专利名称：菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因及其重组蛋白和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗菌肽，具体涉及一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。
背景技术：
抗菌肽是生物体产生的一类由20-60个氨基酸组成的多肽，对真菌、细菌等病原微生物具有抑制或杀灭作用，通常被称为“第二防御体系”。根据抗菌肽结构和三维构象的差异，可将抗菌肽分为以下四类(1)具有α螺旋结构的线性肽，如蜂毒肽、蛙皮肽、天蚕抗菌肽等；(2)含有二硫键的β折叠结构，如防御素、昆虫防御肽等；(3)由一种或多种氨基酸为主构成的多肽，如富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)前体蛋白剪切而来的多肽，如淡水螯虾(Pacifastacus leniusculus)的血蓝蛋白C-端酶解后可产生具有抗菌活性的多肽。这类分子具有一些共同的特点在生物体内合成迅速；具有广谱抗菌活性，对细菌、真菌、原生动物等有作用，但对真核细胞无毒害；分子量一般在IOkDa以下；多数是阳离子分子。抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它们的靶位点主要是病原体的细胞膜以增加膜的渗透性，因此不易产生抗性。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，还可以杀灭真菌、病毒、寄生虫和肿瘤细胞，同时还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。在海洋贝类中，贻贝的抗菌肽研究较为透彻，根据其一级结构和二硫键形成的不同形式，贻贝抗菌肽又可分为四种类型防御素(defensins)、贻贝素 (mytilins)、贻贝肽(myticins)和贻贝霉素(mytimycins)。目前国内外关于菲律宾蛤仔抗菌肽及其抗菌活性的研究较少。赵建民等利用大肠杆菌原核表达系统，体外重组表达菲律宾蛤仔大防御素(VpBD)蛋白，具有广谱的抗革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌。
发明内容
本发明目的在于提供一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因所述防御素Defensin A基因为序列表 SEQ ID NO. 1中碱基序列所示。一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因重组蛋白所述防御素Defensin A基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因重组蛋白的应用所述防御素Defensin A基因重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。所述防御素Defensin A基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌。
本发明所具有的优点1.本发明从菲律宾蛤仔中克隆到防御素Defensin A的全长cDNA序列，实现其重组表达并测定其抗菌谱和最小抑菌浓度，为菲律宾蛤仔的病害防治、基因辅助选育及进一步开发为医药产品和保鲜防腐剂奠定基础。2.与现有技术相比，本发明的防御素Defensin A为菲律宾蛤仔抗菌肽，对海洋来源的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有很强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值。
具体实施例方式以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。本发明菲律宾蛤仔防御素Defensin A的制备方法1)总RNA提取用Trizol试剂从感染鳗弧菌的菲律宾蛤仔的血淋巴中提取总 RNA，存于_80°C备用；提取方法依hvitrogen公司的Trizol试剂说明书进行；2)mRNA纯化用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA ；纯化方法依据QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行；3) cDNA模板制备用cDNA合成试剂盒(购于Mratagene公司)将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作方法依试剂盒说明书进行包括双链cDNA经末端补平、 EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Bio I内切酶酶切等，用QIAEX