专利名称：猪流感病毒和猪口蹄疫病毒的混合病毒样颗粒、制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及猪流感病毒和猪口蹄疫病毒的混合病毒样颗粒，以及制备和应用。
背景技术：
猪流感是由猪流感病毒(Swine influenza virus, SIV)引起的不同日龄、性别和品种猪只的一种急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病，其临床上以突发、高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭和死亡为特征。各年龄、性别、品种猪均能感染，发病率高。单独感染猪流感病毒可导致猪只生产性能下降，料肉比升高，增重减缓，给猪场造成一定的经济损失。更为严重的是，猪是禽、人、猪流感病毒重组和复制的“混合器”，猪流感病毒不需重组就有最大限度感染人的能力。而且早期的人流感病毒还可以储存于猪体内，并在一定时期内再次感染人。目前，常见的猪流感主要有H1N1、H1N2和H3N2等3种亚型。值得重视的是，SIV更多见与其它疫病，如猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪伪狂犬病毒、传染性胸膜肺炎放线杆菌、 猪链球菌、猪附红细胞体等并发或继发感染，使疫情变得反复而复杂，是现代集约化猪场普遍存在且难以根除的猪呼吸道传染病之一，对养猪业危害极大。甲型Hmi流感病毒的流行不仅给很多国家的养殖业造成了巨大的经济损失，而且对世界范围内的人民公共卫生安全造成了一个很大的挑战。2009年4月爆发于墨西哥的甲型Hmi流感全球瞩目，随后，美国和加拿大等国也相继出现人感染Hmi猪流感的情况并有部分病人死亡。在短期内研制有效疫苗来预防甲型Hmi流感病毒抑制疫情传播和加重迫在眉睫。目前国内生产的用于禽畜预防流感病毒的疫苗大部份是采用传统的鸡胚法培养增殖活病毒，经化学试剂灭活后生产成疫苗。这种技术又分为两类不同的制备法一是直接用野生型病毒感染鸡胚制备，另一类是先采用反向遗传技术改造野生病毒的遗传性，然后用“拯救”改造的新病毒来感染鸡胚，增殖病毒，生产疫苗。这些流感疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大的缺陷。尤其是流感感毒的与众不同特性，例如高频率突变，双重及多重亚型病毒之间遗传物质重组及抗原漂移等一使这些疫苗的长期安全性及有效性受到了极大挑战，甚至产生了 “无效疫苗”，难以应付新的突变型Hmi流感病毒的传染。除此以外，这些疫苗制剂还存在着以下不足1、生产周期长从获得新的亚型病毒株到疫苗生产上市，耗时5-8个月，难以遏制新的疫情大爆发。2、生产条件高为预防人为的污染环境及生产的活病毒的泄漏扩散，整套生产必须按规定在生物安全三级实验室条件下进行，病毒的灭活必须保证完全，彻底。3、无法区别被免疫过的猪只与受病毒感染的猪只。口蹄疫(foot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，主要感染偶蹄兽，人和非偶蹄动物也可感染。国际兽疫局将口蹄疫列为A类传染病之首，我国也把它列为家畜传染病的第一个病。口蹄疫一旦暴发会导致巨大的经济损失，同时也影响到国家和地区的正常贸易活动。由于口蹄疫直接威胁国际贸易和国家声誉及动物生态和人类食品卫生，因而受到人们的普遍关注。近年更被列为生物武器安全公约组织重点检查对象，世界各国包括无口蹄疫的国家，均对本病保持高度警惕，并大力开展病原学、诊断技术和防制技术的研究。FMDV是已知的最小的动物RNA病毒，病毒粒子呈球形，正二十面体结构，直径20 30nm，分子量6.9X 106u，沉降系数146s，在氯化铯中的浮密度为1. 43g/mL。完整病毒含单股正链RNA和衣壳蛋白两部分，无囊膜。衣壳由VP1、VP2、VP3、VP4各60分子组成，基因组RNA由约8500个核苷酸组成，可直接作为信使RNA。FMDV只含有一个ORF(开放阅读框)，编码病毒的前体聚蛋白。前体聚蛋白经两次裂解后形成4种结构蛋白(VP1-VP4)，其中 VPl(ID)基因位于基因组的四77 3615位，编码213个氨基酸。早期的研究表明，结构蛋白是诱导中和抗体的主要成分，它暴露在病毒粒子的表面。