慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统的制作方法

专利名称：慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统的制作方法
技术领域：
本发明构建了慢病毒介导的猪生长激素(pig growth hormone, pGH)单质粒诱导 表达系统，属于基因工程领域，具体地讲该方法的的进一步应用可以为生产安全的，瘦肉节 粮且生长速度可调控的转GH基因猪做好铺垫。
背景技术：
(一 )生长激素生长激素(growth hormone)是由脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的单链多肽激素，具 有促进物质代谢与生长发育的作用，对机体各器官和组织均有影响，其主要作用是刺激骨、 软骨细胞的生长和分化，调节糖类、脂类和蛋白质三大物质代谢。在个体生长发育过程中，生长激素是起关键作用的激素，幼年动物缺少GH，会出 现生长停滞、身材矮小，在人类表现为侏儒症；成年动物体内的GH会随着年龄的增长而减 少，其结果是机体逐渐衰老，成人GH缺乏症表现为皮肤菲薄、肌肉重量减轻、脂肪及总体重 增加、骨质疏松、心肾功能降低、凝血机制异常、免疫功能和性功能低下，神经兴奋降低及精 神抑郁等[1]。幼年动物GH分泌过多，表现为巨人症；成年动物GH分泌过多，由于骨骺闭 合，长骨不再生长，而肢端短骨、面骨及其软骨组织则生长异常，以致出现手足粗大、鼻大、 唇厚及内脏器官增大的肢端肥大症。GH的促生长作用主要是通过其诱导靶细胞产生生长 素介质(somatomedin，SM)来实现的，SM的化学结构与胰岛素近似，又称胰岛素样生长因 子(insulin-like growth factor, IGF)。IGF的作用是促进软骨生长，它通过促进钙、磷、 钠、钾、硫等多种元素进入软骨组织，以及氨基酸进入软骨细胞，增强DNA、RNA和蛋白质的 合成，促进软骨组织增殖和骨化，使长骨加长，也能刺激多种组织细胞有丝分裂。自从1982年I^lmiter等人获得快速生长的“超级小鼠”后，人们对生长激素的转 移产生了极大的兴趣，目前已获得转GH基因猪、小鼠、兔、鱼等动物。有研究报道，Hammer等 将人的生长激素基因导入猪、兔、绵羊后，分别得到三种动物的整合个体，猪和兔体内得到 了表达；史瀛仙等将人生长激素和小鼠MT基因融合注入团头鲂和鲤鱼的受精卵，经检测表 明hGH基因在受体鱼中得到整合、转录、翻译、表达，并且具有显著的促生长效应[2]。将猪生长激素(pGH)转入猪、鼠、兔体内，发现得到的转基因猪、鼠和兔生长速度 均有明显提高，且得到的转基因阳性猪可以将导入基因部分的遗传给后代，Fl代猪亦表现 出较好的生产性状。转猪生长激素(PGH)的金鱼，不仅pGH基因得到表达，而且可通过有性 繁殖传递给后代。在转牛生长激素(bGH)基因注入小鼠受精卵，结果转入的GH基因对育成 的转基因小鼠具有明显的促生长作用，GH基因的表达具有明显的组织特异性。将牛和羊的 生长激素基因导入鲤鱼受精卵，获得转基因鲤鱼，实验证明外源基因可以遗传给后代，并对 受体鱼有明显的促生长作用[3]。目前通过基因重组技术成功合成了人生长激素(I^hGH)，其结构与人的GH相似，具 有促进物质代谢和组织细胞生长、发育、增殖、分化，调节免疫及代谢作用，目前已被广泛用 于治疗慢性肝病、改善严重创伤、烧伤、慢性阻塞性肺病等疾病领域，在减肥、抗衰老、美容等领域也在迅速增长。GH虽具有的促生长功能以及潜在的价值，但是转GH基因动物还存在诸多问题。难 以控制转入基因在宿主基因组中的行为，以及存在的安全性问题都将是面临的考验。( 二)Tet-on诱导表达系统GOSSEN等[56]建立的四环素表达调控系统，(Tet基因表达调控系统)，高效无 毒，具有严密的开关功能。该系统基础表达水平低，诱导表达水平高；调控特异性高，宿主 基因不受影响；诱导剂无相关毒性；适用范围广泛，可穿越胎盘屏障和分泌进乳汁，尤其 适合转基因研究；存在剂量依赖性，可定时定量诱导表达。应用于大多数真核细胞的一般 为双质粒调控的表达系统，即由调节质粒和反应质粒组成。其中，在四环素的衍生物强力 霉素(Doxycycline，Dox)存在下，Tet-on基因表达系统可以诱导插入启动子下游的目的 基因高效表达。目前认为，Tet-on基因表达系统是最为理想的真核生物基因诱导表达系 统，随着人们对该系统的不断的研究和改造，该系统的功能和组成都得到了提高和优化， pTRE-Tight-BI质粒含有两个受同一 TRE-mod调控的反向的迷你型CMV启动子，可同时诱导 两个不同基因的表达。