II胶纯化试剂盒(购于QIAGEN公司)对大于IOObp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与Uni-ZAP XR载体 (购于 hvetrogen 公司)连接，得到是 cDNA 质粒，用 ZAP- cDNA Gigapack III Gold Cloning试剂盒(购于Mratagene公司)对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定、噬菌体文库扩增，扩增后的噬菌体文库加入体积百分终浓度为7%的二甲基亚砜(DMSO)，得到含防御素基因的cDNA模板溶液，存于-80°C ；具体包装、测定和扩增方法依试剂盒说明书进行；4)基因克隆对上述含防御素基因的cDNA模板进行PCR扩增得到PCR产物，PCR扩增的上游引物的核苷酸序列为(正向引物序列5，-GGGTTTGGTTGCCCTGAAGA-3’，反向引物的核苷酸序列为5’ -CTATTCTTGAATAGATCTCC-3’，)PCR产物用胶回收试剂盒(购于上海中科开瑞生物芯片公司)进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与pMD-18T 载体(购于大连宝生物工程有限公司)连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌T0P10F 感受态细胞(购于北京全氏金生物技术有限公司)中，挑选阳性克隆质粒提取，得到防御素基因Defensin A的克隆质粒；3，端PCR扩增的反应体系和反应条件为10XPCR缓冲液2. 5μ l、25mM的MgCl2 1. Ομ 1、2. 5mM的dNTP 2. O μ 1、10 μ M的所述正向引物溶液1 μ 1、10 μ M的通用引物Τ7溶液 1 μ 1、浓度为5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1，用PCR水定容到 25μ1;反应在ABI Veriti (购于ABI公司)中进行，反应条件为首先94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共进行；34个循环，最后72°C 延伸IOmin ;5，端PCR扩增反应体系和反应条件为10XPCR反应缓冲液2. 5 μ l、25mM的 MgCl2溶液1. Ομ 1、2. 5mM的dNTP溶液2.0μ 1、10μΜ的所述反向引物溶液1μ 1、10μΜ的通用引物Τ3溶液1 μ 1、浓度为5U/ μ 1的Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1， 用PCR水定容到25 μ 1，反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5min,然后进入下列循环94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共进行；34个循环，最后 72°C延伸 IOmin ；上述PCR buffer溶液、dNTP、PCR水、iTaq DNA聚合酶均购自Promega公司，通用引物T7、通用引物T3购自上海生工科技有限公司。5)重组质粒构建对防御素基因Defensin A的克隆质粒进行扩增反应，扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列(5’ -CATATGGGGTTTGGTTGCCCTGAAGA-3’，其中划线上的序列表示Nde I酶切位点)，反向引物为含Β ο I酶切位点和6个His纯化标签的 5，-CTCGAGCTA jGTGGTGGTGGTGGTGGTG|' TTCTTGAATAGATCTCC-3，，下划线为 Xho I 酶切
位点，方框为His纯化标签)核苷酸序；将扩增片段纯化回收，导入PMD18-T simple (购于大连宝生物工程有限公司)载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌TOPlO感受态细胞(购于北京全式金生物技术有限公司)中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I 和B10 I (均购于NEB公司)双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的抗菌肽重组基因，测序该抗菌肽重组基因，该抗菌肽重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，将该抗菌肽重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21a(购于Novagen公司)，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法扩增反应条件为首先94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，共进行30个循环，最后72°C 延伸IOmin ；6)防御素Defensin A重组基因表达将上述重组质粒转入表达宿主菌 BL21 (DE3) -plysS (北京全式金生物技术有限公司)，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml LB (上海生工科技有限公司)培养基中， 220rpm，37°C培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7，加入异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，使终浓度达至Ij 0. 