在已发现的0型五个抗原位点中，有三个位于VPl上，其中140-160位氨基酸处的G-H环是最主要的保护性抗原位点，空间构象比较复杂，具有较大的运动性，在其顶部形成了一个高度保守的Arg-Gly-Asp(RGD) 序列，是FMDV的细胞受体位点。VPl的第140 160和200 213氨基酸残基是两个主要的B细胞表位，能诱导抗FMDV的中和抗体，VPl第141 160氨基酸残基中也含有至少一种T细胞表位，能诱导FMDV专一性的T细胞反应。我国对口蹄疫的防制采用疫苗免疫和扑杀相结合的政策，对猪的口蹄疫采用强制免疫。目前使用的口蹄疫疫苗主要是全病毒灭活疫苗和多肽疫苗两种，因存在安全隐患或免疫效果差的缺陷而不能提供理想的免疫保护。因此，研究高效、安全、可靠的疫苗显得非常必要。病毒样颗粒(VLPs)是含有某种病毒的一个或多个主要结构蛋白，在体外表达系统中自动组装成的不包含病毒核酸的空心颗粒，它的形态和大小与真实的病毒粒子相同或相似，所以能有效的诱导机体免疫系统产生免疫保护反应，作为一种新型疫苗病毒样颗粒 (VLPs)显示出了良好的良好的免疫效力和应用前景。典型的Hmi SIV粒子呈球形或椭圆形，直径80 120nm，HlNl流感病毒的基因组8个基因片段共编码11种蛋白，病毒的外壳是一层由脂质及脂蛋白构成的膜，包裹着病毒的遗传物质及核蛋白。共有4种蛋白质，属于病毒主要结构蛋白，它们是基质蛋白M1，形成病毒外壳的主体蛋白；核蛋白NP，形成病毒粒子核衣壳，参与病毒粒子形成；红细胞凝集素HA，病毒外壳表面膜上的主要糖蛋白，共有 16个亚型。是诱发宿主机体产生抗体的主要抗原体。神经氨酸苷酶NA，亦是病毒外壳表面膜上的一种糖蛋白，共有9个亚型，同样是诱发抗体产生的主要抗原体。流感毒的表面膜蛋白HA和NA是引起机体产生免疫应答的主要抗原，而基质蛋白 Ml是形成病毒外壳的主要成分，亦可作为组织型免疫应答的抗原。有关研究证明，基质蛋白 Ml的正确表达，是保证病毒外壳形成的重要环节，而膜蛋白NA的功能之一是把病毒实体从宿主细胞表面剥离下来，形成病毒颗粒，因此禽流感病毒的结构蛋白Ml、HA和NA是合成新型抗禽流感病毒疫苗的核心。蛋白HA、NA和Ml等3个主要结构蛋白同时表达就可以自动组装成空心的没有病毒基因组的病毒样颗粒。另外研究证明流感病毒的型特异性抗原NP 蛋白可有效刺激CTL (细胞毒T淋巴细胞)反应，抑制病毒感染，在病毒样颗粒中加入NP蛋白将会在一定程度上提高这种新型疫苗的细胞免疫水平。猪流感病毒和口蹄疫病毒在猪体内互为影响，同时感染会加重病情。因此开发出一种二价疫苗同时预防Hmi猪流感和猪口蹄疫的VLPs是本领域技术人员亟待解决的问
4题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种二价疫苗，该疫苗能够同时预防Hmi 猪流感和猪口蹄疫。本发明的目的是通过一下内容实现的。本发明提供一种混合病毒样颗粒包含流感病毒的基质蛋白M1，流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA，一个融合膜蛋白，其包含猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白，流感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域；在所述混合病毒样颗粒的表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白。本发明还提供猪流感和猪口蹄疫二价疫苗，包含所述的混合病毒样颗粒和佐剂。本发明还提供制备混合病毒样颗粒的方法。利用包含所述融合蛋白的病毒样颗粒构成的疫苗，可同时预防预防Hmi猪流感和猪口蹄疫，并具有明显的优点和效果(I)Hmi猪流感和猪口蹄疫VLP 二价疫苗能引起机体免疫系统产生强型应答，免疫力强，持续时间长，能同时预防Hmi猪流感和猪口蹄疫。(2)由于病毒样颗粒不含病毒基因组，这种空壳结构的VLPs在免疫动物体内就不会发生病毒基因与宿主染色体基因整合，而且整个生产过程不接触活的有感染力的病毒， 因此非常安全。对于流感病毒和口蹄疫病毒两种病毒来说，都无病毒扩散之虞。(3)和一般的基因工程亚单位疫苗比较，因为病毒样颗粒更接近天然病毒的形态和大小，能刺激机体产生更好的免疫反应，免疫效果更好。(4)可区别出被人工免疫的动物与被病毒感染的动物。病毒样颗粒不含流感病毒 NS、PB1、PB2等蛋白，因此进行血清测试时，用病毒样颗粒颗粒疫苗免疫的动物，将不会产生特异性抗NS或PB的抗体，可以区分是否野毒感染。对于口蹄疫来说，用VPl蛋白之外的任何口蹄疫结构蛋白如VP2蛋白、N蛋白等，以及口蹄疫病毒的非结构蛋白作为检测抗原，都可以区分是否野毒感染。上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下结合优选实施例，并配合附图，详细说明如下。
