专利名称：一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶及其表达的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，以及该 葡苷酶在大肠杆菌中的表达。
背景技术：
β -葡萄糖苷酶(EC 3. 2. 1. 21)属于外切水解酶类，是一类在亲核分子间催化转 移糖苷的酶，可以在短链的寡糖或纤维二糖内部、在带有芳香基团或烷基的碳水化合物的 残基之间打断β_1，4-糖苷键。葡萄糖苷酶是一类重要的工业用酶，潜在应用广泛，在 众多生物技术生产过程中具有重要的应用价值。它是食品工业中重要的风味酶，可以水解 水果中的风味前体物——β “糖苷，释放出挥发性糖苷配基，充任水果风味增香酶的角色； β -葡萄糖苷酶兼具有糖苷转移酶的活性，可以用于合成新的糖配体；β “葡萄糖苷酶可以 与其他几种纤维素降解酶协同作用，将纤维素降解成葡糖糖，后者能为产能微生物利用，进 而炼制生成燃料乙醇等能源物质。在β-葡萄糖苷酶工业应用过程中，人们发现，非葡萄糖敏感的β-葡萄糖苷酶 降解纤维素的速度更快，可以改善木质纤维素的发酵工艺；并且，利用葡萄糖耐受的葡 萄糖苷酶，可生产出 20-30%浓度的果汁(Waldron CR, Becker-Vallone CA，and Eveleigh DE.Isolation and characterization of a cellulolytic actinomycete Microbispora bispora. Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986,24 :477_486.)。然而，一般情况下，β-葡 萄糖苷酶对其水解产物葡萄糖异常敏感，极低浓度的葡萄糖就能够反馈抑制β “葡萄糖 苷酶的活性。β -葡萄糖苷酶对葡萄糖的抑制常数Ki 一般为0. 5mM-100mM(ffatanabe Τ, Sato S， Yoshioka T， et al.Purification and properties of Aspergillus niger β -glucosidase. J. Biochem. 1992，209 :651_659 ；Woodward J and Wiseman A. Fungal and other β -D-glucosidases their properties and applications. Enzyme Microb. Technol. 1982,4 :73_79.)，仅有极少数的β -葡萄糖苷酶具有较高的葡萄糖耐受浓度 (Christine R, Jean-Michel S, Marie-Jose V, et al. Purification, characterization, and subatrate specificity of a novel highly glucose-tolerant β -glucosidase from Aspergillus niger. Applied and Environmental Microbiology. 1998,64(10) 3607-3614.)。
发明内容
本发明提供一种具有工业应用价值的新型葡萄糖耐受的β -葡萄糖苷酶，表达该 β“葡萄糖苷酶基因的工程菌株以及β“葡萄糖苷酶蛋白的制备方法。本发明提供一种葡萄糖耐受的β -葡萄糖苷酶(基因命名为BgllA)，原始来源于 中国南海海洋海水未培养微生物，具有如下核苷酸序列之一(1)序列表中 SEQ ID No 1 ；(2)序列表中的SEQ ID No :1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)编码序列表中SEQ ID No 2蛋白质序列的多核苷酸序列。一种葡萄糖耐受的β -葡萄糖苷酶，具有下列氨基酸序列之一(1)序列表中的 SEQ ID No 2 ；(2)序列表中的SEQ ID No :2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相 同功能蛋白质的氨基酸序列。本发明的目的还在于提供含有上述葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因的重组表 达载体。本发明的目的还在于提供含有上述葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因的宿主菌。本发明的目的还在于提供上述葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶蛋白的制备方法。含有上述葡萄糖耐受的β “葡萄糖苷酶基因的重组表达载体的构建方法，包括以 包含葡萄糖耐受的β -葡萄糖苷酶基因的BAC载体DNA为模板，以Pl和Ρ2为引物进行PCR 扩增，得到PCR扩增产物，并与pMDlS-T质粒连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态 细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质粒，获得含有葡萄糖耐受 的β -葡萄糖苷酶基因(bgllA)的pMD18-T重组质粒，用Nde I和Xho I双酶切所得的 PMD18-T重组质粒和表达质粒载体，然后用T4连接酶将酶切后的bgllA与表达质粒载体连 接，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，筛选阳性克隆，得到含有本发明bgllA基因的工 程菌株；其中所述引物为Pl 5' -GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3'P2 5' -CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3‘上述构建方法中所述表达质粒载体指pCold、pET15、pET22或pET28等。