6mmol/ml，继续培养5小时，4°C，5000rpm，离心lOmin，收集菌液；7)重组蛋白纯化对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、 溶解、镍柱亲和层析纯化。最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的菲律宾蛤仔防御素Defensin A，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，具体纯化方法依蛋白纯化试剂盒的说明书操作。实施例
菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因为SEQ ID No. 1中所示的碱基序列。
序列表SEQ ID No. 1为:
caacaggtttagcactcaacggcgaaaatgaggacgatgattgcttttactgtttttatc
cttcttgcagctatgtttttgcaagacgttgatgccgggtttggttgccctgaagatgaa
tatgagtgccacaaccattggtcggttgtaggggcggctattgtgatgcc
gggacattacgtcagaggtgcacttgttacggttgcaaccaaaaagggagatctattcaa
gaatagaactcatcacagcaccaacacgcaatcaagtttctaacaatctacgaactgtct
tattgaactg3.3.3.3. 3. 3. 3.aagaacaattttccaagttattaactccgt
tcttacattaatcttgcaaa
(a)序列特征
长度410bp (有效长度^-246bp)
5
类型碱基序列 链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型双链DNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源菲律宾蛤仔(Venerupis philippinarum)(f)特异性名称cDNA该基因eDNA全长410bp，5，非编码区长27bp，3，非编码区长164bp。该防御素基因含有219bp的开放阅读框，编码72个氨基酸，其中编码序列的1-23位氨基酸为信号肽序列，成熟肽为49个氨基酸。实施例2菲律宾蛤仔防御素Defensin A的制备一、用Trizol试剂从感染鳗弧菌的菲律宾蛤仔的血淋巴中提取总RNA，得到总 RNA，提取方法依hvitrogen公司的Trizol试剂说明书进行取菲律宾蛤仔血细胞50ml， 2000g离心lOmin，弃上清，向沉淀细胞中加入20ml的TRIZOL Gnvitrogen)，用高速分散器将细胞分散，室温下剧烈震荡IOs ；加入細1氯仿，剧烈震荡30s ；4°C 10，OOOg高速离心 IOmin ；吸取上清液于一个新离心管中，加入冰浴过的等体积异丙醇(约15ml)，置于_20°C 静置1小时以上；4°C 10，OOOg高速离心IOmin ；小心弃去上清液；用5ml 70%的乙醇清洗沉淀；4°C 10，OOOg高速离心lOmin，小心弃去上清液；真空干燥5min，用约600 μ 1高纯度无RNA酶水溶解RNA，待完全溶解后储存于-80°C备用。二、用Oligotex mRNA纯化试剂盒将上述总RNA纯化得到mRNA，具体纯化方法依 QIAGENE公司的Oligotex mRNA纯化试剂盒说明书进行包括在37°C水浴加热Oligotex Suspension,震荡混勻，室温放置；70°C水浴加热OEB缓冲液；向500 μ 1总RNA溶液(RNA含量约为 2mg)中加入650μ1 OBB 缓冲液，135μ1 of Oligotex Suspension, 650 μ 1 高纯度无RNA酶水，70°C加热体系:3min ；取出反应体系后，室温下放置lOmin，15，OOOg离心anin， 小心吸走上清液，用600 μ 1 0W2重悬Oligotex-mRNA沉淀，剧烈震荡。然后将悬浊液移入放在1. 5ml离心管中的离心柱内，15，OOOg离心lmin，将离心柱转移到一个新的1. 5ml离心管中，加入600 μ 1 0W2，15，000g离心lmin，将进入离心管的液体丢弃，将离心柱转移到另一新的1. 