图1为通过不同特异性引物PCR扩增的HA(al)、NA(a2)、Ml (b)、NP (c)、HF(d)基因片段的电泳图；图 2 为重组昆虫杆状病毒表达质粒 rBacmid-HA/HF-NA、rBacmid-MU rBacmid-NP 示意图；图3为病毒样颗粒western blot结果。图4为病毒样颗粒中的Ml蛋白和Sl蛋白的间接免疫荧光结果。A、M1抗体为RBITC标记显示橙色荧光，C、Sl抗体为FITC标记显示绿色荧光，B、D为阴性对照。图5A是蔗糖密度梯度离心纯化后的病毒样颗粒在电子显微镜下的图象，b为a的局部放大图。
具体实施例方式本发明以Bac-to-Bav昆虫杆状病毒表达系统为基础，利用Hmi猪流感病毒的基质蛋白M和核蛋白NP，以及表面膜蛋HA和NA蛋白，共同自动组装构建出Hmi猪流感病毒的病毒样颗粒(VLP)。在此基础上，构建Hmi猪流感病毒与猪口蹄疫病毒的二价VLPs。首先，将猪口蹄疫病毒VPl上的两个肽段132 159(A)、200 213(B)以 A-B-A-B-A-B-A串联的形式合成，A肽段的N端有额外5个氨基酸(MVPSR)，B肽段的C端有额外6个氨基酸(QFELEF)，A和B肽段之间加入2个氨基酸(PG) linker,在B-A连接处形成11个氨基酸(QFELEFMVPS linker，这两个linker包含的氨基酸具有较好的柔韧性，有助于串联片段形成一定的空间结构，该串联片段被命名为F多肽。将F多肽序列替换Hmi 流感病毒的HA蛋白基因的一部分，二者构成融合基因HF，F多肽序列位于融合基因HF的5， 端，替换大致相等长度的HA基因的5’端序列，以保障融合基因的长度与HA基因长度大致相等。然后，按照形成流感病毒样颗粒的方法，将Hmi流感病毒的基质蛋白Ml、核蛋白 NP及表面膜蛋白HA和NA的基因，以及表达猪口蹄疫病毒抗原串联多肽F和流感病毒HA 的融合蛋白HF的基因序列，构建于昆虫杆状病毒的载体质粒内，并使其重组入昆虫杆状病毒的遗传物质DNA内，利用宿主昆虫细胞表达这些外源蛋白，自动组装成不含流感病毒遗传物质的病毒样颗粒，病毒样颗粒形成后将释放入细胞培养液中。这样形成的VLPs既具有 HlNl流感病毒的主要表面抗原，又具有猪口蹄疫病毒的主要抗原串联多肽F，为Hmi猪流感病毒与猪口蹄疫病毒二价VLPs。需要指出的是，猪口蹄疫病毒是无囊膜的，其表面抗原蛋白没有天然跨膜区而不能直接整合到VLP上。另外，其抗原表位分散，因此表面抗原蛋白直接融合到流感病毒HA 上会破坏HA的结构。为了克服这些难题，本发明采用串联抗原表位的方式，在确保多个抗原表位存在的情况下，减少了串联抗原表位多肽的大小，可以融合到HA上。通过融合猪口蹄疫病毒的串联抗原表位多肽到HA上，猪口蹄疫病毒的串联抗原表位多肽能在VLP膜上表达。另外，流感病毒的结构蛋白作为二价VLP的骨架是因为我们发现流感病毒VLP高产、稳定；同时HA蛋白的整合到VLP是高效的；这样可以保证在VLP的表面有足够的HA蛋白，可以作为有效的疫苗使用。通过下面给出的具体实施例可以进一步清楚地理解本发明，但下述实施例并非对本发明的限定。实施列1 :M1、NP、HA、NA和融合基因HF的扩增。(1)猪口蹄疫病毒F多肽与猪流感病毒HA融合基因HF的合成融合基因HF的核酸序列见SEQ ID NO :9、其编码的氨基酸序列见SEQ ID NO :10， 融合基因根据其核酸序列SEQ ID NO :9人工合成。F多肽含有198个氨基酸，替代HA基因的5 ‘端的184个氨基酸。
