专利名称：人iii型前胶原放免试剂，其制备方法和其放射免疫测定方法
技术领域：
本发明涉及的是医药诊断试剂，特别是一种在放射免疫法测定下的诊断肝纤维化的人Ⅲ型前胶原hPCⅢ诊断试剂，其制备方法和其在放免测定中的使用方法。
据认为肝纤维化是各种慢性活动性肝炎向肝硬化发展的必经阶段，在肝硬化进一步造成肝实质细胞严重损害后，才能被肝功能试验确认，但一般常规肝功能试验无法诊断肝纤维化和早期肝硬化。目前临床主要依靠肝活检来判断，但此为创伤性检查，且受穿刺部位的局限，并难以进行肝纤维化进展的动态观察。根据肝硬化乃至肝癌的形成和发展的过程，世界肝病专家认为“阻止或减慢肝纤维化的发生，将会治愈大多数慢性肝病患者”，因此，早期诊断肝纤维化特别是在临床上建立肝纤维化的可靠标志物对于防止肝硬化的形成和发展具有非常重要的意义。
近年来，国内外许多学者报道，血清Ⅲ型前胶原肽-PⅢP(ProcollagenTypeⅢPeptide)是诊断肝纤维化较好的血清学指标。测定方法多采用放射性免疫测定，所用抗原从动物胎皮中提取，如德国贝林格公司(BehringwerkeCo.)推出的Ⅲ型前胶原肽RIA(RadioImmunoAssay)试剂中的关键材料PⅢP从牛胎皮提取，也有羊、鼠等胎皮中提取PⅢP的报道。其作为诊断肝纤维化标志物的依据是经研究表明肝硬化早期以Ⅲ型胶原PCⅢ增多为主，细胞在合成胶原时以前胶原形式分泌出细胞外，而血清PⅢP是Ⅲ型前胶原PCⅢ经氨基端内切肽酸作用脱下来的多肽，所以测定PⅢP含量，可以反映Ⅲ型胶原的代谢。然而动物与人类胶原分子在结构上的一些抗原决定簇存在某些差异，必然对检验结果带来影响。此外，有些学者发现肝细胞炎症和坏死均可使在肝内存在的Ⅲ型胶原裂解以致血清PⅢP值升高，因而PⅢP值不一定提示胶原形成的增加，亦即是用PⅢP测定肝纤维化会受到其它因素的影响而不准确。此外，目前引进的PⅢP放免试剂的价格非常昂贵，其具体的放免测定操作复杂，而经过复杂计算才可得到病人待测血清中的PⅢP含量。
本发明的目的是1、提供一种包括从人工流产的人胎中提取的人Ⅲ型前胶原(Human Procollagen Type Ⅲ)即hPCⅢ，其抗体anti-hPCⅢ，同位素标记抗原125Ⅰ-hPCⅢ的放免试剂;2、提供所述试剂的制备方法;3、提供所述试剂的放免测定方法。
由于上述目的，本发明存在以下三方面的内容。
一、hPCⅢ放免试剂，它包括人Ⅲ型前胶原hPCⅢ，人Ⅲ前胶原抗体anti-hPCⅢ，标记抗原125Ⅰ-hPCⅢ，分离剂。其中1、hPCⅢ按法马西(Pharmacia)公司蛋白质检验标准达到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯，用电泳考马斯亮兰R250染色呈粉红色，电泳图谱观察为单一区带，经β巯基乙醇还原后泳图谱可见两条区带分别代表肽链Proα1(Ⅲ)和Pα1(Ⅲ)，前者迁移率为0.238，蛋白质分子量为19万，后者的迁移率为0.310，蛋白分量为17万;
2、所述anti-hPCⅢ为hPC免疫家兔获得，其工作浓度用0.1%BSA，2%正兔血清NRS及0.1M，PH7.4的PBS配制;
3、所述125Ⅰ-hPCⅢ用1%BSA，0.1MPH7.4的PBS配制为浓度30000CPm/100ul;
4、所述分离剂为0.1M，PH7.4的PBS配制6%聚乙二醇PEG和以羊抗兔血清为第二抗体获得。