上述构建方法中所述宿主菌是指E. coli BL21(DE3)、E. coli DH5a、E. coli JM109 或 Ε. coli Rosetta 等。下面以表达质粒载体pET22b(+)、E. coli BL21 (DE3)为例，具体介绍含有本发明葡 萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因的重组表达菌株的构建方法，具体包括以下步骤(1)以包含葡萄糖耐受的β -葡萄糖苷酶基因的BAC载体DNA为模板，以Pl和Ρ2 为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；所述引物为Pl 5' -GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3'Ρ2 5' -CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3'(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和pMDIS-T质粒连接，得连接产物；将连接产物 转化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取 质粒，获得含有葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因(bgllA)的pMDIS-T重组质粒；(3)用Nde I和Xho I双酶切步骤(2)所得的pMD18_T重组质粒和pET22质粒， 然后用T4连接酶将酶切后的bgllA与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化 大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明bgllA基因的工程菌株 BL21(DE3)。与现有的葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶相比，本发明具有的优点为(1)本发明 葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因来自于海洋未培养微生物；(2)本发明葡萄糖耐受的 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受常数&为lOOOmM。高葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶可以改善木质纤维素的发酵工艺，并且可生产出高达20-30%浓度的果汁；(3)本发明葡萄糖耐受 的β -葡萄糖苷酶在ΡΗ6-9范围内具有好的稳定性；保藏说明本发明的菌株大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)/PET22b (+) bgllA已送往中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)保藏，保藏中心地址中国湖北省武汉市武昌珞珈山；菌株保藏编号为CCTCC M 2010161，保藏日期为2010年6月25日。
图1为本发明PCR扩增产物的电泳图谱；图1中1为分子量标准；2为PCR扩增产物。图2为本发明表达载体pET22b(+)/bgllA质粒的鉴定电泳图谱图2中1为分子量标准；2为pET22b(+)/bgllA质粒；3为经过Nde I/Xho I双酶 切的 pET22b(+)/bgllA ;4 为经过 Nde I/Xho I 双酶切的 pET22b (+) ；5 为重组 pET22b (+) / bgllA质粒PCR扩增产物。图3为本发明BgllA蛋白表达电泳图谱。图3中1为E.coli BL21(DE3)空细胞在0. 75mM IPTG诱导下的全菌蛋白；2为 E. coliBL21(DE3)/bgllA 未进行诱导的全菌蛋白；3 为 E. coli BL21 (DE3)/bgllA 在 0. 75mM IPTG诱导下的全菌蛋白；4为纯化的BgllA。图4为本发明BgllA葡萄糖耐受曲线。
具体实施例方式(一 )、含有本发明葡萄糖耐受的β -葡萄糖苷酶基因的表达菌株的构建下列实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。1、含有本发明葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因的阳性克隆的筛选及全长基因 的获得从中国南海海洋表层海水100L(24° 21' 17 N, 118° 08' 59 Ε)，分离微生物并 提取基因组，分离提取方法同申请号为CN200810024342. 1，按照试剂盒(购自Epicentre公 司)提供的说明构建宏基因组文库。