(三)慢病毒慢病毒是逆转录病毒科的一个属。按照目前国际病毒分类标准，逆转录病毒科分 为7个属α逆转录病毒属，β逆转录病毒属，Y反转录病毒属，δ反转录病毒属，ε反 转录病毒属，慢病毒属，泡沫病毒属。其中的慢病毒属又分为5个组，包括牛慢病毒组、马慢 病毒组、猫慢病毒组、羊慢病毒组和人类慢病毒组。我们在实验所采用的病毒载体是HIV-I 来源的慢病毒，HIV在病毒“大家族”中的定位是逆转录病毒科慢病毒属中的人类免疫缺陷 病毒组。HIV-I的基因组由两条相同的正股RNA链在5'端通过部分碱基互补配对而成二 聚体。病毒基因组全长约9.81Λ，含有gag、p0l、env 3个结构基因以及2个调节基因(tat 反式激活因子、rev毒粒蛋白表达调节子)和4个辅助基因(nef负调控因子、vpr病毒r蛋 白、vpu病毒u蛋白和vif毒粒感染性因子)[7]。在病毒基因组的5'端和3'端各有相同 的一段核苷酸序列，称为长末端重复序列(long terminal r印eat，LTR)。慢病毒载体的构 建原理是将HIV-I基因组中的顺式作用元件(如包装信号、长末端重复序列)和编码反式 作用因子的序列进行分离，拆分在不同的质粒，使各质粒不能单独形成病毒颗粒，也不具备 感染能力te]。慢病毒载体HIV慢病毒载体系统经历了三个发展阶段，既所谓的三代，本实验 所采用的第三代慢病毒载体也就是所谓的四质粒系统，相比较而言，四质粒系统更增加了 载体系统的安全性。之所以选择慢病毒载体作为转基因的方法，是因为它有其它方法所没有的优势。 在各种转基因方法中，逆转录病毒感染法的转基因效率是最高的，且为单拷贝随机整合。慢 病毒的优势在于其一慢病毒载体既可以转染处于有丝分裂活跃期的细胞，又可以转染 分裂缓慢及处于分裂终末期的细胞，包括造血干细胞，神经干细胞，处于分化终末的神经 元，肝实质细胞等，这是通常使用的逆转录病毒所不具备的；其二由慢病毒载体携带整合 入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗能力，在体外培养细胞实验和体内 移植实验中，由慢病毒载体携带导入的目的基因可以在宿主细胞中得到长期而稳定的表 达；其三慢病毒载体可以兼容多个转录启动子，包括细胞特异性启动子和在基因组中普遍存在的管家基因的启动子；其四经过改建后的慢病毒载体可以容纳约101Λ左右的外源 基因，因此大多数的cDNA都能被克隆入慢病毒载体M。慢病毒载体的上述优点使其成为体 内和体外基因转移的一种有效工具。[1]赵东峰，李汉超，王悦然，等.基因工程人生长激素及其应用研究进展[J].广 州化工，2010, ) 44-49[2]吴婷婷，史瀛仙，杨弘，等.人生长激素基因在团头鲂和鲤中的整合和表达 [J].水产学报，1994[3]郭时金，周春凤，张志亭，等.转生长激素基因动物研究概况[J].科研综述， 2008,6(230) 8-9[4]张雪梅，丁惠国.重组人生长激素在慢性肝脏疾病及改善营养代谢中的作用 [J], Chinese General Practice. 2010,13, (10) :328-331[5]GOSSEN Μ, BUJARD H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters[J]. Proc Natl Acad Sci USA,1992, 89(12) :5547-5551[6]GOSSEN M,FREUNDLIEB S,BENDER G,et al.Transcriptional activation by tetracycline in mammalian cells[J]. Science,1995,268(5218) :1766-1769[7]陆德源.医学微生物学[Μ].第4版，人民卫生出版社，1999 :291-298.[8]Bartosch B, Cosset FL. Strategies for retargeted gene delivery using vectors derived from lentiviruses[J]. Curr Gene Ther 2004,4(4) :427-443.[9]Lai Z, Brady R 0. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinant lentivirus vector[J]. Neurosci Res, 2002,67 :363-371.

