一种菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用，本发明中选取胰蛋白酶酶解菲律宾蛤仔肉，经超滤得到3KDa以下的酶解物，采用MTT法、HE染色和AO/EB染色等方法检测该酶解物对人肺癌细胞H1299细胞活性的影响，结果显示3KDa以下的菲律宾蛤仔酶解物作用H1299细胞后能明显抑制H1299细胞的增殖，并使细胞出现凋亡的形态学改变。与现有技术相比，本发明中的菲律宾蛤仔酶解物抗肺癌效果明显，且酶解原料来源广泛，制备过程操作简单、效率高、安全性高。
【专利说明】
一种菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用。
【背景技术】
[0002]菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)属软体动物门双壳纲帘蛤目帘蛤科,一种广温性的小型双壳贝类，南方俗称花蛤，与牡蛎、缢蛏、蚶类并列为我国四大养殖贝类，是近岸滩涂和浅海的主要贝类之一，其味道鲜美，营养丰富，蛋白含量高。
[0003]癌症，亦称恶性肿瘤，是一种通过控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。肺癌是当今人类的高发癌，居癌症之首，非小细胞肺癌的患病率约占肺癌总发病数的80%，约2/3的患者在确诊时已失去手术机会，放、化疗在非小细胞肺癌治疗中占有重要地位，但放、化疗的毒副作用严重影响着治疗效果和生活质量。近年来对菲律宾蛤仔提取物的抗肿瘤研究有了很大的进展，如范秀萍等(食品工业科技，2003)利用菲律宾蛤仔糖胺聚糖的粗制品(CRG)作用于体外培养的HL-60细胞，发现CRG在1.0mg/ml浓度下对HL-60细胞具有显著抑制作用，在24h、48h、72h抑瘤率分别可达59.8%,67.7%和96.2%。张莉等(海洋与湖沼，2007)利用菲律宾蛤仔肉提取两种蛋白聚糖PGl和PG2，其中PGl在200ug/ml浓度时对人肝癌细胞SMMC7721的生长抑制率达到73.30%，且不影响人正常肝细胞HL-7002的生长与功能。从海洋生物中提取抗肿瘤活性物质是科学界研究的热点，其中抗癌肽尤为引人注目。利用蛋白酶酶解获得生物活性肽是一种安全性高，产率高的方法，近年来研究发现菲律宾蛤仔酶解物具有多种生物活性，如杨永芳等(中华中医药学刊，2011)利用菲律宾蛤仔酶解寡肽对羟自由基的清除作用来考查各酶解物的抗氧化活性，结果发现在酶解物浓度为2.5mg/ml时的羟自由基清除率、DPPH自由基清除率和还原力均高于Vit C。目前，关于菲律宾蛤仔酶解物的抗癌性，尤其在抗肺癌中的应用目前还未见报道，因此具有进一步研究的空间。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种菲律宾酶解物的新用途，即在抗肺癌中的应用。
[0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用。
[0006]肺癌中非小细胞肺癌占肺癌总数的80%，是最常见的肺癌，作为优选，上述方案中的肺癌指非小细胞肺癌。
[0007]上述方案中菲律宾蛤仔酶解物的分子量小于3KDa，其通过以下方法制得:
[0008]I)新鲜的菲律宾蛤仔洗净后，取肉、去杂质，使用组织捣碎机捣碎匀浆；
[0009]2)在步骤I)中所得匀浆液中加入1200u/g胰蛋白酶，酶解24h，酶解温度为37°C，酶解pH为8.0 ;
[0010]3)酶解反应结束后，90°C灭酶15min,然后在4°C下8500r/min离心15min,取上清；
[0011]4)采用截取分子量为3KDa的超滤膜，20°C超滤Ilh获得酶解液；
[0012]5)将步骤4)所得的酶解液旋转蒸发后，冷冻干燥保存，实验时用F12培养液配成不同的浓度。
[0013]为更好地理解本发明的实质，本发明中菲律宾蛤仔酶解物作用于体外培养的人肺癌Hl 299细胞株，将酶解物作用后的Hl 299细胞分别进行MTT检测、HE染色和Α0/ΕΒ染色，其中，MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法；HE染色，即苏木精-伊红染色法，是一种普通光学显微镜观察与鉴别细胞凋亡与细胞坏死的染色方法；Α0/ΕΒ染色，即吖啶橙/溴化乙锭双荧光染色，是一种检测细胞培养中凋亡细胞形态以及数量的方法。结果显示该菲律宾蛤仔酶解物能显著抑制H1299细胞生长，且随酶解物反应液浓度增加和作用时间的延长，抑制率明显上升；倒置显微镜和HE染色对照组的H1299细胞呈上皮样生长，形态基本一致，伸展性好，经酶解物作用后，细胞形态发生改变，胞质内出现空泡，核染色质边聚，核固缩等凋亡的形态学改变，因此菲律宾蛤仔酶解物能显著抑制H1299细胞的增殖并能诱导H1299细胞凋亡。
[0014]与现有技术相比，本发明的优点在于:
