专利名称：一种益于植物生长的微生物菌液及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种益于植物生长的微生物菌液及其制备方法 和应用。
背景技术：
农作物生长的土壤微环境直接影响到其产量和质量。过去过分注重到产量的提高 而忽略了农产品的品质和土壤可持续利用，单一的使用某种或几种化肥，最终导致土壤营 养元素不均衡，也影响到农作物的质量和产量。随着经济的发展和人们生活水平的提高，人 们对农产品的品质要求越来越高。为了提高农作物的产量同时避免土壤微环境的恶化，并 生产出品质优良的绿色有机食品，生物有机肥料日益得到广泛地使用。重视生物有机肥的应用时历史发展的必然，农用肥料从农家肥(土杂肥)到单质 化肥再到N、P、K复合肥，已经经历了三代更选，农业产量不断提高。但是，从20世纪中后 期全球出现了化肥热后，开始使用N对农业生产起了很大的作用，经过一段时期后，发现土 壤缺P，于是开始大量的使用过磷酸钙、磷酸二铵，随之出现了土壤缺K，人们开始增施高钾 复合肥补钾，可使整个阶段都忽视了对土壤有机质和有益微生物的补充，使现在农业生产 中出现了诸多难以解决的问题，主要表现在五个方面(1) 土壤高度盐碱化过量施用化肥 后，大量的硫酸根离子、氯离子、磷酸根残留在土壤当中与土壤中的钠离子结合形成盐，导 致盐碱化，土壤失去活性；(2)黏性土壤严重板结，砂性土壤保水保肥性能变差；(3)农作物 缺素症越来越突出。过量使用化肥影响微量元素的吸收，其实不是土壤中缺乏微量元素， 而使土壤中微量元素与N、P、K产生拮抗作用或与大量元素的比例失调，造成农作物难以吸 收；(4)导致农作物病虫害发生严重。土壤中单一使用化肥，破坏了土壤中的微生物群体平 衡有益菌比例失调，有害菌增多，侵害植物，使得病原菌、病虫害滋生繁衍不可收拾；(5)农 产品品质下降。过量使用化肥片面强调N、P、K等无机养分及微量元素的平横吸收，是农产 品的品质大不如前综合以上五个方面的问题，解决办法应该是在大量使用能促进植物光合作用，促 进作物生根，平衡作物营养的生物有机肥的同时，实行测土配方，配施适量的N、P、K及微量 元素化肥，使土壤活化，才能确保农作物的优质高产，满足人们生活水平提高后对农产品品 质和安全提出的更高要求，这已成为农业可持续发展的主流用肥方向，也是国家科技部和 农业部在全国重点推广的农业高科技术项目之一。正因如此，诸多有机肥生产厂家应运而生，各类生物有机肥也充斥着市场，但其中 存在诸多的问题，例如有些肥料营养成分简单；有机物污染超标；菌种安全性有待检验； 菌种之间是否有抑制或促进作用不明确等。
发明内容
本发明的目的在于根据现有的生物有机肥中存在的成分简单、有机物污染超标、 菌种之间有抑制或促进作用不明确等问题，提供一种益于植物生长的微生物菌液，该菌液可以制备成生物有机肥，用于促进植物生长发育。本发明另一目的在于提供上述益于植物生长的微生物菌液的制备方法。本发明还有一个目的在于提供上述益于植物生长的微生物菌液的应用。本发明上述目的通过以下技术方案予以实现一种植物益生菌生态群，该生态群最初为菌液的形式进行发酵，菌液的组分为 自生固氮菌、分解磷钾化合物细菌、酵母菌、二级安全菌种、乳酸链球菌(Streptococcus lactis acidi)禾口乳杆菌(Lactobacillus sp.)。作为一种优选方案，所述自生固氮菌为圆褐固氮菌(AzotobaterchroococcunOJP 度贝氏固氮菌(Beijerinckia indica)、维涅兰德固氮菌(A. vinelandii)中的一种或几种 的混合物。作为一种优选方案，所述分解磷钾化合物细菌为巨大芽孢杆菌 (Baci 1 lusmegaterium) $月交M芽Ififflif (Bacillus mucilaginosus) $二者白勺t昆^f^J。作为一种优选方案，所述酵母菌为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、产朊 假丝酵母(Candida utilis)、白地霉(Geotrichum candidum)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)中的一种或几种的混合物。