二、本发明所述试剂的制备方法，(一)所述抗原hPCⅢ的提纯，它包括以下几个步骤1、材料取雷佛诺尔合法引产的4-6个月胎儿的皮肤，刮去胎皮下脂肪，剪切成如1mm2大小的碎片，并用高速分散器制成匀浆;
2、配制缓冲液用20mMEDTA-Na2、20mMC对氯汞苯甲酸、10uM苄基磺酰氟配制成PH7.4，150mM的Tris-Hcl缓冲液;
3、提取皮肤匀浆先用所述缓冲液提取40-50小时之后，以3000转/分速度离心除杂10分钟，取上清液加入硫酸铵至20%饱和度后，以14000xg离心25分钟，再重溶沉淀于配置好的缓冲液中，加Nacl至10%后，使Ⅲ型胶原与前胶原沉淀，以70000xg速度离心20分钟。
4、取上述提取液沉淀溶于PH7.6Tris-HCL缓冲液中透析除盐;
5、DEAE-32层析，经230nm比色，留用达到层析洗脱曲线(参见
图1)第一峰峰值的层析管内的液体，再用PH7.6Tris-HCL缓冲液透析，浓缩后，进行DEAE-52层析，用0-200mM浓度的Nacl梯度洗脱，取达到层析洗脱曲线(参见图2)第二峰峰值的层析管内的液体，再在0.1%醋酸中透析，浓缩后即得hPCⅢ纯品;
上述抗原保存在-20℃以下，以上操作均在4℃中进行。
(二)、所述抗体anti-hPCⅢ的制备取2.5-3公斤的健康雄性家兔，进行免疫。1、基础免疫将hPCⅢ0.5ml(含200mg)，与等量完全福氏佑剂，乳化后双足趾分处皮下注射。2、追加免疫，取hPCⅢ100ug与不完全佑剂注入肋窝或腹沟肿大的淋巴结。若淋巴结不大可注入足趾或两侧背部皮下，追加免疫两次后，从耳静脉取血测试抗体效价。若效价不够理想，可继续追加免疫。待达到符合要求的抗体效价后，从颈动脉放血，分离血清、冷冻保存。
(三)、标记抗原125Ⅰ-hPCⅢ的制备采用氯胺T法，其中以半胱氨酸作还原剂标记hPCⅢ，按以下步骤将50ulPH7.5PBS和50ul含12ug的hPCⅢ混合，再加入0.5-1mCiNaⅠ125混匀后快速注入含15-25ug的氯胺T20ul，旋涡振荡2分钟，立即加入20-40ug半胱氨酸还原终止反应，取5ul用三氯醋酸法测定标记率，其余径SephadexG-25过柱纯化，分离游离碘，流速0.3ml/min，用同位素活度计检测洗脱液，出现分界清楚的两个峰(参见图3)，收集前峰进行透析，即得标记抗原纯品。
上述方法获得的试剂的质量鉴定方法及结果如下经PAGE(Coomassie blue染色)鉴定，获得的hPCⅢ为单一区带(照片1)，说明纯度达到电泳纯，区带为粉红色，符合胶原蛋白特征;经β巯基乙醇还原后电泳(SDS-PAGE)可见两条区带pro α1(Ⅲ)和pα1(Ⅲ)(照片2)，但迁移率较牛Ⅲ型前胶原的迁移率略低。经与进口(Phamacia Co.)高分子量蛋白质标准(HMW)对照测定，获得的hPCⅢ分子的亚单位的分子量分别为pro α1(Ⅲ)190，000道尔顿(Dolton)和p α1(Ⅲ)170，000 Dolton。而牛Ⅲ型前胶原的pro α1(Ⅲ)170，000道尔顿(Dolton)和p α1(Ⅲ)150，000(照片2。注PCⅢ为牛Ⅲ型前胶原;HPCⅢ即hPCⅢ;hPCⅠ为人Ⅰ型前胶原;cⅢ为牛型胶原)。由照片3(SDS-PAGE)可见到hPCⅢ的纯化过程(1-DEAE-32层析前;2-DEAE-52层析前;3，4-Sephadex G100层析前;5-Sephadex G100层析后)，可获得hPCⅢ纯品。