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(2) HlNl亚型猪流感病毒RNA抽提和RT-PCR按GibcoBRL公司TRIzol LS Reagent RNA提取试剂盒的使用说明书(方法)进行。分别取250 μ L猪流感病毒Hmi亚型毒株感染尿囊液和750 μ L TRIzol LS，加入1.5mL 微量离心管内，用吸管吹打充分混勻，室温放置IOmin ；加入200 μ L氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5分钟后，4°C下12000rpm离心15min ；取上清于一新的灭菌1. 5mL离心管内，加入 500 μ L异丙醇，充分混勻，室温放置lOmin，在4°C下12000rpm离心IOmin ；倾去上清，沉淀中加入70%的乙醇750 μ L，轻轻混勻，洗涤一次，4°C下12000rpm离心15min，弃去上清，风干；加入10 μ L用DEPC水处理的无RNA酶的三蒸水溶解病毒RNA (沉淀)，直接用于RT-PCR 或_80°C保存备用。参照TaKaRa的AMV反转录酶的使用说明进行，在20 μ L反应体系中分别加入以下组分:RNA :3μ L ；5XRT buffer :4 μ L ； dNTPs :4 μ L ； RNA 酶抑制剂0. 5μ L ；引物 UP :1 μ L ；引物 DN :1 μ L ；AMV :2 μ L ；DEPC 水补至 20 μ L。混勻后，室温放置 10min，42°C 保温lh，冰浴2min，RT产物直接用于PCR扩增或_20°C保存。(3)M1、NP、HA、NA、HF 基因的 PCR 扩增根据HA基因序列(序列表1和序列表2)设计的1对引物，用于扩增HA基因，其两端分别加上了》ιο I和Nco I /酶切位点，位于PlO启动子下，引物序列如下HA Xho I :5，-5，GCCCTCGAGATGAAGGCAATACTAGTG-3，(SEQ ID NO: 11)HA Nco I :5，-GCCCCATGGTTAAATACATATTCTGCACTG-3，(SEQ ID NO 12)根据NA基因序列(序列表3和序列表4)设计的1对引物，用于扩增NA基因，其两端分别加上了 Ml I和Hind III的酶切位点位于Pph启动子下，这2个引物序列分别是NA Sal I :5，-GCCGTCGACATGAATCCAAACCAAAG-3，(SEQ ID NO 13)NA HindIII :5，-GCCAAGCTTCTACTTGTCAATGGTG-3，(SEQ ID NO: 14)根据Ml基因序列(序列表5和序列表6)设计的1对引物，用于扩增Ml基因，其两端分别加上了 Ml I和Hind III的酶切位点位于Pph启动子下，这2个引物序列分别是Ml Sal I 5，-GCCGTCGACATGAGTCTTCTAACCGAG-3，(SEQ ID NO 15)Ml HindIII :5，-GCCAAGCTTTCACTTGAATCGTTG-3，(SEQ ID NO: 16)根据NP基因序列(序列表7和序列表8)设计的1对引物，用于扩增NP基因，其两端分别加上了》ιο I和Nco I /酶切位点，位于PlO启动子下，引物序列如下NP Xho I ，5，-AGTCTCGAG ATGAGTGACATCGGAGCCAT-3，(SEQ ID NO 17)NP Nco I :5，-CATGCCATGGTTAATTGTCATACTCCTCTGCATTG-3，(SEQ ID NO 18)根据融合基因HF的序列(序列表9和序列表10)，设计的1对引物，用于扩增融合基因HF，其两端分别加上了 B10 I和Sph I酶切位点，位于PlO启动子下，引物序列如下HF Xho I :5，-CCGCTCGAGATGGTTCCGTCTCGTG-3，(SEQ ID NO 19)HF Sph I :5，-ACATGCATGCTTAAATACATATTCTGCACTG-3，(SEQ ID NO 20)采用Ml、NP、HA、ΝΑ、HF各自特异性引物，将反转录的产物或合成的DNA片断直接用作PCR扩增Ml、NP、HA、ΝΑ、HF基因的模板。PCR反应条件为94°C预变性3min，94°C变性 40S，56°C退火90s，72°C延伸90s，循环30次，最后延伸lOmin，PCR产物用1. 5%琼脂糖凝胶 (含0. 5ug/ml溴化乙锭，EB)电泳检测。PCR扩增的HA基因的长度约1. 7Kb (图la)，NA基因的长度约1. 35Kb (图la)，Ml基因的长度约0. 75Kb (图lb)，NP基因的长度约为1. 5Kb (图 Ic)，融合基因HF的长度约为1. 7Kb (图Id)。