(Chu XM, He HZ,Guo CQ, Sun BL, 2008. Identification of two novel esterases from a marine metagenomic library derived from South China Sea. Appli. Microbiol. Biotechnol. 80，615-625.)得到的单克隆放置于 384 孔板并 于-70°C保存。用平板功能筛选的方法，利用96针复制器(96 pin replicator, NUNC)将保存在 384孔板上的单克隆菌株复制到含有氯霉素(12. 5mg/L)、0. 七叶苷和0. 25%的柠檬酸 铁铵的活性LB固体平板上，将平板在37°C倒置培养20h，菌落周围显示黑色的为阳性克隆。 提取阳性克隆质粒，命名为P42H12，重新转化E. coli EPI300感受态细胞，并进行活性筛 选，菌落周围再次显示黑色的确定为阳性克隆质粒。为了获得全长β-葡萄糖苷酶基因，采用亚克隆方法对p42H12上的β -葡萄糖苷 酶基因进行定位。阳性克隆质粒先用Sau3A I(TaKaRa)进行限制性部分酶切，控制酶切时 间，收集2-5kb长度酶切片段，然后用T4 DNA连接酶(TaKaRa)将收集的DNA片段与经过BamH I酶切过的pUC19载体连接(Fermentas)，16°C连接8h后连接产物热激转化E. coli DH5a感受态细胞。转化细胞涂布在含有氨苄青霉素(100mg/L)、0. 七叶苷和0. 25%的 柠檬酸铁铵的活性LB固体平板上，将平板在37°C倒置培养20h，菌落周围显示黑色的为阳 性克隆。挑取阳性克隆，送上海生工生物工程公司测序，获得编码DNA序列。得到的序列 利用 ORF finder (http //www, ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)寻找编码 β _ 葡萄糖 苷酶基因的开放阅读框，得到一个长度为1329bp的开放阅读框，编码葡萄糖苷酶基因 (命名为bgllA)。2、葡萄糖耐受的β -葡萄糖苷酶基因的扩增根据1中获得的bgllA基因序列，设计一对寡核苷酸引物Pl和Ρ2，其序列为Pl 5' -GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3'P2 5' -CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3'在引物的5'分别引入Nde I和Xho I酶切位点，以步骤1抽提的阳性克隆质 粒P42H12为模板，扩增葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因。PCR程序如下第一阶段变性 940C，5min ；第二阶段变性 94°C，50sec，退火 60°C，50sec,延伸 72°C，90sec，共进行 25 个循 环；第三阶段延伸72°C，10min。得到的PCR产物用1 %琼脂糖电泳检测，结果见图1。得到 的葡萄糖耐受的β “葡萄糖苷酶的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No 2 所示。3、表达载体的构建将步骤2中得到PCR扩增产物，与pMD18-T质粒连接(TaKaRa)，建立如下酶切体 系25ng pMD18-T 载体，50ng PCR扩增产物，5ul ligation mix，补水至 10ul，16°C连接 lh。 连接产物热激转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，得到的转化子测序验证是否突变；挑选序 列正确的克隆提取质粒，获得含有葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因(bgllA) WpMDlS-T 重组质粒；用Nde I和Xho I双酶切所得的pMD18-T重组质粒和pET22b (+)载体，然后用 T4连接酶将酶切后的bgllA与表达质粒载体连接，建立如下酶切体系25ng pET22b (+)载 体，50ngbgllA 酶切片段，3ul IOXligation buffer, Iul T4 DNA 连接酶(TaKaRa)，补水 至30ul，16°C连接8h，得到连接产物；连接产物转化宿主菌，得到的转化子测序验证是否 突变，挑选序列正确的转化子得到含有本发明bgllA基因的工程菌株E. coli BL2KDE3)/ pET22b(+)-bgllA。(二)、含本发明葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因工程菌的表达与蛋 白纯化将(一)中获得的基因的工程菌株Ε. coli BL21(DE3)/pET22b(+)_bgllA接种于 含有氨苄青霉素的200ml LB液体培养基中，放置于37°C、250rpm条件下培养至0D600 = 0.6(UNIC0UV2102紫外可见分光光度计，以培养LB培养基为空白)；加入终浓度为0. 75mM 的IPTG进行诱导，并于30°C、180rpm条件下继续培养5小时；4°C、8000g离心收集菌体，加 入0. 1倍菌液体积的Binding buffer, 350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心 收集上清，得到粗酶液。全菌蛋白SDS-PAGE显示蛋白表达量占全菌蛋白的50%以上。粗酶液经过Ni-NTA柱层析进行纯化。洗脱液中咪唑浓度为60mM，洗脱10个柱体 积。得到的蛋白经过检测达到SDS-PAffi纯度，如图3所示。以pNPG为底物，纯化的葡萄糖耐受的β -葡萄糖苷酶BgllA的最适ρΗ为6. 5，酶 在ρΗ5. 5-7. 5范围内能够显示80%以上的酶活力。酶在ρΗ6. 0-9. 0范围内有较高的稳定性，30°C条件下保温Ih仍然能够维持原酶活力的60%以上。BgllA在15°C _55°C范围内均 能显示催化活性，其最适温度为40°C。 当反应体系中葡萄糖终浓度低于400mM时，葡萄糖的存在对酶活力由促进作用。 当葡萄糖浓度为IOOmM时促进作用最强，达到原酶活力的130%。随着葡萄糖浓度的不断升 高，酶活力逐渐受到抑制，葡萄糖对BgllA抑制的Ki为IOOOmM,如图4所示。