2、anti-hPCⅢ的鉴定将上述制备的抗血清做系列稀释，按放免法，不加竞争性抗原，绘制抗血清稀释曲线，测定其效价;免疫组织化学取肝硬化与慢性活动性肝炎各10例病人的肝活检标本，将上述制备的抗血清稀释至1∶100。该高价抗血清经免疫组化肝活检标本，光镜下可见肝硬化假小叶之间胶原纤维，证实为特异性抗体。
3、将前述125Ⅰ-hPCⅢ用三氯醋酸法测定，放射化学纯度达99.6%。
三、本发明所指的试剂的放射免疫测定方法系采用双抗体PEG法，非平衡法加样，操作前试剂按以下容量分装1、hPCⅢ标准7瓶(S0-S6)，1ml/瓶;
每瓶按hPCⅢ含量0、25、50、100、500、1000(ug/e)分装。
2、PBS1瓶，2ml;
3、anti-hPCⅢ3瓶，共22ml;
4、分离剂3瓶，共22ml;
5、125Ⅰ-hPCⅢ2瓶，共11ml;
6、质控血清1瓶，1ml。
本发明用于放射免疫测定中的测定方法按以下操作步骤100ul标准或待测血清标本→加100ulanti-hPCⅢ血清 (4℃42-48小时)/() 100ul125Ⅰ-hPCⅢ(30000cPm) (4℃6h)/() 200ul分离剂 (室温30min)/() 离心400rPm，4-10℃30min→弃上清液→测定沉淀的放射性活性计数B。
上述操作步骤的详细说明参见下表(单位ul)加样顺序 NSB S0S1S2S3S4S5S6待测血清待测血清--------100标准液 100(S0) 100 100 100 100 100 100 100 -PBS200--------hPCIII抗体-2002002002002002002002004℃放置42～48小时。
125I-hPCIII 100 100 100 100 100 100 100 100 1004℃放置6小时。
分离剂注200 200 200 200 200 200 200 200 200室温放置30分钟;4～10℃,3500转/分,离心30分钟;弃上清,测沉淀计数(B)。
注加前须充分混匀分离剂！测定结果的计算标准曲线绘制以B/B。为纵座标，hPCⅢ标准(5、25、50、100、250、500、1000ug/l)为横座标，在半对数坐标纸上以Y= (B标－NSB)/(BO-NSB) ×100%，X＝loghPCⅢ，绘制曲线。待测血清标本做双份平行管测定，查上述标准曲线即可测出结果。
用上述操作步骤获取的数据绘制的标准曲线的竞争抑制关系良好，落差大，测定范围较宽，为5-1000ug/l，灵敏度6ng/ml，批内和批间差异系数各为5.2%和6.2%，回收率为97.6-102.3%，与其他型胶原无交叉反应，方法稳定。以上指标已达到RIA法标准质量要求。
上述计算结果与肝活检纤维化程度的关系(参见图4)，经37例肝活检标本经H-E染色，按纤维化分布范围和成纤维细胞增生程度分轻、中、重三级，无纤维增生者为0级。其血清PCⅢ测定结果0级11例为89.5±18.1;轻级10例为135.5±20.5;中级8例为260.8±39.2;重级8例为369.8±68.0。血清PCⅢ随着肝纤维化程度加重递增，两者呈密切正相关(r＝0.984，P∠0.001)。
照片4-7为其中4例肝活检标本的病理切片的显微照片，证明本发明的测定结果与病清相吻合。