所有的PCR产物样品经电泳凝胶抽提后，获得纯化的Ml、NP、HA、NA、HF基因DNA片段，经限制性内切酶Bio I /Nco I (消化HA片段)、 Sal/Hind III (消化 NA 片段)，Xho I /Nco I (消化 NP 片段)、Sal I /Hind III (消化 Ml 片段)Jho I /Sph I (消化HF片断)37°C分别消化后，再进一步纯化，以备下一步构建重组质粒用。具体操作如下制备琼脂糖凝胶含0. 5ug/ml溴化乙锭，将所有PCR样品加入凝胶的样品槽内，设置电压100V，电泳时间40min在长波紫外灯下，切下含有样品带的凝胶条，装入小塑料离心管中。参照胶回收试剂盒(Qiagen公司产品)说明书，抽提纯化Ml、 NP、HA、HF和NA基因DNA片段。经限制性内切酶37°C过夜消化后，用胶回收试剂盒(Qiagen 公司产品)，按照说明指导，离心过柱，纯化回收酶切消化后的Ml、NP、HA、NA、HF片段。实施例2 构建表达Ml、NP、HA、ΝΑ、HF基因的昆虫杆状病毒表达质粒及在昆虫细胞中合成重组的昆虫杆状病毒(1)构建表达Ml和NP基因的重组质粒昆虫杆状病毒质粒PFastBac-dual (Invitrogen公司产品)经限制性内切酶Sal I /见11(1111371酶切3小时后，用胶回收试剂盒回收纯化酶切后的质粒？!^5^肌-(1皿1。在 T4 DNA连接酶的作用下，酶切后的质粒与酶切后的Ml DNA片段于16°C连接过夜。反应体系如下10XT4连接缓冲液1ml，Ml酶切回收的DNA片段:3ml，酶切PFastBac-dual质粒回收产物lul，T4DNA连接酶lul，ddH20补至IOul。采用热休克方法将连接产物转导入ToplO 感受态细胞中加入到于一小塑料离心管中，轻轻混合后将小管置于冰上30min，转入42°C 水浴中热休克90s，迅速放回冰上5分钟，想其中加入200ulLB培养液。37°C摇床培养1小时。取IOOul菌液涂布于LB固体培养基(含有氨苄和庆大霉素两种抗生素)上，37°C培养 16h，从平板上挑取阳性克隆菌落，进行菌液PCR，抽提质粒后用Ml I /HindIII进行单双酶切鉴定。DNA序列测定后，获得重组质粒PFastBac-dualMl。表达NP基因的重组质粒PFastBac-dualNP的构建方法同上。(2)构建表达HA/HF和NA基因的重组质粒昆虫杆状病毒表达质粒PFastBac-dual经限制性内切酶Xho I /Nco I酶切后， 在T4DNA连接酶的作用下，将被同样的内切酶消化后的HA基因DNA片段插入到PlO启动子的下方，此连接产物随后经热体克法转导入ToplO感受态细胞中，培养、抽提数个阳性克隆菌落的重组质粒DNA，菌液PCR和Bio I /Nco I单双酶切鉴定及DNA序列测序确定无误后，挑选其中的一个重组质粒DNA，进行第二次酶切。所用的限制性内切酶为Ml I / Hind III。用同样的内切酶酶切NA基因DNA片段，并将其插入到重组质粒的另一个启动子Pph的下方，经转化、筛选、培养、抽提，获得二度重组的质粒。DNA测序后，即为所需的重组昆虫杆状病毒表达质粒PFastBac-dual-HA-NA。整个实验操作步骤及条件与上述构建 PfastBac-dualMl质粒所述相同。同时表达融合基因HF和NA基因的重组质粒PFastBac-dual-HF_NA的构建方法同上。(3)重组昆虫杆状病毒基因组的合成及提取将纯化的重组PfatBac-dual-Ml、PfatBac-dual-NP、PFastBac-dual-HA-NA 和 PFastBac-dual-HF-NA质粒分别转导入特殊的Ε. coli感受态细胞株DH 10 Bac细胞中(美国hvitrogen公司产品)。DHlOBac细胞含有一特殊的大分子质粒Bacmid，其内包含有昆虫杆状病毒AcMNPV的全部基因组。一旦重组的表达质粒整合入大分子质粒Bacmid的特别
8位点后，经3种抗菌素(庆大霉素、四环素和卡那霉素)的筛选及IPIG的诱导和X-Gal底物反应进行蓝白斑筛选，阳性克隆菌落呈白色，而非重组的野生菌落呈兰色。实验条件均按照hvitrogen公司提供的实验手册指导而设定。挑选的阳性克隆置于3ml的LB培养液中 (含上述3种抗生素)，经37°C摇床培养对小时，按照实验手册标明的大分子质粒Bacmid小量制备法，提取纯化带有Ml基因、NP基因、HA-NA或HF-NA基因的重组大分子质粒Bacmid。