发明内容
技术问题本发明的目的是构建慢病毒介导的的单质粒的pGH诱导表达系统，方便转基因细 胞系的筛选和转基因动物的生产。慢病毒介导，提高转染效率。在强力霉素(Doxycycline/ Dox,该系统调控表达的诱导剂)的诱导下，该系统在猪胎儿成纤维细胞中实现定时，定量 的诱导表达，可为下一步生产安全的，生长速度可调控的，节粮瘦肉型转基因猪做好铺垫。技术方案本发明首先构建了 pGH双质粒诱导表达系统(pkt-on Advanced, pTRE-Tight-BI-GH)，其次将双质粒的pGH诱导表达系统改造为单质粒诱导表达系统 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 共 4221bp，然后将 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 质粒的功能片段插入慢病毒载体，用于包装病毒pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced共 8344bp。最后用病毒原液感染猪胎儿成纤维细胞，采用real-time PCR在转录水平检测了 该系统的功能。本发明所提供的慢病毒介导的pGH单质粒诱导表达系统，是由以下方法获得的DpTRE-Tight-BI-GH 表达质粒的构建设计猪生长激素引物Primerl GTGGATCCCTCAGCTCACCGGC
Pr imer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA划线部分分别为上游引物和下游引物添加的BamH I和Ml I酶切位点；以猪垂体总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶进行PCR扩增， PCR程序如下94°C预变性2min，98°C变性10s，57°C复性15s，72°C延伸30s，30个循环后， 720C 5min，4°C恒温，PCR 产物为 696bp ；将PCR扩增获得带有BamH I和Ml I位点的编码GH序列的PCR产物和 pTRE-Tight-BI分别用BamH I和Ml I进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，载体 和插入片段按摩尔比1 4混合于4°C，T4连接酶(购自TAKARA公司)16°C连接过夜，热 激转化到DH5 α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37°C培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳 性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH质粒的菌液；2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 表达质粒的构建设计rtTA-Advanced 片段引物Primer3TGACCTCCATAGAAGACACCPr imer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC划线部分为下游引物添加的BglII酶切位点，在扩增产物中47bp处包含EcoR I的 酶切位点，以浓度为Ing/ μ 1 pTet-onAdvanced质粒作为模板，扩增rtTA-Advanced片段， PCR产物为770bp ；将PCR扩增获得带有EcoR I和Bgl II位点的编码rtTA-Advanced序列的PCR产 物和pTRE-Tight-BI-GH分别用EcoR I和Bgl II进行双酶切，再次电泳凝胶纯化回收，测 定浓度，载体和插入片段按比例1 3. 5混合于4°C，T4连接酶(购自TAKARA公司)16°C 连接过夜，热激转化到DH5 α大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37°C培养过夜，利用PCR和 酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒的菌液；3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 质粒的构建设计pLenti骨架引物Primer5GCGACTTCCAGTTCAAPrimer6CTAGACTAGTCTCCACCTTCTTCTTCTAT划线部分为下游引物添加的Spe I酶切位点，以浓度为Ing/μ 1 pLenti6/V5-Gff/ IacZ质粒作为模板，扩增pLenti骨架，PCR产物为6M9bp，在扩增产物中297bp处包含 SacII的酶切位点；设计TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段引物Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAAPrimer8TCCCCGCGGCGACCAGCAACTAGAAGGCA划线部分分别为上游引物和下游引物添加的Spe I和SacII酶切位点，以浓度为 Ing/ μ 1 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 质粒作为模板，扩增 2109bp的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段，将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收后 克隆至 pMD-19 载体(购自 TAKARA 公司)。