权利要求
一种葡萄糖耐受的β 葡萄糖苷酶，其特征在于，其基因编码具有如下核苷酸序列之一(1)序列表中SEQ ID No1；(2)序列表中的SEQ ID No1经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列；(3)编码序列表中SEQ ID No2蛋白质序列的多核苷酸序列。
2.含有权利要求1所述基因编码的葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶，其特征在于，具有下 列氨基酸序列之一(1)序列表中的SEQID No 2 ；(2)序列表中的SEQID No :2经取代、缺失或添加一个或几个氨基残基且编码相同功 能蛋白质的氨基酸序列。
3.含有权利要求1所述的细菌漆酶基因的重组表达载体。
4.含有权利要求1所述葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因的宿主菌。
5.含有权利要求1所述葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶基因的重组表达载体的构建方 法，其特征在于，具体包括如下步骤(1)以包含葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的BAC(细菌人工染色体载体(Bacterial Artificial Chromosome,)载体DNA为模板，以Pl和P2为引物进行PCR扩增，得到PCR扩 增产物；所述引物为Pl 5' -GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3'P2 5' -CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3‘(2)将步骤(1)所得PCR扩增产物和PMD18-T质粒连接，得连接产物；将连接产物转 化大肠杆菌DH5ci感受态细胞，筛选阳性克隆，进行序列分析；挑选序列正确的克隆提取质 粒，获得含有葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因(bgllA)的pMDIS-T重组质粒；(3)用NdeI和Xho I双酶切步骤(2)所得的pMD18_T重组质粒和pET22质粒，然后 用T4连接酶将酶切后的bgllA与pET22b(+)质粒连接，得到连接产物；连接产物转化大肠 杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选阳性克隆，得到含有本发明bgllA基因的工程菌株E. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A。
6.葡萄糖耐受的葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于将根据权利1所述的核酸分子或根据权利3或5所述的载体转移到微生物宿主细胞中 用于表达核酸分子，或利用根据权利4所述的表达宿主表达核酸分子；以及任选的从宿主 细胞中分泌所表达的多肽。Ε. coli BL21(DE3)/pET22b(+)-bgllA接种于含有氨苄青霉素的200ml LB液体培养基 中，放置于37°C、250rpm条件下培养至OD6tltl = 0.6 ；加入终浓度为0. 75mM的IPTG进行诱 导，并于30°C、ISOrpm条件下继续培养5小时；4°C、8000g离心收集菌体，加入0. 1倍菌液 体积的Binding buffer, 350W冰浴条件下超声40min破碎细胞，30000g离心收集上清，得到 粗酶液，所述粗酶液经过M-NTA柱层析进行纯化，得到高纯蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶及其表达，该葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶是具有SEQ ID No2所示的氨基酸序列的多肽，其基因编码序列如SEQ ID No1所示。本发明还公开了含有该葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶的表达菌株。本发明所述的β-葡萄糖苷酶来自海洋未培养微生物，具有较好的葡萄糖耐受性，可以改善木质纤维素的发酵工艺，并且可生产出高达20-30％浓度的果汁；其葡萄糖抑制常数为1000mM，本发明葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶在pH6-9范围内具有好的稳定性。
文档编号C12N15/56GK101955922SQ20101024820
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者张学成, 彭惠, 房伟, 方泽民, 洪宇植, 肖亚中 申请人:安徽大学