5ml离心管中；向离心柱中加入50 μ 1已经加热到70°C的OEB缓冲液，轻轻混勻， 15，OOOg离心Imin ；向离心柱再加入50 μ 1 OEB缓冲液，混勻后15，OOOg离心Imin ；回收离心管中的mRNA溶液约100 μ 1。三、用cDNA合成试剂盒将上述mRNA逆转录并酶切为酶切片段，具体操作依试剂盒说明书进行包括双链cDNA末端补平、EcoR I接头连接、EcoR I末端磷酸化、Xho I内切酶酶切等，用QIAEX II胶纯化试剂盒对大于IOObp的酶切片段进行回收，回收的酶切片段与 Uni-ZAP XR vector 载体连接，得到 cDNA 质粒，用 ZAP- cDNA Gigapack III Gold Cloning试剂盒对cDNA质粒进行噬菌体包装、滴度测定和噬菌体文库扩增，具体方法参照说明书进行，扩增后的文库加入终浓度为的DMSO溶液，得到cDNA模板溶液，存于_80°C
逆转录方法包括一链cDNA合成在无RNA酶的200 μ 1离心管中依次加入5X逆转录酶缓冲液10 μ 1与2. 5mM的dNTP 8. 5 μ 1，然后加入30 μ 1多聚腺苷酸(poly (A))引物和RNA (5 μ g)，混勻后室温下放置lOmin，向体系中加入1. 5 μ 1的一链合成酶Mratakript RT(50U/l·! 1)，终体积达到50 μ 1，轻轻混勻反应体系，离心数s，42°C温育1小时。二链合成在冰上向含有一链cDNA的离心管中加入IOX反应缓冲液10 μ 1，27 μ 1无核酸酶去离子水。然后再向反应体系中加入2μ 1核糖核酸酶H (RNase H) (1. 5U/μ 1)，11 μ 1 DNA聚合酶I (9. OU/ μ 1)，轻轻混勻反应体系，离心数s，16°C放置2. 5小时后立即将反应体系置于冰上。补平cDNA末端向二链合成体系中加入需用反应物(IOmM dNTP 6yl，T4DNA聚合酶 2 μ 1与2 μ 1浓度为10mg/ml的BSA)，快速震荡反应体系离心后，于72°C反应30min ；加入 200μ1酚-氯仿[1 1 (ν/ν)]，震荡混勻体系，室温下高速离心aiiin，转移上清至新的离心管中；加入等体积的氯仿，震荡混勻，室温下高速离心anin，然后转移上清至新管中；加入下列试剂使cDNA沉淀，并震荡体系20 μ 1 3Μ醋酸钠，400 μ 1 1无水乙醇，_20°C沉淀过夜；4°C高速离心60min，小心弃去上清，保留沉淀；加入500 μ 1的70 %乙醇轻轻洗涤沉淀， 室温高速离心anin ；轻轻吸去乙醇，在真空离心机中干燥沉淀；用9μ 1含有EcoR I接头的溶液溶解沉淀并于4°C放置至少30min。EcoR I接头的连接向体系中加入下列成分1 μ 1 IOX连接酶缓冲液，1 μ 1 IOmM rATP，1 μ 1 T4DNA连接酶0U/ μ 1)，离心后8°C放置过夜； 700C 30min灭活连接酶。磷酸化EcoR I末端离心反应物k，室温放置5min冷却，加入下列反应物用于磷酸化接头1μ 1 IOX连接酶缓冲液，2 μ 1 IOmM rATP,5y 1灭菌水，2 μ 1 Τ4多聚核苷酸激酶(5U/ μ 1)，37°C温育30min，70°C 30min灭活激酶，离心2s后室温放置 5min冷却。Bio I内切酶酶切向体系中加入下列成分J8 μ 1 Xho I酶切缓冲液，3μ1 Xho Ι(40υ/μ1)，37 温育1.5小时，加入125μ1的100% (ν/ν)乙醇，_20°C放置过夜，4°C离心60min，弃去上清，完全干燥沉淀，用50 μ 1灭菌双蒸水溶解沉淀。溶解后的cDNA溶液用 1.0%的琼脂糖凝胶中进行电泳分离。cDNA片段回收方法从浓度为1. 0%的琼脂糖凝胶上将大于IOObp的cDNA条带切下，将大约250mg的胶块放入1. 5ml离心管中，加入相当于3倍胶块体积的QXl缓冲液充分混勻，而后向含有胶块的QXl缓冲液中加入60 μ 1 QIAEX II，剧烈震荡30s，充分混勻，以 50°C加热lOmin，溶解胶块；每^iin震荡一次，保持溶液始终为黄色；13，OOOrpm离心30s， 小心吸去上清液；用500 μ 1 QXl缓冲液清洗沉淀，重悬沉淀，13，OOOrpm离心30s并小心吸去上清液；用500 μ 1 PE缓冲液清洗沉淀2次，重悬沉淀，13，OOOrpm离心30s，弃上清液，真空干燥15min至沉淀变白，加入20 μ 1 ρΗ8. 5的IOmM Tris-Cl溶液室温下溶解5min。cDNA与Uni-ZAP XR载体Qnvetrogen)连接在另一干净的200 μ 1离心管中依次加入下列试剂2. 5 μ 1 cDNA悬浮液(> IOOng)，0. 5 μ 1 IOX连接缓冲液，0. 5 μ 1 IOmM rATP (ρΗ7· 5)，1· 0 μ 1 Uni-ZAP XR 载体(1 μ g)，0. 5 μ 1 T4DNA 连接酶(4U/ μ 1)。12°C放置过夜。噬菌体文库的包装从-80°C冰箱中取出包装蛋白，迅速用手握住融化，立即加入 4μ 1重组cDNA，用微量移液器吸头混勻体系(不要产生气泡)，离心5s，室温(22°C )温育 2小时，加入500 μ 1的SM缓冲液和20 μ 1氯仿，轻轻混勻反应体系。