作为一种优选方案，所述二级安全菌种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、球 形芽胞杆菌(B. subtilis)、短小芽胞杆菌(B.pumilus)、地衣芽胞杆菌(B. Iicheniformis) 中的一种或几种的混合物。以下，就其中的几种菌的分离鉴定加以说明圆褐固氮菌是利用阿须贝(Ashby)无氮培养基分离得来，革兰氏染色阴性，呈杆 菌或短杆菌，单生或对生。经过两三天的培养，成对的菌体呈“8”字形排开，并且外面有一 层厚厚的荚膜，专性好氧菌，菌落最初为透明油滴状，培养后期变成黄褐色。分类命名为 Azotobater chroococcum,菌株名为GNY，菌种冻存存于实验室_20°C冰箱。巨大芽孢杆菌可以分解不溶性的磷，又名解磷菌，是通过以Ca3(PCM)2和卵磷脂为 唯一磷源选择性培养基分离得来。其形态特征杆状，末端圆，单个或呈短链排列，直径为 1.2 1.5X2. O 4. O微米，能运动。芽胞为1.0 1.2X1. 5 2. O微米，椭圆形，中生或 次端生。生态习性为产孢杆菌，且为革兰氏阳性菌及好氧菌，也为常见的油中腐生菌。巨 大芽胞菌水解淀粉、不还原硝酸。菌落呈黄色，边缘整齐，扁平状。分类命名为Bacillus megaterium，菌株名为HPl，菌种冻存存于实验室_20°C冰箱。枯草芽孢杆菌利用牛肉膏蛋白胨培养基分离获得，革兰氏阳性菌，呈杆状，无鞭 毛，不运动，菌落扁平状，表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在固体体培养基中生长时，常 形成皱醭。分类命名为=Bacillus subtilis，菌株名为NG1，菌种冻存于实验室-20°C冰箱。酵母菌选用孟加拉红培养基分离获得，孟加拉红培养基可以抑制细菌的生长，主 要用来分离真菌(酵母菌)和霉菌。菌体形态为梭状或卵圆形，在该培养基上生长，菌落油 滴状，边缘整齐，菌落正背面颜色一致。上述的每种微生物均为农业部公布的植物益生菌，菌种安全性良好。其中，圆褐固氮菌等自生固氮菌能能将大气中的分子态氮气转化为农作物能利用 的氨，进而为其提供合成蛋白质所必需的氮素营养的肥料，这种生物固氮的方法是最便宜、 最干净、效率最高的施肥过程；巨大芽孢杆菌和胶质芽孢杆菌能够分解土壤中难溶性磷、钾等矿物营养元素，提高磷、钾的有效性；枯草芽孢杆菌能分解土壤中的有机物，转变为农作 物可以吸收利用的成分；酵母菌配合上述几种菌，能很好的分解土壤中的有机物，并能达到 除臭、富化土壤养分的作用。上述几种微生物的生长速度不同，其中自生固氮菌生长缓慢，剩余的几种菌生长 较快，因此本发明所述的微生物生态群的制备方法，是将自生固氮菌加入发酵培养基中培 养24h后，再加入其它几种菌，共同培养12h后发酵结束。本发明所述的液体发酵培养基，其中培养基含有以下成分蛋白胨、酵母粉、NaCl、 水；各组分的重量比为2 1 2 20。一种对培养过程中各菌种和有效活性菌总菌量进行实时监测的技术，具体操作包 括以下内容表1几种微生物共发酵培养的实时监测*时段菌液OD值菌落计数染色镜检(分类计数)革兰氏染色芽孢染色Oh培养基1 6h培养基1 12h培养基1 24h培养基1 培养基2: 培养基3:培养基43 Oh培养基1 培养基2: ____________ 培养基3:培养基4:36h培养基1 培养基2: 培养基3:培养基4:*说明表1中，OD值可以粗略的计算出培养基中总的有效菌数；菌落计数是通过 四种不同的培养基(选择性培养基)对上述几种不同的菌种分别进行有效活菌数的测定； 染色镜检可以通过菌体的外形，大体上确定出几类菌的数量，是快速的估算方法。培养基1、 2、3、4的配方见《附表》。本发明益于植物生长的微生物菌液可以用于促进植物生长发育。作为一种优选方 案，可以将本发明微生物菌液制备成生物有机肥。所述微生物菌液制备成生物有机肥的方法如下(1)风化煤或褐煤45 55%、磷矿粉18 22%、小麦面粉15 30%、农用硫酸 钾5%、生石灰粉3 5%的比例粉碎细筛制成底料；(2)将底料与微生物菌液按照质量比1500 2000 1的比例混合均勻进行好氧 发酵，温度控制在30°C左右48h 72h，发酵温度不超过40°C。