(4)重组昆虫杆状病毒的制备将昆虫细胞株sf9细胞(美国hvitrogen公司产品)培养于无血清的sf_900II 昆虫细胞培养液中anvitrogen公司产品)，温度设置为27 °C，根据hvitrogen公司提供的实验手册，采用脂质体转染法，将纯化的重组大分子质粒Bacmid与脂质溶液 eellfectin (Invitrogen公司产品)混合，转染入sf9细胞中，27°C培养4至5天后，收集细胞培养上清液，3000rpm离心10分钟收集上清液，获得低滴度的重组昆虫杆状病毒，再用此上清液感染新培养的sf-9细胞；3天后收集细胞培养上清液，即为所需的放大培养后的高浓度重组昆虫杆状病毒，命名为Bac-Ml，Bac-NP、Bac-HA-NA和Bac-HF_NA。对获取的用于放大培养和蛋白表达的重组昆虫杆状病毒进行蚀斑实验，确定病毒的噬斑形成单位(Plaque forming units, PFU)。1)用含10% FBS的Grace's培养基将Sf9细胞传代接种到六孔培养板中，细胞密度为约IX IO6个cells/ml，每孔加2ml (6孔板)，轻轻混勻室温使细胞贴壁1小时以上。2)将P3代种毒液用不含FBS的Grace’ s培养基做10倍倍比稀释待用。3)弃去六孔板中的培养基，用不含血清的培养基清洗细胞3次，然后将上述稀释好的重组病毒液加入孔中，每个稀释度做两个复孔，室温下感染1小时。4)制备覆盖液(以下为一块六孔板的量):7ml 2XGrace's medium+140 μ 1的双抗+7ml2%的高压灭菌agarose胶+1. 4ml FBS，轻轻地混勻，然后将瓶再放置42°C水浴，病毒感染Ih后吸尽每孔中的病毒液，并快速用上述制备的覆盖液覆盖细胞。5)待琼脂糖凝固后将六孔板用保鲜膜包好并置于27°C培养箱中培养3-5天。6)加入Iml浓度为lmg/ml的中性红，室温孵育2小时后吸去染液，观察到重组病毒形成的近似透明的小点即为空斑。计算统计观察病毒空斑的形成情况(PFU)。用于放大培养重组杆状病毒Bac-Ml，Bac-NP、Bac-HA-NA和Bac-HF-NA的细胞离心沉淀物，经细胞裂解缓冲液处理后，4°C离心(13，OOOrpm) 10分钟(或者将细胞在冰浴的情况下进行超声波破碎)，收集上清液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，分析基质蛋白Ml (或者NP、 HA、HF和NA蛋白)是否在昆虫细胞Sf9中表达。简单而言，将IOul上清液样品中加入IOul 的2XSDS上样缓冲液，100°C处理5min后，IOOOOrpm离心5分钟，将所有20ul的上清样品加入4%-12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶anvitrogen公司产品)的点样孔中。设置电泳条件为恒定电压100V，温度为4°C，电泳时间约3小时。待指示液溴酚兰接近凝胶底部时，停止电泳。凝胶置于R型考马斯亮蓝染色液中，摇晃染色1小时，然后置于脱色液中脱色过夜。实施例3 :MU NP、HA、HF和NA基因在共同转染的悬浮培养的昆虫细胞sf_9中的表达将200ml sf-9细胞混合液悬浮培养于1升体积的三角摇瓶中，细胞培养液为无血清的 sf-900II (或 hvitrigen 公司的 Grace insect medium)，摇床的摇速为 lOOrpm，温度恒定于 27°C。当细胞浓度达到 2 X IO6 细胞 /ml 时，用 Bac-Ml、Bac-NP、Bac-HA-NA、Bac-HF-NA 昆虫杆状病毒共同转染sf9细胞。病毒的MOI比例为3 (Bac-Ml和Bac-NP) 1 (Bac-HA-NA) I(Bac-HF-NA)。转染的细胞经恒温摇动培养3天后，收集所有样品，4°C离心30分钟，离速为3000rpm，收集上清液。离心下来的细胞沉淀物用细胞裂解液处理后，4°C离心10分钟，离速10，000rpm。保留离心后的上清液。实验进行的同时构建合成的野生型昆虫杆状病毒用于转染悬浮培养的sf-9细胞，MOI为5。作为设置的阴性对照，转染后的细胞培养、样品的收集及细胞裂解的条件与步骤与上述实验一样。收集的所有样品，用于Western blots分析。其实验操作如下每个样品(包括阴性对照)分别取IOul的细胞裂解抽提液及细胞培养上清液，再各自加入IOul的2 X SDS上样缓冲液。100°C处理5min后，将所有20ul的混合样品加入4% -12% SDS聚丙烯酰胺凝胶的点样孔中。