将 2109bp 的 TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced DNA功能片段PCR扩增产物进行TA克隆，pMD-19载体和插入片段按摩尔比1 10混 合于4°C，T4连接酶(购自TAKARA公司)16°C连接过夜，热激转化到DH5a大肠杆 菌(购自TIANGEN公司)中37°C培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 质粒的菌液；将PCR扩增获得带有Spe I和McII酶切位点的pLenti质粒骨架DNA和 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒分别用Spe I和 c II进行双酶切，将产物琼脂 糖电泳分离、切胶回收，测定浓度，按1 3比例混合于4°C，T4连接酶(购自TAKARA公 司)16°C连接过夜，热激转化到DH5ci大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37°C培养过夜，利 用PCR和Nru I酶切筛选鉴定阳性克隆，得到含pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质 粒的菌液，4)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒生产(1)转染前一天，用Iml质量比0. 25%胰酶消化细胞，按1 4的比例传到 4个T75cm2培养瓶中，加入IOml不含抗生素的培养基，放入37°C含体积比5% CO2培养箱进行培养；(2)转染当天，待细胞达到体积比70-90%融合度时，移除培养液，加入6ml无抗生素的培养基；以一个T75cm2培养瓶用量为例制备DNA-脂质体转染复合物在一个无菌的15ml 离管中，Mf 9 μ g ViraPower Packaging Mix 及 3· 5 μ g pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Ad vanced质粒，共12yg DNA，加入到1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻混勻，待用； 取另一无菌15ml离心管，将40 μ 1的脂质体Lipofectamine 2000加入1. 9ml 293FT无血 清无双抗培养基中，轻轻吹吸混勻，迅速与上一步的混合液混合，并轻轻混勻，室温孵育20 分钟，以形成DNA-脂质体转染复合物；(3)将转染复合物逐滴加入培养瓶中，并来回轻摇以混勻，37°C培养6 12小时 后，换上IOml新的完全无抗生素培养基；(4)转染后72小时收集含病毒的上清到无菌有盖的15ml的尖底离心管内；(5) 40C 3000rpm离心15分钟，以去除细胞沉淀；(6)取上清，用0. 45 μ m滤器抽滤；(7)抽滤过的病毒原液经4°C保存备用，即为所获得的慢病毒介导的pGH单质粒诱 导表达系统 pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒。所述慢病毒介导的pGH单质粒诱导表达系统可以在调控生长激素表达方面的应 用。其中TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段也可在调控生长激素GH基因表达方面的 得到基因工程应用。有益效果1、本发明首次公开了 pGH双质粒诱导表达系统中pTRE-Tight-BI-GH质粒序列和 构建过程。2、本发明人首次公开pGH四环素单质粒诱导表达系统 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 序列及其构建过程。3、本发明人首次公开了携带有慢病毒介导的pGH四环素单质粒诱导表达系统pLe nti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 序列及其构建过程。4、本发明人将pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液感染猪胎儿成纤 维细胞系，通过real-time PCR方法在转录水平证明了 该系统可以严密，定时，定量的调 控PGH的表达，有望用于安全，节粮瘦肉型转基因猪生产。


图1 :pGH双质粒系统中PiTet-On Advanced质粒图谱。图2 :pGH双质粒系统中pTRE-Tight-BI-GH质粒图谱。图3 :pGH四环素单质粒诱导表达系统pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced质粒图■；並图4 慢病毒介导pGH四环素单质粒诱导表达系统pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-A dvanced质粒图谱。图5 =PCR扩增2109bTRE-GH-rtTA-Advanced功能片段琼脂糖电泳图。图 6 =Spe I 和 c II 对 pLenti 骨架和 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 酶切 后琼脂糖电泳图。l、6M9bp pLenti 骨架酶切产物 2、pTA-TRE-Tight-GH-rtTA_Advanced酶 切产物，较短的条带为2099bp TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段。图 7 :pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 酶切鉴定图。Nru I 酶切该质粒后获 得1840bp、2162bp和4342bp三条验证性条带。图8 :pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液转染猪胎儿成纤维细胞后， Real-time PCR产物电泳图。图9 :pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液转染猪胎儿成纤维细胞后， GH受调控表达量化图。