[0015]1、本发明中菲律宾蛤仔酶解物抑制H1299细胞增殖，诱导其凋亡效果显著。本发明中30mg/ml酶解物作用H1299细胞48h后，培养容器中形态正常的H1299细胞明显减少，漂浮细胞或漂浮物明显增加，细胞出现增殖抑制并死亡的现象。
[0016]2、本发明中酶解物原料来源广泛，制备过程操作简单、效率高、安全性高。菲律宾蛤仔是一种在我国海域中在近岸滩涂和浅海中常见的贝类海产品，在沿海的菜市场、超市等处十分常见，同时利用胰蛋白酶的特异性和高效性制备酶解物，使得酶解物的制备简单、高效、安全。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1为本发明实施例2中MTT检测结果示意图；
[0018]图2为本发明实施例3中对照组的倒置显微镜下H1299细胞形态示意图；
[0019]图3为本发明实施例3中10mg/ml组的倒置显微镜下H1299细胞形态示意图；
[0020]图4为本发明实施例3中20mg/ml组的倒置显微镜下H1299细胞形态示意图；
[0021]图5为本发明实施例3中30mg/ml组的倒置显微镜下H1299细胞形态示意图；
[0022]图6为本发明实施例3中对照组的HE染色后H1299细胞形态示意图；
[0023]图7为本发明实施例3中10mg/ml组的HE染色后H1299细胞形态示意图；
[0024]图8为本发明实施例3中20mg/ml组的HE染色后H1299细胞形态示意图；
[0025]图9为本发明实施例3中30mg/ml组的HE染色后H1299细胞形态示意图；
[0026]图10本发明实施例4中对照组的A0/EB染色后H1299细胞形态示意图；
[0027]图11本发明实施例4中10mg/ml组的A0/EB染色后H1299细胞形态示意图；
[0028]图12本发明实施例4中20mg/ml组的A0/EB染色后H1299细胞形态示意图；
[0029]图13本发明实施例4中30mg/ml组的A0/EB染色后H1299细胞形态示意图。
【具体实施方式】
[0030]以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0031]实施例1:菲律宾蛤仔酶解物的制备
[0032]新鲜的菲律宾蛤仔洗净后，取肉去杂质，用组织捣碎机将处理洁净的蛤仔肉捣碎匀浆。在匀浆液中加入3倍体积的蒸馏水，加入1200u/g胰蛋白酶进行酶解，于37°C、pH值为8.0的酶解环境反应24h，可使用氢氧化钠和氯化氢对反应液的pH值进行调整。酶解反应结束后，90°C灭酶15min，使得未反应的胰蛋白酶失活，然后将反应液离心15min，取上清液，离心条件为:4°C，8500r/min。将所得上清液在20°C下超滤llh，超滤时使用截取分子量为3KDa的超滤膜。超滤结束后，将超滤液旋转蒸发，冷冻干燥后保存，将制得的酶解物用F12培养液配制成不同的浓度进行后续实验。
[0033]实施例2:细胞增殖抑制实验
[0034]采用MTT法来检测菲律宾蛤仔酶解物对H1299细胞增殖的影响，具体实验方法如下:
[0035]I )H1299细胞的培养:将H1299单细胞悬液接种于含F12培养液的培养瓶中，置于37°C、5%C02的培养箱中进行培养，细胞呈单层贴壁生长，当细胞长满80%时，选取生长状态良好的细胞采用胰蛋白酶消化传代，以I X 1VmL细胞悬液接种于96孔板，每孔200mL。
[0036]2) MTT检测:上述细胞悬液培养24h后弃上清，进行MTT检测，实验设置对照组和加药组，加药组分为10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml5个组，每个剂量分设3个复孔，分别培养24h、48h和72h后弃培养液，在每个孔中加入lmg/ml MTT200mL,4h后吸弃MTT，加150 μ L的DMS0，充分混合。最后在酶标仪490nm处测吸光度A值，计算细胞增殖抑制率(IR)，IR=[(对照组A值-加药组A值)/ (对照组A值-调零孔A值]X 100%,重复实验3次。
[0037]3)实验结果:如图1所示，酶解物作用于H1299细胞后，细胞呈现出明显的生长抑制现象，随酶解物浓度的增加(1mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml)和作用时间(24h、48h、72h)的延长，增殖抑制率明显上升，与对照组相比，差异具有统计学意义(ρ〈0.05)。
[0038]实施例3:ΗΕ染色
[0039]1)ΗΕ染色:6孔培养板内放入经泡酸、高压灭菌过的盖玻片，将实施例2步骤I)中培养的Η1299单细胞悬液浓度调至I X 105/mL后接种于培养板内的盖玻片上，每孔加入2ml单细胞悬液，24h后换液。实验中设对照组和加药组，加药组分为10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml，分别培养48h后在倒置显微镜(X200)下观察并拍照。实验结束后取出培养板中的盖玻片，用PBS充分清洗后用95%乙醇固定25分钟，最后进行常规HE染色，在光学显微镜(X400)下观察，用数码相机拍照。
