一种高效液相色谱法测定细菌对菲的降解的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于高效液相色谱法测定细菌对菲的降解的方法技术领域。
【背景技术】
[0002] 回收率是评价一种从前处理到色谱测定结束的分析方法可靠程度的直接指标。现 有的用高效液相色谱方法测定多环芳烃（包括菲）的方法，多为测定环境水体或者土壤中 的多环芳烃含量，也有相应测定水体或土壤的国标方法。此类方法涉及到的环境水体或土 壤在前处理过程中，几乎没有乳化的现象，所以国标方法得到的回收率通常较高。而在实验 室人工培养细菌对菲的降解实验中，由于菲浓度设定的高，加之细菌生长过程中代谢复杂， 产生大量代谢物质，使得萃取过程中产生高度乳化形象，乳化层蓄留了大量菲，若按照检测 水体中菲的国标方法进行，最后的回收率大多不足50%。此外，现有的测定方法提及的多为 采用二氯甲烷或正己烷作为助溶剂，添加到培养基后助溶剂挥干后难溶性的菲会析出为固 体漂浮在液面，与细菌接触并不充分，不均匀，从而会影响细菌对菲的利用程度。
【发明内容】
[0003] 本发明通过多次实验设计，获得了一套适宜的前处理方法，解决此类科研实验中 现有技术存在的问题，且提高了方法的回收率，本发明采用如下技术方案实现：
[0004] (1)活化菌种：从平板中挑取少量芽孢杆菌（Bacillus. sp)Y2菌株到牛肉膏蛋白 胨液体培养基，置于人工气候振荡培养箱培养；
[0005] (2)接种培养：将细菌活化扩大培养后，用无机盐培养基洗涤并重悬，然后接种到 无机盐培养基的三角瓶中，置于人工气候振荡培养箱培养；
[0006] (3)取样：定时取样20ml~50ml的菌液到分液漏斗中，向漏斗中加入一定量的用 乙醇溶解完全的菲；
[0007] ⑷液液萃取：向分液漏斗中加入2~5ml的二氯甲烧，上下剧烈摇动5分钟左右， 期间不断放气。静置2~6分钟后，收集有机相于玻璃瓶中，重复三次萃取；最后一次收集 有机相后，弃水相，用1~2ml二氯甲烷冲洗分液漏斗。
[0008] (5)浓缩定容：将收集到的有机相用旋转蒸发仪挥干后，加入甲醇充分溶解固体 物质。浓缩甲醇定容到〇. 5~lml，经0. 22um有机滤头过滤后，用高效液相色谱检测菲的含 量。
[0009] (6)定量：配制一系列浓度的菲标准品溶液，相同色谱条件检测菲的含量，采用外 标法求得样品的菲含量，与理论值作对比，求得降解率。
[0010] 本发明涉及到的一种高效液相色谱法测定细菌对菲的降解情况的方法，在振荡萃 取过程中会产生高度乳化现象，蓄留了大量菲，本方法采用离心破乳，收集乳化层于离心管 中，4°C离心10~20min ;离心后明显的分为了杂质层和有机相层，用吸管吸取有机相到玻 璃瓶中；弃杂质，用1~2ml二氯甲烷冲洗离心管，有机相汇集到玻璃管中。
[0011] 本发明涉及到的一种高效液相色谱法测定细菌对菲的降解情况的方法，经过液相 色谱检出后，回收率可达到80 %以上。
[0012] 本发明涉及到的一种高效液相色谱法测定细菌对菲的降解情况的方法，用乙醇作 为助溶剂溶解菲，再添加到培养基中，不会析出形成白色固体漂浮物，这样可以增大菲于细 菌的接触，同时乙醇浓度不高于〇. 05%时，对细菌生长几乎没有影响。
[0013] 本发明至少具有以下优点：第一，本法提高了实验方法的回收率，保证方法的可靠 可行；第二，在振荡萃取过程中会产生高度乳化现象，蓄留了大量菲，本方法采用离心破乳， 收集乳化层于离心管中，低温离心10~20min，离心后明显的分为了杂质层和有机相层，尽 可能收集有机相；第三，用乙醇作为助溶剂溶解菲，再添加到培养基中，不会析出形成白色 固体漂浮物，这样可以增大菲与细菌的接触，同时乙醇浓度不高于0. 05%时，对细菌生长几 乎没有影响。
