNF结构域进行了原核重组表达。本发明操作简单，只需常规的连接、转化以及测序筛选就可完成载体构建的过程；且获得的重组蛋白活性特征明显，如本发明中的RpTNF蛋白就是第一个有生物学活性的海洋无脊椎动物细胞因子。
文档编号C12N15/70GK102372772SQ20101024887
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者宋林生, 王玲玲, 赵建民, 邱丽梅 申请人:中国科学院海洋研究所