一种富硒螺旋藻中硒形态测定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种针对富砸螺旋藻中砸形态的测定方法，属于砸的分析测试领域。
【背景技术】
[0002]砸是人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，砸有抗氧化的作用，与人体健康息息相关，砸具有抗癌、保护心脏、抗肝坏死、防治近视和白内障、解毒、提高免疫力、延缓衰老和增强生殖功能等多种药理作用。据不完全统计，世界上有40多个国家和地区缺砸，而我国有72%的地区属于缺砸地区，因此，寻找和开发富砸产品，以保证人体摄入充足的砸，正被各国科学工作者关注。
[0003]螺旋藻是是一类低等生物，原核生物，由单细胞或多细胞组成的丝状体，圆柱形，呈疏松或紧密的有规则的螺旋旋形弯曲，形如钟表发条，故而得名。螺旋藻可直接供人体食用，营养丰富，富含蛋白质，蛋白质含量高达60%-70%，而脂肪、纤维素含量低，并且还含有种类繁多的维生素，它是维生素B12和β-胡萝卜素含量最高的食品，此外，它还是所有食物中可吸收性铁质含量最高的，同时还发现它含有具有防癌、治癌作用的藻类蛋白，以及其他大量矿质元素和提高机体免疫力的生物活性物质，具有减轻癌症放疗、化疗的毒副反应，提高免疫功能，降低胆固醇、血脂等功效。基于上述功效，螺旋藻作为一种保健类食品越来越受到人们的重视。研究表明，螺旋藻对砸具有较强的富集效果，可利用砸进行营养强化，制成富含砸的富砸螺旋藻产品，使其同时具备螺旋藻和砸的双重功效，发展前景十分广阔。
[0004]目前，国内外均有较大规模的螺旋藻人工培养，但对于螺旋藻的富砸培养还主要停留在研究阶段，市场上基本未见富砸螺旋藻产品。通过对富砸螺旋藻的文献及专利调研，发现目前富砸螺旋藻的研究，大部分仅以总砸含量作为评价指标，而没有关于富砸螺旋藻中砸以何种形式分布于藻体中的研究，即对于富砸螺旋藻的砸形态分布尚未见报道。而由于砸具有一定的毒性，有机砸比无机砸安全性更尚，且更易被人体所吸收，故富含有机砸的螺旋藻对于人体才是安全有效的。因此，有必要对富砸螺旋藻中的砸形态进行测定，弄清其砸形态的分布。目前，专门针对富砸螺旋藻中砸形态的测定方法尚未见报道，已有的砸形态测定方法主要针对植物、水产品、酵母等。“富砸大米中有机砸、蛋白砸、多糖砸或RNA砸含量测定方法”(专利申请号:201310135560.3)、微波消解-1CP-MS法直接测定海产品中有机砸、蛋白砸或多糖砸的测定方法”(专利号:ZL201210458397.1)等专利则采用对样品进行提取分离，将含砸的各组分分离后，然后利用ICP-MS上机测定各组分总砸含量，从而确定样品中的砸不同结合组分的含量。但该方法只能确定砸与何种生物大分子结合，而不能具体的得到各砸代氨基酸的种类；“一种砸的测定方法”(专利申请号:201310658482.5)介绍了利用HPLC-HG-AFS测定砸形态的方法，该方法通过测定样品中的总砸与无机砸含量，然后利用差减法得到样品有机砸的含量。该方法仅简单的利用总砸与无机砸的差值确定为有机砸含量，不仅结果不精确，而且也无法确定具体的有机砸为何种形式的砸；“从富砸酵母中提取含砸蛋白的方法”(专利申请号:201110440135.6)则介绍了一种利用pH值11~14的碱溶液对富砸酵母中含砸蛋白的提取的方法，但该法利用的强碱类溶液会对砸形态造成破坏，不利于砸形态的测定；“富砸植物材料中砸形态的测定方法”(专利申请号:201110428248.4)、“富砸食用菌中砸形态的测定方法”(专利申请号:201110428249.9)、“植物砸形态的测定方法”(专利申请号:201210215457.5)等专利介绍了植物类样品中砸形态的处理测定方法，这些方法采用对样品前处理后利用蛋白酶K和XIV进行酶解，将样品中各组分的砸温和的释放出来，然后利HPLC-HG-AFS或HPLC-1CP-MS上机测定砸形态。发明人利用上述方法对富砸螺旋藻进行砸形态测定后发现，形态提取率和仪器的检出率均很低，无法准确的得到富砸螺旋藻中砸形态分布，可能的原因是螺旋藻的属于原核生物，其细胞结构与体内砸蛋白结构均与植物不同，利用测定植物砸形态的方法无法有效的对各形态的砸进行分离。
【发明内容】
[0005]本发明的目的就是要建立一种专门用于富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，旨在填补富砸螺旋藻砸形态测定方法的空白，解决利用其他砸测形态方法提取率不高或无法检出的问题。
[0006]一种富砸螺旋藻中砸形态测定的方法，包括如下步骤:
(1)样品的前处理:取经过研磨粉碎的富砸螺旋藻干样，加入缓冲液进行超声提取；
(2)样品破壁酶解:对步骤(1)经过前处理的混合物，调节pH值至5-7，然后向其中加入溶菌酶，酶解；
(3)样品酶解，包括以下步骤的其中之一或其依顺序的任意组合(如:abcd，acd，bed等组合):
a.将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至7.5，加入蛋白酶K，酶解，