快速离心数s，沉淀蛋白碎片，转移上清至新管中。包装反应的滴度测定在含有氨苄青霉素的LB固体培养基(1升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，pH7. 5)上将菌株大肠杆菌XLl-Blue MRF’ 划线37°C过夜培养；用LB液体培养基(1升培养基含有氯化钠10g，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，pH7. 5)培养单克隆菌落，300C，200rpm摇床培养过夜；4°C，IOOOg下离心IOmin沉淀细菌。用25ml IOmM MgSO4重悬细菌；用IOmM MgSO4重悬大肠杆菌XLl-Blue MRF’细胞，使浓度达到0D_ = 0. 5 ；将包装产物按下列比例与宿主菌混合(1) 1 μ 1包装产物和200 μ 1 浓度达到 0D_ = 0. 5 大肠杆菌 XLl-Blue MRF’ (OD600 = 0 . 5) ； (2) 0. 1 μ 1 包装产物和 200 μ 1 浓度达到OD6tltl = 0. 5大肠杆菌XLl-Blue MRF，(OD600 = 0 . 5)；将混合体系置于37°C温育 15min使噬菌体充分附着在宿主细胞表面；加入3ml融化状态下约48°C的NZY上层培养基 (1升培养基含有氯化钠5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺IOg,酵母提取物5g，琼脂糖7g，ρΗ7· 5)； 迅速铺在干燥预热过的NZY琼脂培养基(1升培养基含有氯化钠5g，MgSO4 · 7H20 2g，NZ胺 10g，酵母提取物5g，琼脂粉15g，pH7. 5)上，静置IOmin后，倒置于37°C过夜培养；8小时后可见噬菌斑；分别计数两个平板的噬菌斑数目，计算其滴度(每毫升生长的噬菌斑数目， pfu/ml)ο30°C 200rpm条件下，用LB液体培养基过夜培养大肠杆菌XLl-Blue MRF，细胞 50ml ； IOOOg离心宿主细胞IOmin ；用25ml IOmM MgSO4重悬细胞，测定600纳米可见光下菌液吸光度，然后用IOmM MgSO4将菌液稀释至浓度为OD6tltl = 0. 5 ；将含有大约5X lOYfu (嗜菌斑形成单位数)噬菌体颗粒的悬浊液与600 μ 1浓度为0D600 = 0. 5的大肠杆菌XLl-Blue MRF'细胞混合，置于Falcon 2059聚丙烯管中，37°C温育混合液15min，使噬菌体充分附着在宿主菌表面；将混合液加入约48°C的6. 5ml液态NZY上层培养基中，混勻后倒入新鲜的150mm NZY琼脂糖培养基平板上，静置平板lOmin，倒转平板置于37°C约8小时(噬菌斑直径不超过2mm)；在每块平板上倒入大约10ml SM缓冲液(1升缓冲液中含有5. 8g NaCl, 2. Og MgSO4 ·7Η20，50. 0ml IM Tris-HCl [ρΗ 7· 5]，5. 0ml 2% [w/v]白明胶)，4°C放置过夜； 将所有平板上的SM缓冲液回收入新的聚丙烯管中，每块平板再用aiil SM缓冲液清洗一次并回收上清液；向回收液中加入终浓度为5% (ν/ν)的氯仿，室温下放置15min，混勻，500g 离心IOmin去除细胞碎片，将上清液转移至新聚丙烯管中，并重复步骤8、9至上清液澄清， 加入终浓度为&八)01^0，储存于-801。测定扩增文库滴度(方法同前)。四、cDNA模板溶液中防御素基因的确认用Exassist Helper Phage和SOLR菌株 (Exassist Helper Phage 和 SOLR 菌株均购于 Mratagene 公司)从 Uni- ZAP XR Vector 上体外切割PBluescript噬菌粒(进行体外切割；然后质粒cDNA的大规模提取和测序分析获得目的EST序列，对上述EST测序结果，用BLASTn和BLASTx程序分析寻找出防御素基因片段。五、对上述含防御素基因的cDNA模板溶液进行PCR扩增得到PCR产物，PCR 扩增的(正向引物序列5 ’ -GGGTTTGGTTGCCCTGAAGA-3 ’，反向引物的核苷酸序列为 5‘-CTATTCTTGAATAGATCTCC-3‘), PCR产物用胶回收试剂盒进行回收和纯化得到PCR纯化产物，将所述PCR纯化产物与PMD-18T载体连接得到克隆质粒，克隆质粒转入大肠杆菌T0P10F 感受态细胞中，挑选阳性克隆质粒提取，得到防御素基因Defensin A的克隆质粒；3’端 PCR扩增的反应体系和反应条件为:10XPCR缓冲液2. 5μ l、25mM的MgCl2 1.0μ 1、2. 5mM WdNTP 2. 0μ 1、10μΜ的正向引物1μ 1、10μΜ的通用引物Τ71μ 1、浓度为5υ/μ 1的Taq DNA聚合酶0. 