具体实施例方式(一 )猪生长激素(growth hormone) DNA序列的克隆1)猪垂体总RNA的提取取杜洛克猪脑垂体组织0. 3g 首先加入Iml Trizol试剂，吹打均勻，将勻浆室温 放置5min ；加入200 μ 1氯仿，剧烈震荡混勻30s，冰上静置3min ； 12000rpm，4°C离心15min ； 将上清液小心转移到新的1. 5ml离心管中(取400 μ 1)，加入预冷的等量体积的异丙醇，上 下颠倒几次混勻，室温下放置15min。12000rpm, 4°C离心15min ；小心移去上清液，防止RNA 沉淀丢失。用70%乙醇(DEPC处理的水配制)洗涤1次，加入700 μ 1乙醇，将RNA沉淀弹 起，漂洗。8000rpm，室温离心IOmin。吸去上清，真空离心干燥3 5分钟，或放在室温下使 乙醇完全挥发掉。沉淀用10 μ 1 DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68°C处理lOmin。RNA检 测测定样品在^Onm和^Onm的吸光值按10D = 40 μ g/ml RNA计算RNA的产量；0拟60/ 世0D280在1. 8-2. 0进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，确定RNA的完整性和污染情况。2)表达片段的PCR扩增利用猪GH 的 cDNA 序列在 NCBI 网站(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)的基因数 据库中检索到Sus scrofa(pig) growth hormone CDS AY536527. 1，设计一对引物，扩增猪生 长激素DNA序列。以猪脑垂体组织总RNA反转录获得的cDNA为模板扩增出GH的cDNA序 列。猪生长激素引物PrimerlGTGGATCCCTCAGCTCACCGGCPr imer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA划线部分分别为上游引物和下游引物添加的BamH I和Ml I酶切位点。
以步骤1)获得的总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下94°C预变性 2min，98°C变性 10s，57°C复性 15s，72°C延伸 30s，30 个循环后，72°C 5min，4°C恒温。PCR 产 物为696bp。琼脂糖电泳分离、切胶回收用于重组质粒的构建。(二)重组测序质粒的构建和鉴定DpTRE-Tight-BI-GH 表达质粒的构建将PCR扩增获得带有BamH I和Ml I位点的编码GH序列的PCR产物和 pTRE-Tight-BI (购自 Clonetech 公司)分别用 BamH I 和 Sal I (BamH I 和 Sal I 购自 NEffENGLANDBiolabs)进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，按比例混合于4°C， 16°C连接过夜。热激转化到DH5ci大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37°C培养过夜，利用 PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-GH质粒的菌液。2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 表达质粒的构建以浓度为(lng/μ l)pTet-on Advanced质粒(购自Clonetech公司)作为模板， 扩增 rtTA-Advanced 片段，rtTA_Advanced 片段引物
Primer3TGACCTCCATAGAAGACACCPr imer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC划线部分为下游引物添加的BglII酶切位点，在扩增产物中47bp处包含EcoR I 的酶切位点。扩增rtTA-Advanced片段，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase购 自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下94°C预变性2min，98°C变性10s，57°C复性 15s，72°C延伸 30s，30 个循环后，72°C 5min，4°C恒温。PCR 产物为 770bp。将PCR扩增获得带有EcoR I和Bgl II位点的编码rtTA-Advanced序列的PCR 产物和 pTRE-Tight-BI-GH 分别用 EcoR I 和 Bgl II (EcoR I 和 Bgl II 购自 NEW ENGLAND Biolabs)进行双酶切，再次电泳凝胶纯化回收，测定浓度，载体和插入片段按1 5比 例混合于4°C，T4连接酶(购自TAKARA公司)16°C连接过夜。热激转化到DH5a大肠 杆菌(购自TIANGEN公司)中37 °C培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 质粒的菌液。3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 质粒的构建以浓度为Ing/ μ lpLenti6/V5-Gff/lacZ 质粒(购自 invitrogen 公司)作为模板， 扩增pLenti骨架，pLenti骨架引物Primer5GCGACTTCCAGTTCAAPrimer6CTAGACTAGTCTCCACCTTCTTCTTCTAT划线部分为下游引物添加的Spe I酶切位点，在扩增产物中297bp处包含SacII 的酶切位点。