专利名称：一种将rna干扰引入植物的方法
技术领域：
本发明涉及一种RNA干扰的引入方法，更具体地说，涉及RNA干扰引入植物的方法。
背景技术：
目前RNAi在线虫、果蝇以及植物中的应用已取得了很多成果，在哺乳动物中的研 究和应用也已取得不少进展。RNA介导的基因沉默是植物在基因调控水平上的自我保护机 制，在对抗外源DNA侵入、病毒侵染、DNA转座和重排中发挥重要作用，具有普遍性，同时也 是植物细胞中基因表达调控的结果。目前，RNAi已成为热门研究领域之一，其潜在应用价 值十分巨大。可以预见，以RNAi为基础的技术策略应用于大规模的植物功能基因组解析、 植物抗病以及生长发育的调控等方面具有广阔的应用前景。设计一种操作方法简便、效果 明显、使用成本低的引入RNA干扰于植物的方法，应用前景一定是非常广阔的。
发明内容
本发明以现代生物技术为基础，提供一种操作简便、速度快、成本低、起效快、实时 性强的将RNA干扰引入植物的新方法，为植物基因功能分析、增强抗病性提供先进的手段。为了达到上述目的，本发明一种将RNA干扰引入植物的方法，包括如下步骤Si、根据靶基因序列设计、合成SiRNA ；S2、利用双蒸水配制-10% siRNA溶液；S3、将所述siRNA溶液喷施在植物叶片表面。优选方式下，siRNA溶液的喷施选择在植物生长旺盛期实施。RNA干扰是近几年发展起来的一种非常先进的分子生物学技术，广泛应用于大规 模的功能基因组解析、抗病以及生长发育的调控等方面。作为实现RNA干扰的一种手段， siRNA在生物体内有着诱发RNA干扰的作用。本发明采用叶面施用法将RNA干扰引入植物， 植物气孔细胞及其表皮细胞可以吸收siRNA。已经进行荧光标记的siRNA进入细胞后，又可 以通过流式细胞仪检测出来。本发明作为将RNA干扰引入植物的一种方法，具有操作简便、 速度快、成本低、起效快、实时性强、稳定、高效、使用成本低，易于推广等优点。尽管有时有 假阳性存在，但可以通过合理地设置对照来解决。
图1是本发明一种实施例RNA干扰引入植物后的检测效果图。
具体实施例方式本发明将RNA干扰引入植物的方法，核心方案包括如下步骤1.根据靶基因序列设计siRNA序列并合成之，同时进行荧光标记。其中，设计、合成siRNA序列的过程采用现有技术，通过将靶基因的mRNA逆转录成cDNA序列，然后将cDNA序列输入到设计软件如“siRNA designer”中即可。荧光标记可委 托生物技术公司进行。2.将此荧光标记的siRNA配制成-10% siRNA溶液。其中，siRNA溶液优先选用双蒸水配制。3.在植物生长旺盛时期，将一定浓度的荧光标记的siRNA溶液喷施在植物叶片表例如，在每年的6月中旬，在樱桃、苹果、桃树的叶片上喷施5%的siRNA溶液，隔3 天喷一次，连续喷施3次。4.取叶片，冲洗表面，制成溶液。5.对此溶液进行流式细胞仪分析，确认SiRNA的存在。实施例用本发明方法用于治疗植物病毒，具体为治疗苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)。步骤如下1.将ACLSV外壳蛋白基因的RNA逆转录成cDNA序列，然后将cDNA序列输入到设 计软件“siRNA designer”中设计siRNA序列并合成该序列(序列为5’ -CAG, ACC, CUU, AUU, GAA,⑶C，GAA-3，)，同时进行荧光标记(委托生物技术公司进行荧光标记)。2.将此荧光标记的siRNA配制成1%、5%和10% siRNA溶液(双蒸水配制)。3. 6月中旬，在桃树的叶片上喷施1 %、5 %和10 %的siRNA溶液，隔3天喷一次，连 续喷施3次。4.取叶片，冲洗表面，制成溶液。5.对此溶液进行流式细胞仪分析，可以确认SiRNA的存在。6.最后，对喷施siRNA溶液的叶片提取总RNA，进行逆转录-PCR分析，以检测对 ACLSV的治疗效果。7.从检测结果，如图1所示，1表示10% siRNA溶液效果；2、3表示5% siRNA溶 液效果；4表示1 % siRNA溶液效果；5表示DNA marker。图中，浓度为1 %的siRNA溶液治 疗效果在三者中最差、5%的siRNA溶液治疗效果较好，10%的siRNA溶液治疗效果最好。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此， 任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其 发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种将RNA干扰引入植物的方法，其特征在于，包括如下步骤S1、根据靶基因序列设计、合成siRNA；S2、利用双蒸水配制1％ 10％siRNA溶液；S3、将所述siRNA溶液喷施在植物叶片表面。
2.根据权利要求1所述将RNA干扰引入植物的方法，其特征在于，所述步骤S3，在植物 生长旺盛期喷施所述siRNA溶液。
3.根据权利要求2所述将RNA干扰引入植物的方法，其特征在于，喷施5%的siRNA溶 液，隔3天喷一次，连续喷施3次。
4.根据权利要求3所述将RNA干扰引入植物的方法，其特征在于，在每年的6月中旬， 将siRNA溶液喷施在樱桃、苹果或桃树的叶片上。
全文摘要
本发明公开了一种将RNA干扰引入植物的方法，包括如下步骤S1、根据靶基因序列设计、合成siRNA；S2、利用双蒸水配制1％-10％siRNA溶液；S3、将所述siRNA溶液喷施在植物叶片表面。本发明采用叶面施用法将RNA干扰引入植物，植物气孔细胞及其表皮细胞可以吸收siRNA。已经进行荧光标记的siRNA进入细胞后，又可以通过流式细胞仪检测出来。本发明作为将RNA干扰引入植物的一种方法，具有操作简便、速度快、成本低、起效快、实时性强、稳定、高效、使用成本低，易于推广等优点。
文档编号C12N15/113GK101914540SQ20101024821
公开日2010年12月15日 申请日期2010年8月9日 优先权日2010年8月9日
发明者侯义龙 申请人:大连大学