2 μ 1，cDNA模板(文库)1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1 ；反应在ABI Veriti PCR仪中进行，反应条件为首先94V预变性5min，然后进入下列循环94V变性30s，60°C退火30s，72°C延伸60s，共进行34个循环，最后72°C延伸IOmin ；5，端PCR扩增反应体系和反应条件为10XPCR 缓冲液 2. 5 μ l、25mM 的 MgCl2 溶液 1. 0 μ 1、2. 5mM 的 dNTP 溶液 2. 0 μ 1、 10 μ M的反向引物溶液1.0 μ 1、10 μ M的通用引物Τ3溶液1 μ 1、浓度为IU/μ 1的I^aq DNA 聚合酶0.2 μ 1，所述cDNA模板溶液1 μ 1，用PCR水定容到25 μ 1，反应在ABI Veriti PCR 仪中进行，反应条件为首先94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C变性30s，60°C退火 30s，72°C延伸60s，共进行34个循环，最后72°C延伸IOmin ；六、对防御素Defensin A基因的克隆质粒再进行扩增反应，(扩增反应正向引物为含有Nde I酶切位点的核苷酸序列5’ -CATATGGGGTTTGGTTGCCCTGAAGA-3’，反向引物为含Xho I酶切位点和6个His纯化标签的核苷酸序列5，-CTCGAGCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGT TCTTGAATAGATCTCC-3’)；将扩增片段纯化回收，导入pMD18_T载体，构建亚克隆质粒，转入大肠杆菌T0P10F感受态细胞中，筛选阳性亚克隆质粒，提取阳性亚克隆质粒，用Nde I和)(h0 I双酶切亚克隆质粒，用胶回收纯化试剂盒对酶切产生的目的片段纯化回收，得到编码重组蛋白的抗菌肽重组基因，测序该抗菌肽重组基因，该抗菌肽重组基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，将该抗菌肽重组基因导入经同样双酶切的表达载体pET-21 (a)，得到重组质粒；重组质粒构建具体依《分子克隆第三版》操作方法。扩增反应条件为首先94°C预变性5min，然后进入下列循环94°C变性30s，6(TC退火30s，72°C延伸30s，共进行30个循环，最后72°C延伸IOmin ；七、将上述重组质粒转入表达宿主菌BL21(DE3)plysS，(购于北京全式金生物技术有限公司)中，筛选阳性重组质粒，测序确认，挑取单克隆重组质粒，将单克隆重组质粒接种于200ml LB液体培养基中，220rpm，37°C培养至OD6tltl = 0. 5-0. 7，加入IPTG，使终浓度达到0. 6mM,继续培养5h, 4°C，5000rpm,离心IOmin,收集菌液；八、对上述菌液超声破碎、离心获得包涵体，并对包涵体进行洗涤、溶解、镍柱亲和层析纯化。最后对重组蛋白进行透析复性得到具有抗菌活性的重组蛋白，即本发明的菲律宾蛤仔防御素Defensin A，经测序，该重组蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2 所示；在收集的菌体沉淀中，加入适量的菌体裂解液(0.5M NaCiaOmM Tris-HCl,0. 5% Triton X-IOOpH 8. 5)重悬沉淀，超声波处理，条件为300W，处理200次，每次k，间隔 15s ；菌体裂解液在4°C下IOOOOrpm离心20min收集包涵体；包涵体沉淀分别用洗液I (0. 5M NaCl, IOmM Tris-HCl, 0. 5 % Triton X_100，2M 尿素 pH 8.5)和洗液 11(0. 5M NaCl, IOmM Tris-HCl, 0. 5% Triton X-100，2%脱氧胆酸钠pH 8. 5)洗涤一次后用8M尿素溶液(20mM PBS，0.5M NaCl，8M尿素，20mM咪唑pH 7.4)溶解；经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白采用逐渐降低尿素浓度的方法进行透析复性，透析缓冲液成分如下100mM Tris-HCl, 50mM NaCl, ImM EDTA，2mM还原型谷胱甘肽，0. 02mM氧化型谷胱甘肽，10%甘油，1 %甘氨酸，尿素 (6M，4M，3M，2M，0M)，pH 8. 5。透析缓冲液依次降低尿素的浓度，每次于4°C透析12小时，最后在TBS缓冲液(50mM Tris-HCl, IOOmM NaCl，pH 8. 5)中透析两次。重组蛋白浓度测定采用碧云天生物公司的BCA法测定蛋白浓度试剂盒(P0012)。具体操作依试剂盒说明书进行 根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B (50 1)配制适量BCA工作液， 充分混勻；完全溶解蛋白标准品，取10μ 1用PBS稀释至100μ 1，使终浓度为0. 5mg/ml ；将标准品按0，1,2,4,8,12，16, 20 μ 1加到96孔板的标准品孔中，用PBS溶液补足到20 μ 1 ；加适当体积样品到96孔板的样品孔中并用PBS补足到到20 μ 1 ；各孔加入200 μ 1 BCA工作液，37°C放置30min ；测定A562，根据标准曲线计算出蛋白浓度。