【具体实施方式】
[0014] 下面就具体实验结果对本发明做进一步阐释和补充，如下。
[0015] 1、实施例一
[0016] (1)活化菌种：从平板中挑取少量芽孢杆菌（Bacillus. sp)Y2菌株到牛肉膏蛋 白胨液体培养基，置于人工气候振荡培养箱培养，培养环境为：温度30 °C，150r/min，培养 12h〇
[0017] (2)接种培养：将细菌活化扩大培养后0D600达到0. 8,用无机盐培养基洗涤并 重悬后，接种到无机盐培养基的三角瓶中，以空白不加菲为对照，设置三个平行，细菌接种 量为10ml，总体积为200ml，助溶剂乙醇比例为0. 05%。置于摇床培养，培养环境为：温度 30°C，150r/min，培养时间为 72h ;
[0018] (3)取样：在0h，24h，48h，72h取样30ml菌液到125ml聚四氟乙烯分液漏斗中，向 其中加入一定量的菲，使其终浓度为50ug/L。
[0019] ⑷液液萃取：向分液漏斗中加入5ml二氯甲烷。上下剧烈摇动5分钟，期间不断 放气。静置5分钟后，收集有机相于20ml玻璃瓶中，重复三次萃取。最后一次收集有机相 后，弃水相，用2ml二氯甲烷冲洗分液漏斗。
[0020] (5)离心破乳：在振荡萃取过程中产生高度乳化层，收集乳化层于离心管中， 10000r/min，4°C离心15min。离心后明显的分为了杂质层和有机相层，用吸管吸取有机相到 玻璃瓶中。弃杂质，用2ml二氯甲烷冲洗离心管，有机相汇集到玻璃瓶中。
[0021] (6)浓缩定容：将收集到的有机相用旋转蒸发仪挥干后，加入甲醇充分溶解固体 物质。浓缩甲醇定容到〇. 5ml，经0. 22um有机滤头过滤后，用液相色谱检测菲含量。
[0022] (7)高效液相色谱检测，条件如下：
[0023] 流动相：0min 80%甲醇+20%双蒸水
[0024] 15min 100% 甲醇+0%双蒸水
[0025] 流速：lml/min 波长：254nm 进样量：50ul 柱温：35°C
[0026] (8)定量：配制浓度为 10ug/L，20ug/L，30ug/L，40ug/L，50ug/L，60ug/L 的菲标准 品溶液，相同色谱条件检测菲的含量，采用空白加标法求得样品的菲含量，与理论值投入值 作对比，求得回收率。
[0027] 本发明在菲浓度为50ug/L时，在细菌生长Oh测得回收率为81. 58%，在24h时测 得回收率为82. 36%，在48h时测得回收率为83. 43%，在72h时测得回收率为81. 97%，平 均回收率为82. 335%。
[0028] 2、实施例二
[0029] (1)活化菌种：从平板中挑取少量芽孢杆菌（Bacillus. sp)Y2菌株到牛肉膏蛋 白胨液体培养基，置于人工气候振荡培养箱培养，培养环境为：温度30 °C，150r/min，培养 12h〇
[0030] (4)接种培养：将细菌活化扩大培养后0D600达到0. 8,用无机盐培养基洗涤并 重悬后，接种到无机盐培养基的三角瓶中，以空白不加菲为对照，设置三个平行，细菌接种 量为10ml，总体积为200ml，助溶剂乙醇比例为0. 05%。置于摇床培养，培养环境为：温度 30°C，150r/min，培养时间为 72h ;
[0031] (5)取样：在0h，24h，48h，72h取样30ml菌液到125ml聚四氟乙烯分液漏斗中，向 其中加入一定量的菲，使其终浓度为500ug/L。
[0032] ⑷液液萃取：向分液漏斗中加入5ml二氯甲烷。上下剧烈摇动5分钟，期间不断 放气。静置5分钟后，收集有机相于20ml玻璃瓶中，重复三次萃取。最后一次收集有机相 后，弃水相，用2ml二氯甲烷冲洗分液漏斗。
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