本发明的试剂及放免测定方法经在重庆市肿瘤医院及全国七所大医院临床试用，其效果参见下表重庆市肿瘤研究所注1七家医院结果综合组别例数均数±标准差例数均数±标准差正常对照10085.0±17.526583.4±17.8急性肝炎22131.1±30.253111.2±30.1慢迁肝1894.9±26.514393.6±26.2慢活肝13188.2±73.9122174.0±42.6代偿性肝硬化10277.4±91.013210.3±86.6失代偿性肝硬化20228.2±157.1129211.1±67.9肝硬化合并肝癌46288.7±101.462269.7±66.6原发性肝癌(单纯型)22168.5±39.3胆石症1288.0±18.61587.9±16.6其他:肝病788.2±26.02393.4±19.7非肝病1188.6±10.5表中通过上述建立的方法测定100例正常人和181例各种肝病和其他病人血清PCⅢ的结果表明，肝硬化各组和慢活肝组血清PCⅢ升高最显著，急肝和单纯性肝癌略有升高，慢迁肝、胆石症和其他疾病均无显著升高，这说明肝细胞炎病坏死可能对PCⅢ影响较小。
小结1、从雷佛诺尔人工流产的胎皮中提取、纯化人Ⅲ型前胶原、经聚丙烯酰胺凝胶电泳和还原后亚单位测定等证实hPCⅢ为纯品。
2、用hPCⅢ免疫家兔获得高价抗血清，并经免疫组化证实胶原纤维可着色。
3、用Nal125标记hPCⅢ，放化纯度达93-98%。
4、建立的血清PCⅢ放免法-双抗体PEG法，各项质量指标均符合测定要求。
5、临床上测定281例血清PCⅢ的结果100例正常对照均值±SD为85.0±17.5ug/l(单位下略)，正常上限为120;肝硬化组上升最高;代偿性、失代偿性和合并肝癌组分别为227.4±91.0、266.2±157.5和288.7±101.4;慢活肝组有显著升188.2±73.9;急肝和肝癌(单纯型)组略有升高，各为131.1±30.2和168.5±39.3;慢迁肝、胆石症和其他组均无明显升高。
6、37例肝活检按纤维化程度分为0、轻、中和重级，其血清PCⅢ分别为89.5±18.1、135.5±20.5、260.8±39.2和369.8±68.0。两者呈密切正相关(r＝0.984，P∠0.001)。
本发明的积极效果是1、以hPCⅢ为血清指标建立的放免测定法能客观地反映肝组织纤维化程度，对诊断肝纤维化及早期肝硬化的治疗具有重要的价值。
2、用本发明所述的方法能获得hPC纯品，用氯胺T法标记hPCⅢ时以半胱氨酸作还原剂所得的125Ⅰ-hPCⅢ的稳定性＞1.5月，明显较偏重亚硫酸钠的为好，对hPCⅢ分子的损伤很小，且放射化学纯度达99.6%。
3、操作简单，所有成份均配制成应用液体，分别加入即可，不必再作其它附加工作;待测的病人血清不必作任何稀释即可得到Ⅲ型前胶原含量。测定范围足够临床使用(为25-1000ug/l)，灵敏度达6ug/l;批内及批间变异系数分别仅为5.2%和6.2%，所有指标均达到PIA法质量要求。
权利要求
1.一种用于放射免疫法测定肝纤维化的试剂，其特征在于它包括人Ⅲ型前胶原hPCⅢ，人Ⅲ型前胶原抗体anti-hPCⅢ，标记抗原125I-hPCⅢ及分离剂；其中(1)、hPCⅢ按法马西(Pharmacia)公可蛋白质检验标准达到聚丙烯酰胺凝胶电泳纯，用电泳考马斯亮兰R250染色呈粉红色，电泳图谱观察为单一区带，经β巯基乙醇还原后泳图谱可见两条区带分别代表肽链Proα1(Ⅲ)和Pα1(Ⅲ)，前者迁移率为0.238，蛋白质分子量为19万，后者的迁移率为0.310，蛋白分子量为17万；(2)、anti-hPCⅢ为hPCⅢ免疫家兔获得，其工作浓度用0.1%BSA，2%正兔血清NRS及0.1M，PH7.4的PBS配制；(3)、125I-hPCⅢ用1%BSA，0.1MPH7.4的PBS配制为浓度30000CPm/100ul；(4)、分离剂为0.1M，PH7.4的PBS配制6%聚乙二醇PEG和以羊抗兔血清为第二抗体获得。