菲律宾蛤仔防御素Defensin A编码蛋白具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，分子量为8035. 17Da，等电点为6. 02，其中编码序列的1_23位为信号肽序列，成熟肽分子量为 5434. 98Da，等电点为6. 86，有2个净正电荷。应用例将上述所得菲律宾蛤仔防御素Defensin A加入试管中制成浓度为0. 66mg/mL 抗菌肽液共9管，分别接种巴氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌以及副溶血弧菌各5μ 1 Staphylococcus sciuri、
Staphylococcus pasteuri、Vibrio alginolyticus、Enterobacter cloacae、Pseudomonas putida、Proteus mirabilis、Enterobacter aerogenes 以及 Vibrio parahaemolyticus)，
使每管最终菌液浓度约为5X 105CFU/ml，培养M小时后，利用酶标仪测定600nm的光吸收值，确定MIC值，得到如表1所示的结果，从表1中可以看出，菲律宾蛤仔防御素Defensin A 对上述革兰氏阳性菌(巴氏葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)和革兰氏阴性菌(溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、副溶血弧菌)都有效，说明本发明的菲律宾蛤仔防御素Defensin A是一种广谱抗菌肽，且疗效较好。其中巴氏葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌 37°C培养；溶藻弧菌、恶臭假单胞菌以及副溶血弧菌培养。具体步骤调节各菌至0D_为1后，稀释1000倍备用。在96孔板中每孔中加入 100 μ 1 LB液体培养基，再在每一行第一个孔中加入100 μ 1抗菌肽，混勻后从第一个孔中吸出100 μ 1加到第二个空中，混勻后吸出100 μ 1加到第三个孔中，依此类推，第10个孔中吸出的100 μ 1不再加到第11孔中。每行1-11孔中都接种稀释好的相应菌种5 μ 1，第12 孔为只含培养基的对照。培养Mh以上，测定吸光值，并计算相应MIC。最终测得菲律宾蛤仔防御素Defensin A对以上各种菌都有一定的抑制作用。表1 菲律宾蛤仔防御素Defensin A抗菌素疗效表
权利要求
1.一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因，其特征在于所述防御素Defensin A基因为序列表SEQ ID NO. 1中碱基序列所示。
2.一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因重组蛋白，其特征在于所述防御素 Defensin A基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO. 2中氨基酸序列所示。
3.—种权利要求1所述的菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因重组蛋白的应用，其特征在于所述防御素Defensin A基因重组表达产物可制备为抗菌药物、免疫增强剂、饲料添加剂、防腐剂或保鲜剂。
4.权利要求3所述的菲律宾蛤仔防御素DefensinA基因重组蛋白的应用，其特征在于所述防御素Defensin A基因重组表达产物可作为制备革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌的抑菌药物。
5.权利要求4所述的菲律宾蛤仔防御素DefensinA基因重组蛋白的应用，其特征在于革兰氏阳性菌为巴氏葡萄球菌或金黄色葡萄球菌；革兰氏阴性菌为溶藻弧菌、阴沟肠杆菌、恶臭假单胞菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌或副溶血弧菌。
全文摘要
本发明涉及抗菌肽，具体涉及一种菲律宾蛤仔防御素Defensin A基因及其重组蛋白、以及构建方法和应用。所述防御素Defensin A基因为序列表SEQ ID NO.1中碱基序列所示。基因重组蛋白为序列表SEQ ID NO.2中氨基酸序列所示。本发明的防御素Defensin A为菲律宾蛤仔抗菌肽，对受试的多种革兰氏阳性和阴性病原微生物均具有较强的抑制活性，具有开发为广谱抗菌类药物、遗传选育和饲料添加剂等方面的应用价值。
文档编号A23L3/3535GK102363783SQ20111032102
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者吴惠丰, 张林宝, 王清, 赵建民 申请人:中国科学院烟台海岸带研究所