设置恒定电压120V，温度为4°C， 时间3小时，当蓝色指示剂溴酚兰完全靠入凝胶底端时，停止电泳，取出凝胶。剪一张与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜(PVDF膜)及两张滤纸，PVDF膜用甲醇浸泡5分钟后与凝胶、 滤纸一起浸入预冷2小时以上的转移缓冲液中，按滤纸——凝胶——硝酸纤维素膜——滤纸的顺序安装入转印夹。将夹中靠近凝胶的一侧接负极，恒压25V转移电泳Ih.用镊子夹取出硝酸纤维素膜，用PBS-T漂洗液洗涤，而后转移至5%的脱脂奶粉/PBS溶液中，摇荡封闭1小时。用PBS-T漂洗液洗涤3次，每次3分钟；然后将硝酸纤维素膜转入一塑料袋中， 加入:3ml以1 500稀释于5%脱脂奶粉/PBS中抗Hmi猪流感病毒鸡源多克隆抗体(一抗)，置于4°C平缓摇动过夜。翌日，取出纤维素膜，用PBS-T漂洗液洗涤3次，每次10分钟， 将此硝酸纤维素膜再装入另一新的塑料袋中，加入5ml以1 10000稀释于5%脱脂奶粉/ PBS中的辣根过氧化物酶标记的驴抗鸡IgG (二抗)，室温下摇动温育lh。弃二抗，PBS-T漂洗纤维素膜3次，每次10分钟，将漂洗后的硝酸纤维素膜移至一平皿中，加入DAB第五显色液，可见在各自相对应的分子量位置上，M1、NP、HA/HF和NA的特异性条带，说明M1，NP，HA/ HF和NA在转染的悬浮培养的SF-9昆虫细胞中已经有效地表达。实施例4 病毒样颗粒的纯化及间接免疫荧光检测和电镜观察。将上述离心收集的细胞上清液装入13ml的超速离心管内，称重、平衡、封管后，放入超速离心机(Bechmem公司产品)内，4°C 100，OOOrpm离心1小时，然后取出离心管，小心倒掉上清液，保留离心管底的深沉物。加入5ml的PBS，放入4°C冰箱内，溶解M小时。 次日，在另一个13ml的超速离心管内，先小心地加入Iml 60%的庶糖溶液，然后依次加入 lml30%及;3ml20%的庶糖溶液，最后将5ml的溶解后的样品液置于其上。精确称重、平衡后，封管上超速离心机。4°C 100，OOOrpm离心1小时。取出离心管，分别收集位于20%与 30%及30%与60%浓度交界处的二条带，即纯化的病毒样颗粒。Weatern blots分析纯化浓缩后的病毒样颗粒样品。其操作步骤与上述实施例3中Western blots分析一样，只是将所取的样品进行了稀释，即Iul的病毒样颗粒样品，加入9ul的水，再加入IOul的2XSDS上样缓冲液。100°C变性5min后，上样入4% -12%聚丙烯酰氨凝胶样品槽内，Western blots 结果显示，从这二条带所获得的大分子颗粒，的确是由M1、NP、HA/HF和NA构成的病毒样颗粒。尤其是从30%与60%浓度交界处取得的似病毒颗粒含量大，特异性条带浓度深。说明转染后，病毒样颗粒在宿主细胞中有效地自我组装，并释放入细胞培养上清液中，进一步的间接免疫荧光实验和电镜结果证实了这一点(图4、图5)。间接免疫荧光实验操作步骤如下将sf9细胞种到M孔板中，每孔10万细胞，将VLP按照MOI = 3的感染复数对所种细胞进行感染，感染72小时后，用PBS将细胞洗涤3次， 每次5分钟，然后加入100%预冷的甲醇-20°固定细胞10分钟，在再加入0. 05%的Triton x-100室温处理10分钟，加入3%的BSA四度封闭过夜，第二天用PBS将细胞洗涤3次，每次5分钟，然后向孔中加入RBITC标记的A型流感特异的Ml单克隆抗体，或者FITC标记的猪抗口蹄疫F的单抗，37°反应1小时，反应结束后用PBS将细胞洗涤3次，每次5分钟，洗涤结束后在荧光显微镜下观察。用抗Ml的单抗和F的单抗进行免疫电镜观察，可以看到荧光标记的病毒样颗粒，其中抗Ml的抗体为RBITC标记，显示橙色荧光(图4A)，抗F的抗体为FITC标记，显示绿色荧光(图4C)，而对照没有荧光信号((图4B、D)。电镜拍片实验操作如下将少量的纯化浓缩后的似病毒颗粒样品固定处理后，置于新制备的无负荷的塑胶/碳包被网络格上，用数滴蒸馏水轻轻冲洗几次后，加上2%磷钨酸钠溶液进行负染色。电子透视显微镜下观察并拍片，如图5所示，病毒样颗粒的外观及体积大小相近。实施例5 =HlNl猪流感和猪口蹄疫二价VLPs免疫小鼠BALB/C小鼠购自中山大学动物实验中心，各组免疫动物具体免疫实施方式见表