扩增pLenti骨架，用高保真酶(Prime Star HS DNA polymerase购自Takara 公司)进行PCR扩增，PCR程序如下:94°〇预变性21^11，981变性10sJ4°C复性15s，72°C延 伸 6min，30 个循环后，72°C 10min，4°C恒温。PCR 产物为 6549bp。以浓度为 Ing/ μ 1 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 质粒作为模板，扩增 TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段，TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段引物Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAAPrimer8TCCCCGCGGCGACCAGGAACTAGAAGGCA
划线部分分别为上游引物和下游引物添加的Spe I和McII酶切位点。扩增获得的2109bp TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段，用 LA Taq (TaKaRa LA Taq购自Takara公司)进行PCR扩增，PCR程序如下94 °C预变性2min，94 °C变 性 30s，55 "C 复性 30s，72 "C 延伸 2min，30 个循环后，72 °C 7min, 4 "C 恒温。PCR 产物 为2109bp。将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至pMD-19载体(购自Takara公 司)。如果两个连接产物均为PCR产物则很难实现连接，又考虑将pLenti骨架连入T载 体较困难，所以将2109bp的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段进行TA克隆得到 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 质粒的菌液(操作方法见 TAKARA 公司 pMD 19-T Vector说明书)。将PCR扩增获得带有Spe I和Mc II酶切位点的pLenti骨架和 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 质粒分别用 Spe I 和 Sac II (Spe I 和 Sac II 购自 NEffNGLAND Biolabs)进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，按比例混合于4°C，16°C 连接过夜。热激转化到DH5ci大肠杆菌(购自TIANGEN公司)中37°C培养过夜，利用PCR 和Nru I酶切筛选鉴定阳性克隆，得到含pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的菌 液。(三)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒生产1)转染前一天，用Iml 0. 25%胰酶消细胞(购自hvitrogen公司)，按 1 4的比例传到4个T75cm2培养瓶中，加入约IOml 293FT培养基(不含抗生素)，放入 37°C含5% CO2培养箱进行培养。2)转染当天，待细胞达到70-90%融合度时，移除培养液，加入6ml 293FT培养基 (无抗生素)。准备DNA-脂质体转染复合物(以一个T75cm2培养瓶用量为例)A: $ — f $ 胃白勺 15ml ^ f= ψ, M 9 Ug ViraPower Packaging Mix (Invitrogen)及 3· 5 μ gpLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 质粒，共 12 μ g DNA,力口 入到1.9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻混勻，待用。B:取另一无菌15ml离心管，将40 μ 1的脂质体Lipofectamine 2000 (Invitrogen)加入1. 9ml293FT无血清无双抗培养基中，轻轻吹吸混勻。迅速与A步的 混合液混合，并轻轻混勻。C 室温孵育20分钟，以形成DNA-脂质体转染复合物。3)将转染复合物逐滴加入培养瓶中，并来回轻摇以混勻。37°C培养6 12小时 后，换上IOml新的完全培养基(无抗生素)。4)转染后72小时收集含病毒的上清到无菌有盖的15ml的尖底离心管内。此期注意实验安全。5) 40C 3000rpm离心15分钟，以去除细胞沉淀。6)取上清，用0·45μπι滤器(Millipore)小心地抽滤，不要产生气泡。7)抽滤过的病毒原液经4°C保存备用。(四)猪胎儿成纤维细胞系的获得1)材料的获取在超净台中取出约克夏母猪子宫内的30日龄胎儿(不要破坏羊 膜)放入含有200IU/mL青霉素和200 μ g/mL链霉素的PBS液中，漂洗2 3遍，用镊子夹起胎儿，用灭菌眼科剪剪破羊膜使胎儿流出，放入含100IU/mL青霉素和100μ g/mL链霉素 的PBS液中，剪去头、尾、四肢并去除内脏，剩余组织在无菌的培养皿中用眼科剪剪切成Imm3 左右的小块。2)原代的培养向培养皿中加入3mL含0. 25%胰蛋白酶和0. 04% EDTA的消化液， 置于4°C冰箱。冷消化3 4h，吸掉上层胰酶液，剩余胰酶液刚刚没过组织块。