(3)发酵结束后依次进行造粒、烘干、筛选、冷却、计量、包装，即可制成生物有机 肥。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明益于植物生长的微生物菌液所用的各菌种均为农业部公布的安全的有益 菌种，它们之前无相互抑制作用，可以共同生长、相互配合从而具有较强的固氮、解磷解钾 和有机物分解作用，可以促进植物生长发育。本发明微生物菌液经过二次扩大发酵培养之 后即可制成生物有机肥料，可大量应用于农田林场，具有广泛的应用价值。
图1为本发明微生物菌液中的横线——圆褐固氮菌GN、印度贝氏固氮菌GA、解磷 菌NR1、乳杆菌NGl ；竖线——酿酒酵母MG1、产朊假丝酵MG2的交叉拮抗试验；图2为本发明微生物菌液中的横线——圆褐固氮菌GN、印度贝氏固氮菌GA、解磷 菌NR1、乳杆菌NGl ；竖线——白地霉MG3、热带假丝酵母MG4的交叉拮抗试验；图3为本发明微生物菌液中的枯草芽孢杆菌1、印度贝氏固氮菌GA和酿酒酵母 MGl的交叉拮抗试验。具体实施方法以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。实施例1微生物菌种之间共生、抑制交叉实验1.将实验前所需的仪器，如培养皿，三角瓶等包好送至灭菌锅，121°C，0. IMPa灭 菌25min，完成后取出放如恒温干燥箱干燥备用；2.按照附表的配方配置培养基，需要倒制平板的固体培养基中添加1. 5% -2. 0% 的琼脂即可。高压灭菌，冷却备用；3.将冻存的菌种首先复苏，菌种复苏选用液体培养基进行，30°C，120-200rpm，摇 菌过夜；4.然后将几种菌做交叉拮抗试验，划线接种平板。30°C培养24h观察菌落生长情 况。如图1 3所示。从结果可以看出，几种微生物菌种是可以共生的，而且彼此之间无明显的抑制作 用。证明该微生物生态群是可以构建的，该菌液中会包含接种的所有菌种类别。实施例2微生物生态群的共培养发酵1.按照实施例1中的步骤a进行；2.将复苏的几种固氮菌首先接种到发酵培养基中，30°C，120rpm，摇菌24 ；3.根据培养基变混浊的程度合理选择是否添加新鲜培养液，然后接种其余的几种 菌；30 37°C，150-200rpm,摇菌 12h ；4.发酵结束，构建了一含有较多微生物的生态群。所得菌液为母液，用于二次扩大培养。实施例3 二次扩大培养并制成粉剂的生物有机肥①选购原料每批购进的各种原材料必须达到上述规定的原材料质量标准，且经 检验合格后方可使用；
②粉状料配制风化煤或褐煤45-55%、磷矿粉18_22%、小麦面粉15_30%、农用 硫酸钾5 %、生石灰粉3-5 %的比例粉碎细筛制成底料③发酵方法为先将发酵罐清洗干净，加入规定量的水，启动热水循环泵和点燃热 水炉，当水温达到(冬天40 45°C;其他季节30°C)时停止加热，此时启动发酵罐搅拌机， 将粉料加入发酵罐中，再加入发酵菌种母液，连续发酵24 48小时，待搅拌均勻即可过滤 到使用罐供造粒用④二次扩大发酵培养结束后，依次进行造粒、干燥、筛选、冷却、包装，即可制成成 品。该肥料可用于农也生产、林业和相关种植业等。实施例4表2发酵培养过程菌种生长的实时监测
时段菌液OD值菌落计数染色镜检(分类计数)革兰氏染色芽孢染色Oh培养基1 6h培养基1:12h培养基1:24h培养基1: 培养基2: 培养基3:培养基4:3 Oh培养基1 培养基2:培养基3:培养基4:36h培养基1:培养基2:培养基3:培养基4:《附表》1.发酵培养基(LB培养基)蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCllOg、水IOOOmL.2.培养基1(无氮培养基)甘露醇15g，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0. 2g，NaCl 0. 2g，碳酸钙5g，质量分数10%的钼酸钠、硼酸、硫酸锰、硫酸亚铁(现配)水溶液各ImL^K 1000ml, pH 为 6. 5 7. 0。3.培养基 2 (无机磷培养基)葡萄糖 10g, (NH4)2SO4 0. 5g，NaClO. 3g，KC10. 3g， MgSO4 · 7H20 0. 3g, FeSO4 · 7H20 0. 03g, MnSO4 · 4H20 0. 03g, Ca3(PO4)2IOgJlCj^ 18g，蒸馏水 1000ml。4.培养基3 (LB培养基)蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，蒸馏水1000ml，琼脂 18g5.培养基4(孟加拉红培养基)购买自广东环凯微生物科技有限公司，成分为蛋 白5g、葡萄糖10g、孟加拉红0. 03g、氯霉素0. lg、磷酸二氢钾lg、MgSO4O. 5g、琼脂15g。