1。6-8周龄的SPFBALB/C小鼠在免疫3次后15天眼球取血，各组小鼠血清用来检测IgG 抗体水平和HI抗体水平。Hmi猪流感IgG采用IDEXX公司Hmi流感抗体ELISA试剂盒检测，口蹄疫IgG抗体采用马静云等000 方法检测，用OD45tl值表示抗体水平。HI抗体检测采用HI实验参照甘孟侯(第二版，中国农业出版社)进行。结果表明，Hmi猪流感和口蹄疫二价VLPs免疫6-8周龄BALB/C小鼠，免疫小鼠血清中既有抗Hmi猪流感的抗体(表
2、表3)，也产生了抗口蹄疫病毒的抗体(表3)。表IHmi猪流感和猪口蹄疫二价VLPs免疫BALB/C小鼠实验方案
权利要求
1.混合病毒样颗粒，其特征在于，包含流感病毒的基质蛋白Ml ；流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA ；一个融合膜蛋白，其包含猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白，流感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域；在所述混合病毒样颗粒的表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白。
2.如权利要求1所述的混合病毒样颗粒，其中所述混合病毒样颗粒还含有流感病毒的神经氨酸苷酶NA。
3.如权利要求1或2所述的混合病毒样颗粒，其中所述混合病毒样颗粒还含有流感病毒的核蛋白NP。
4.如权利要求1所述的混合病毒样颗粒，其中所述猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白是一种融合蛋白，其含有多个抗原肽段。
5.如权利要求1所述的混合病毒样颗粒，其中融合膜蛋白的序列如SEQID N0:10所
6.猪流感和猪口蹄疫二价疫苗，其特征在于，包含如权利要求1-5所述的混合病毒样颗粒和佐剂。
7.制备混合病毒样颗粒的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤构建昆虫杆状病毒表达载体，其表达载体含有流感病毒的基质蛋白Ml，流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA，或一个融合膜蛋白，其包含猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白，流感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述含猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域；用所述构建的昆虫杆状病毒表达载体按比例同时感染昆虫细胞，包装出混合病毒样颗粒，其表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白。
8.如权利要求6制备混合病毒样颗粒的方法，其特征在于，其中所述构建昆虫杆状病毒表达载体还含有流感病毒的神经氨酸苷酶NA，其包装出混合病毒样颗粒含有流感病毒的神经氨酸苷酶NA。
9.如权利要求6或7制备混合病毒样颗粒的方法，其特征在于，其中所述构建昆虫杆状病毒表达载体还含有流感病毒的核蛋白NP，其包装出混合病毒样颗粒含有流感病毒的核蛋白NP。
全文摘要
本发明提供一种混合病毒样颗粒包含流感病毒的基质蛋白M1，流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA，一个融合膜蛋白，其包含猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白，流感病毒的红细胞凝集素HA的跨膜区和膜内区；所述猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白替换流感病毒的红细胞凝集素HA的5’端的大致相同长度的膜外域；在所述混合病毒样颗粒的表面上同时表达流感病毒的表面抗原红细胞凝集素HA和猪口蹄疫病毒的含有主要抗原表位的衣壳蛋白。本发明还提供猪流感和猪口蹄疫二价疫苗，包含所述的混合病毒样颗粒和佐剂。本发明还提供制备混合病毒样颗粒的方法。
文档编号C12R1/93GK102370976SQ20101024865
公开日2012年3月14日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者刘大才, 曹永长, 薛春宜 申请人:中山大学