2.一种用于制备hPCⅢ的方法，其特征在于它按以下步骤进行(1)、取佛诺尔合法引产的4-6个月胎儿的皮肤，刮去胎皮皮下脂肪，剪成碎片，用高速分离器制成匀浆;(2)、用20mMEDTA-Na2，20mM对氯汞苯甲酸，10uM苄基磺酰氟配制成PH7.4，150mM的Tris-HCL缓冲液;(3)、用上述缓冲液提取皮肤匀浆40-50小时后，以3000转/分离心除杂10分钟，取上清液加入硫酸铵至20%饱和度后，以14000xg离心25分钟，再重溶沉淀于配置好的缓冲液中，加Nacl至10%后，以70000×g速度离心20分钟;(4)、取上述提取液沉淀溶于PH7.6Tris-HCL缓冲液中透析除盐;(5)、DEAE-32层析，经230nm比色，留用达到层析洗脱曲线第一峰峰值的层析管内的液体，再用PH7.6Tris-HCL缓冲液透析，浓缩后，进行DEAE-52层析，用0-200mM浓度的Nacl梯度洗脱，取达到层析洗脱曲线第二峰峰值的层析管内的液体，再在0.1%醋酸中透析，浓缩后即得hPCⅢ纯品;(6)、以上操作均在4℃中进行。
3.一种制备anti-hPCⅢ的方法，其特征在于用hPCⅢ对健康雄性家兔进行免疫，方法包括(1)、基础免疫将hPCⅢ0.5ml(含200mg)，与等量完全福氏佑剂，乳化后双足趾分处皮下注射;(2)追加免疫，取hPCⅢ100ug与不完全佑剂注入肋窝或腹沟肿大的淋巴结，或者注入足趾或两侧背部皮下，追加免疫两次后，从耳静脉取测试抗体效价，在追加免疫达到符合要求的抗体效值后，从颈动脉放血，分离分清、冷冻保存即可。
4.一种制备125Ⅰ-hPCⅢ的方法，采用的是氯胺T法，其特征在于方法中以半胱氨酸作还原剂标记hPCⅢ，按以下步骤进行将50ulPH7.5PBS和50ul含12ug的hPCⅢ混合，再加入0.5-1mCiNaⅠ125混匀后快速注入含15-25ug的氯胺T20ul，旋涡振荡2分钟，立即加入20-40ug半胱氨酸还原终止反应，取5ul用三氯醋酸法测定标记率，其余经SephadexG-25过柱纯化，分离游离碘，流速0.3ml/min，用同位素活度计检测洗脱液，出现分界清楚的两个峰，收集前峰进行透析，即得125Ⅰ-hPCⅢ纯品。
5.一种用放射免疫法测定肝纤维化的方法，其特征在于方法按以下进步骤行100ul标准或待测血清标本→加100ulanti-hPCⅢ血清 (4℃42-48小时)/() 100ul125Ⅰ-hPCⅢ(30000cPm) (4℃6h)/() 200ul分离剂 (室温，30min)/() 离心4000rPm，4-10℃30min→弃上清液→测定沉淀的放射性活性计数B→以B/B为纵座标，hPCⅢ(5、25、50、100、250、500、1000ug/l)为横座标，在半对数坐标纸上以Y = (B.-NSB)/(B.-NSB) ×100%,X＝loghPCⅢ绘制标准曲线→待测血清标本做双份平行管测定，在标准曲线上查出结果。
全文摘要
本发明涉及从人工流产胎皮中提取、纯化人III型前胶原，用此抗原制备了高效价抗血清，并以
文档编号G01N33/53GK1087997SQ93114698
公开日1994年6月15日 申请日期1993年11月18日 优先权日1993年11月18日
发明者李伟道, 刘兴明, 林丁 申请人:重庆市肿瘤研究所