然后39°C 培养箱继续进行消化60min，此时加入2mL的含体积比20%胎牛血清的DMEM培养液终止 消化，并用剪口吸头反复轻轻吹打松散组织，当其顺利通过吸管口时，示消化合适。后加入 lmL39°C预温的DMEM/F-12培养液(DMEM/F-12培养液含体积比20 %胎牛血清，2mmol/L谷 氨酸胺，100IU/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素)，吹打均勻后，用培养液调整细胞密度至 5 X IO5 IX IO6个细胞/mL。置于39°C，5% C02培养箱中培养。48 7 后观察，发现贴 壁后更换一半或全部培养液，此后每两天更换一次培养液。3)传代当细胞原代培养8 9天生长至体积比90%汇合时，吸出培养液，用PBS冲 洗1 2遍，加入Iml的0. 25%胰蛋白酶消化液于39°C消化约2 3min，最好不超过5min。 在显微镜下观察，待大部分细胞变圆时，立即加入anl DMEM/F-12培养液(DMEM培养液含体 积比20%胎牛血清)终止消化，轻轻吸打，制成细胞悬液，IOOOrpm离心5min后弃上清，接 种于其他培养瓶中继续培养。原皿中贴壁较紧的上皮细胞和未消化的成纤维细胞可继续培 养，获得可以传代的猪胎儿成纤维细胞系。4)冻存细胞铺满瓶底后，消化、收集细胞，离心(1200rpm，5min)，小心吸除上清 液，加入4°C预冷的细胞冻存液重悬细胞，使细胞密度达到1 3X106个细胞/mL，转入细 胞冻存管中，做好标记，放入冻存盒，将冻存盒置于-70°C过夜，，第2d取出冻存管放入液氮 罐中。(五)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液感染猪胎儿成纤维细胞后， Dox诱导GH在猪胎儿成纤维细胞中表达鉴定复苏冻存的猪胎儿成纤维细胞于6孔细胞培养板中，待细胞生长至体积比70%汇 合时，对细胞进行不同处理，每个处理设三个重复。第一组为pLenti-GFP病毒原液处理组待细胞生长至体积比70%汇合时将细胞 培养液换成ImlpLenti-GFP病毒原液，待病毒侵染12个小时后，更换新鲜的DMEM/F-12培 养液(DMEM/F-12培养液含体积比20%胎牛血清，2mmol/L谷氨酸胺，100IU/mL青霉素和 100 μ g/mL 链霉素)；第二组为pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液处理组待细胞生长至 体积比70%汇合时将细胞培养液换成Iml pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原 液，待病毒侵染12个小时后，更换新鲜的DMEM/F-12培养液；第三组为pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒原液加 Dox (购自 Sigma 公 司)处理组待细胞生长至体积比70%汇合时将细胞培养液换成Iml pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced病毒原液，待病毒侵染12个小时后，更换新鲜的DMEM/F-12诱导培养液 (DMEM/F-12培养液含1000ng/mlDox体积比20%胎牛血清，2mmol/L谷氨酸胺，100IU/mL青 霉素和100 μ g/mL链霉素)。提取各组细胞RNA，并收集细胞培养液。Real-timePCR结果显示，GH基因在胎儿 成纤维细胞内表达受Dox调控，第二组GH表达量是第一组的12. 98倍，而第三组GH表达量是第一组的130. 28倍。表明该真核表达系统受Dox严密调控。猪生长激素定量引物Primer9GTTCCTCAGCAGGGTCTTPr imer1OCCCGCAGGTATGTCTCA内参基因HPRT引物Pr imer11CTGGCAAAACAATGCAAACCTPr imer12AAGCTTGCAACCTTGACCATCT
权利要求
1.慢病毒介导的猪生长激素PGH单质粒诱导表达系统，是由以下方法获得的DpTRE-Tight-BI-GH表达质粒的构建设计猪生长激素引物PrimerlGTGGATCCCTCAGCTCACCGGCPr imer2CAACAGAGTCGACCAGCAACTAGAA划线部分分别为上游引物和下游引物添加的BamH I和Ml I酶切位点； 以猪垂体总RNA为模板，经反转录合成cDNA第一链后，用高保真酶进行PCR扩增， PCR程序如下94°C预变性2min，98°C变性10s，57°C复性15s，72°C延伸30s，30个循环后， 720C 5min，4°C恒温，PCR 产物为 696bp ；将PCR扩增获得带有BamH I和Ml I位点的编码GH序列的PCR产物和pTRE_Tight_BI 分别用BamH I和I进行双酶切，再次电泳胶纯化回收，测定浓度，质粒和插入片段按摩 尔比1 3混合于4°C，T4连接酶16°C连接过夜，热激转化到DH5 α大肠杆菌中37°C培养 过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含pTRE-Tight-BI-GH质粒的菌液；2)pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 表达质粒的构建 设计rtTA-Advanced片段引物 Primer3TGACCTCCATAGAAGACACCPr imer4ATGTCTAGATCTTTACTTAGTTACC划线部分为下游引物添加的Bgl II酶切位点，在扩增产物中47bp处包含EcoR I的酶 切位点，以浓度为Ing/μ 1 pTet-onAdvanced质粒作为模板，扩增rtTA-Advanced片段，PCR 产物为770bp ；将PCR扩增获得带有EcoR I和Bgl II位点的编码rtTA-Advanced序列的PCR产物和 pTRE-Tight-BI-GH分别用EcoR I和Bgl II进行双酶切，再次电泳凝胶纯化回收，测定浓 度，质粒和插入片段按摩尔比1 3. 