权利要求
一种益于植物生长的微生物菌液，其特征在于所述微生物菌液的组分为自生固氮菌、分解磷钾化合物细菌、酵母菌、二级安全菌种、乳酸链球菌(Streptococcus lactis acidi)和乳杆菌(Lactobacillus sp.)。
2.根据权利要求1所述的益于植物生长的微生物菌液，其特征在于所述自生固氮菌为 圆褐固氮菌(Azotobater chroococcum)、印度贝氏固氮菌(Bei jerinckiaindica)、维涅兰 德固氮菌(A. vinelandii)中的一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的益于植物生长的微生物菌液，其特征在于所述分解磷 钾化合物细菌为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)或胶质芽胞杆菌(Bacillus, mucilaginosus)或二者的混合物。
4.根据权利要求1所述的益于植物生长的微生物菌液，其特征在于所述酵母菌为酿酒 —(Saccharomyces cerevisiae)、/5^ftfiM- (Candida utilis)、自 β (Geotrichum candidum)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的益于植物生长的微生物菌液，其特征在于所述二级安全菌 种为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、球形芽胞杆菌(B. subtilis)、短小芽胞杆菌 (B.pumilus)、地衣芽胞杆菌(B. Iicheniformis)中的一种或几种的混合物。
6.权利要求1 5所述益于植物生长的微生物菌液的制备方法，其特征在于将自生固 氮菌加入发酵液中培养24h后，再加入其它几种菌，共同培养12h后发酵结束。
7.根据权利要求6所述益于植物生长的微生物菌液的制备方法，其特征在于所述发酵 液含有蛋白胨、酵母粉、NaCl和水，各组分的质量比为2 1 2 20。
8.权利要求1 5所述益于植物生长的微生物菌液在促进植物生长发育中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于所述应用是将微生物菌液制备成生物有机肥。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于将微生物菌液制备成生物有机肥的方法 如下(1)风化煤或褐煤45 55%、磷矿粉18 22 %、小麦面粉15 30 %、农用硫酸钾5 %、 生石灰粉3 5%的比例粉碎细筛制成底料；(2)将底料与微生物菌液按照质量比1500 2000 1的比例混合均勻进行好氧发酵， 温度控制在30°C左右48h 72h，发酵温度不超过40°C。(3)发酵结束后依次进行造粒、烘干、筛选、冷却、计量、包装，即可制成生物有机肥。
全文摘要
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种益于植物生长的微生物菌液及其制备方法和应用。本发明益于植物生长的微生物菌液的组分为自生固氮菌、分解磷钾化合物细菌、酵母菌、二级安全菌种、乳酸链球菌和乳杆菌。本发明益于植物生长的微生物菌液所用的各菌种均为农业部公布的安全的有益菌种，它们之前无相互抑制作用，可以共同生长、相互配合从而具有较强的固氮、解磷解钾和有机物分解作用，可以促进植物生长发育。本发明微生物菌液经过二次扩大发酵培养之后即可制成生物有机肥料，可大量应用于农田林场，具有广泛的应用价值。
文档编号C12R1/01GK101948751SQ20101024824
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者孙晗笑 申请人:孙晗笑