b.将步骤a酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μπι水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.5，加入蛋白酶XIV，酶解，
c.将上一步酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μπι水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至1.5-2.5，加入胃蛋白酶，酶解，
d.将上一步酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，酶解，
其中，若步骤b为样品酶解步骤中的第一步，则步骤b为将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至7.5，加入蛋白酶XIV，酶解；若步骤c为样品酶解步骤中的第一步，步骤c将步骤
(2)得到的混合物的pH值调节至1.5-2.5，加入胃蛋白酶，酶解；若步骤d为样品酶解步骤中的第一步，步骤d将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，酶解；
(4)样品分离:将步骤(3)经样品酶解后得到的混合物，进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测；
(5)上机测定:对步骤(3)和(4)中过水系膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法联用上机测定样品中的砸形态(包括:四价砸(Se4+)、六价砸(Se6+)、砸代胱氨酸(SeCys2)、砸代蛋氨酸(SeMet)、砸甲基砸代胱氨酸(SeMeCys ))。
[0007]优选地，上述的富砸螺旋藻中砸形态测定的方法包括如下步骤:
(1)样品的前处理:取经过研磨的富砸螺旋藻干样，加入缓冲液进行超声提取； (2)样品破壁酶解:对步骤(1)经过前处理的混合物，调节pH值至5-7，然后向其中加入溶菌酶，酶解；
(3)样品酶解，包括以下步骤:
a.将步骤(2)得到的混合物的pH值调节至7.5，加入蛋白酶K，酶解，
b.将步骤a酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μπι水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.5，加入蛋白酶XIV，酶解，
c.将上一步酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μπι水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至1.5-2.5，加入胃蛋白酶，酶解，
d.将上一步酶解后的混合物进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，酶解，
(4)样品分离:将步骤(3)经样品酶解后得到的混合物，进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测；
(5)上机测定:对步骤(3)和(4)中过水系膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法联用上机测定样品中的砸形态。
[0008]优选地，所述缓冲液为磷酸缓冲液或Tris-HCl缓冲液，浓度为0.1-0.2mol/L。
[0009]优选地，步骤(1)中所述富砸螺旋藻干样与缓冲液的质量体积比为0.1 ?0.2g: 5mL0
[0010]优选地，步骤(2)中溶菌酶与所述富砸螺旋藻干样的质量比为100~200:10~50，酶解温度为30-50°C，酶解时间为12~18h。
[0011 ] 优选地，步骤(3 )中蛋白酶K与所述富砸螺旋藻干样的质量比为20~50: 100-200，37 °C恒温酶解18~24h。
[0012]优选地，步骤(3)中蛋白酶XIV与所述富砸螺旋藻干样的质量比为20~50:100~200，37°C 恒温酶解 18~24h。
[0013]优选地，步骤(3)中胃蛋白酶与所述富砸螺旋藻干样的质量比为20~50:100~200，37°C 恒温酶解 18~24h。
[0014]优选地，步骤(3)中胰蛋白酶与所述富砸螺旋藻干样的质量比为20~50:100~200，37°C 恒温酶解 18~24h。
[0015]优选地，所述富砸螺旋藻样品是指经过液体培养得到的富砸螺旋藻，总砸含量在10?1000 mg/kg (DW)范围内。如:富砸钝顶螺旋藻、富砸极大螺旋藻、富砸盐泽螺旋藻等富砸螺旋藻，
相对于现有技术的方案，本发明的优点在于:
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