[0040]2)实验结果:倒置显微镜下形态观察结果如图2?图5所示:如图2所示对照组中H1299细胞形态为上皮样，饱满，伸展好，细胞分界清楚；如图3所示10mg/ml酶解物作用于H1299细胞后，培养液中出现圆形的细胞，漂浮于培养液中，部分细胞伸出突起相互融合；如图4所示20mg/ml作用后的H1299细胞，培养液中圆形和漂浮细胞增多；如图5所示30mg/ml作用后，形态正常的H1299细胞明显减少，漂浮细胞或漂浮物更多，细胞出现增殖抑制并死亡的现象。
[0041]HE染色结果如图6?图9所示:如图6所示对照组中的H1299细胞边界清晰，有明显的分裂相，饱满，核仁数目多；如图7所示10mg/ml组中的H1299细胞胞质内出现较多的空泡；如图8所示20mg/ml组中的细胞形态不规则，空泡增多，部分细胞的核固缩；如图9所示30mg/ml组中的细胞形态不规则，部分细胞形态变小呈圆形，部分细胞体积增大出现巨核细胞，大部分细胞的核仁明显减少，细胞核发生固缩，染色质发生边聚等凋亡现象。
[0042]实施例4:Α0/ΕΒ染色
[0043]I) Α0/ΕΒ染色:细胞接种的方法同HE染色，对照组和加药组的细胞培养24h后取出培养板中的盖玻片，用PBS洗3次，95%乙醇固定30min。取终浓度为20mg/L的Α0/ΕΒ混合液滴加于载玻片上，将有细胞一面的盖玻片朝下，突光显微镜(X 200)观察拍照。
[0044]2)实验结果:如图10所示对照组中H1299细胞形态基本相同，核染色质亮绿色并呈正常形态；如图11所示10mg/ml组中的早期凋亡细胞较多，核染色质亮绿色固缩成团块状位于细胞一侧，或呈新月形等异常变化；如图12所示20mg/ml组的晚期凋亡细胞较多，细胞变圆，核仁数目减少，染色质固缩，呈桔黄色；如图13所示30mg/ml组中晚期凋亡细胞增多，细胞形态多样，染色质固缩明显，颜色加深呈桔红色，并可见部分胞核形成碎片，或形成半月形，细胞膜向外突出形成凋亡小体，同时非凋亡的死亡细胞增多，核染色质着桔红色但结构正常。
[0045]注:实施例1中使用的菲律宾蛤仔购与舟山市某菜市场；
[0046]实施例2?4中使用的人肺癌H1299细胞株购自中国科学院上海细胞所，由 申请人:所在实验室传代保存。
[0047]各实施例中所用试剂和主要仪器信息如下:
[0048]胰蛋白酶(SIGMA公司);F12培养基(GIBCO公司)加10%的胎牛血清(杭州四季青生物工程公司)，内含双抗；MTT (SIGMA公司)；AO/EB (杭州昊天生物技术有限公司)；其余试剂均为分析纯。
[0049]高速组织搅拌机(上海比朗公司)、CF16RXII高速冷冻离心机(日立HITACHI公司)、UV1600PC紫外分光光度计(上海美谱达有限公司)；自动部分收集器(BSZ-40-1XD)和蛋白检测仪(HD-21-88)(上海琪特分析仪器有限公司);MSC300超滤杯(超滤膜:3Kda，上海摩速科学器材有限公司);Forma3111C02培养箱(美国Thermo公司);倒置相差显微镜和突光显微镜(OLYMPUS公司)；超净台(ZHJM-C12090，上海智城分析仪器制造有限公司)；酶标仪(美国B1-RAD );显微摄像 CCD (promicroscan5898，USA)。
【权利要求】
1.一种菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用。
2.根据权利要求1所述的菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用，其特征在于:所述肺癌为非小细胞肺癌。
3.根据权利要求1或2所述的菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用，其特征在于:所述的酶解物的分子量小于3KDa。
4.根据权利要求3所述的菲律宾蛤仔酶解物在抗肺癌中的应用，其特征在于:所述酶解物通过以下方法制得: 1)新鲜的菲律宾蛤仔洗净后，取肉、去杂质，使用组织捣碎机捣碎匀浆； 2)在步骤1)中所得匀浆液中加入1200u/g胰蛋白酶，酶解24h，酶解温度为37°C，酶解pH 为 8.0 ; 3)酶解反应结束后,90°C灭酶15min,然后在4°C下8500r/min离心15min,取上清； 4)采用截取分子量为3KDa的超滤膜，20°C超滤llh获得酶解液； 5)将步骤4)所得的酶解液旋转蒸发后，冷冻干燥保存。
【文档编号】A61P35/00GK104337837SQ201310312796
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年7月23日 优先权日:2013年7月23日
【发明者】杨最素, 丁国芳, 孙瑜, 徐律, 黄芳芳, 郁迪, 闫海强 申请人:浙江海洋学院