5混合于4°C，T4连接酶(购自TAKARA公司)16°C连 接过夜，热激转化到DH5 α大肠杆菌中37°C培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到 含 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 质粒的菌液；3)pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒的构建 设计pLenti骨架引物 Primer5GCGACTTCCAGTTCAA Primer6CTAGACTAGTCTGCACCTTGTTCTTCTAT划线部分为下游引物添加的Spe I酶切位点，以浓度为Ing/μ 1 PLenti6/V5-GW/lacZ 质粒作为模板，扩增pLenti骨架，PCR产物为6549bp，在扩增产物中处包含McII的 酶切位点；设计 TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 功能片段引物Primer7CTAGACTAGTCCTGACGTCGGCAGTGAAAAPrimer8TCCCCGCGGCGACCAGCAACTAGAAGGCA划线部分分别为上游引物和下游引物添加的Spe I和McII酶切位点， 以浓度为 Ing/ μ 1 pTRE-Tight-BI-GH-rtTA-Advanced 质粒作为模板，扩增 2109bp 的TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段，将产物琼脂糖电泳分离、切胶回收后克隆至 PMD-19载体，热激转化到DH5 α大肠杆菌中37°C培养过夜，利用PCR和酶切筛选阳性克隆，得到含 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advan ced 质粒的菌液；将PCR扩增获得带有Spe I和SacII酶切位点的pLenti质粒骨架DNA和 pTA-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced质粒分别用Spe I和 c II进行双酶切，将产物琼脂糖 电泳分离、切胶回收，测定浓度，按1 3比例混合于4°C，T4连接酶16°C连接过夜，热激转 化到DH5ci大肠杆菌中37°C培养过夜，利用PCR和Nru I酶切筛选鉴定阳性克隆，得到含ρ Lenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 质粒的菌液；4) pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒生产(1)转染前一天，用Iml质量比0.25%胰酶消细胞，按1 4的比例传到4个 T75cm2培养瓶中，加入IOml不含抗生素的培养基，放入37°C含体积比5% CO2培养 箱进行培养；(2)转染当天，待细胞达到体积比70-90%融合度时，移除培养液，加入6ml无抗生素的 293FT培养基；以一个T75cm2培养瓶用量为例制备DNA —脂质体转染复合物在一个无菌的15ml离 9μ g ViraPower Packaging Mix 3. 5 μ g pLenti-TRE-T ight-GH-rtTA-Adv anced质粒，共12μ gDNA，加入到1. 9ml 293FT无血清无双抗培养基中，轻轻混勻，待用；取 另一无菌15ml离心管，将40 μ 1的脂质体Lipofectamine 2000加入1. 9ml 293FT无血清 无双抗培养基中，轻轻吹吸混勻，迅速与上一步的混合液混合，并轻轻混勻，室温孵育20分 钟，以形成DNA-脂质体转染复合物；(3)将转染复合物逐滴加入培养瓶中，并来回轻摇以混勻，37°C培养6 12小时后，换 上IOml新的完全无抗生素培养基；(4)转染后72小时收集含病毒的上清到无菌有盖的15ml的尖底离心管内；(5)40C 3000rpm离心15分钟，以去除细胞沉淀；取上清，用0. 45 μ m滤器抽滤；抽滤过 的病毒原液经4°C保存备用，即为所获得的慢病毒介导的pGH单质粒诱导表达系统pLenti-TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced 病毒。
2.权利要求1所述慢病毒介导的猪生长激素pGH单质粒诱导表达系统在调控生长激素 GH基因表达方面的应用。
3.权利要求1所述TRE-Tight-GH-rtTA-Advanced功能片段在调控生长激素GH基因表 达方面的基因工程应用。
全文摘要
本发明公开了慢病毒介导的猪生长激素单质粒诱导表达系统，可用来制备转基因猪，属于基因工程领域。猪生长激素(pGH)具有刺激骨及软骨组织生长、调节蛋白质、脂类和糖类代谢的功能，能显著提高猪的生长速度、瘦肉率和饲料报酬，但以往的转生长激素基因动物G H在体内表达量和表达时间不受调控，结果导致很多生理性的疾病，得不偿失。本发明首先构建了强力霉素调控的pGH双质粒诱导表达系统，其次将双质粒改造为单质粒诱导表达系统，调控猪GH定时定量表达，在转基因动物中首次报道，其次将单质粒诱导表达系统中调控表达的DNA功能片段插入慢病毒载体，采用慢病毒介导该外源基因进入动物细胞，提高了转基因效率。mRNA分析表明该系统可以使猪的GH基因实现严密的诱导表达。
文档编号C12N15/867GK102041272SQ20101024791
公开日2011年5月4日 申请日期2010年8月6日 优先权日2010年8月6日
发明者刘红林, 姜保春, 邹晓龙 申请人:南京农业大学