一种用液相色谱法分离测定利伐沙班有关物质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析化学领域，具体涉及液相色谱法分离测定利伐沙班及其有关物质 的方法。
【背景技术】
[0002] 利伐沙班在临床上用于择期髋关节或膝关节置换手术成年患者，以预防静脉血栓 形成。该药具有安全性高、可口服、无交叉耐药性、不良反应小等优点。利伐沙班化学名为： 5-Chlor〇-thiophene-2-carboxylic acid {2-〇x〇-3-[4-(3-oxo-morpholin-4-yl)-pheny l]-〇xazolidin-5-yl_methyl}-amide，分子式为 C19H18ClN3O5Sc3 利伐沙班结构式为：
在利伐沙班的工艺生产过程中，有些重要的中间体可能会去除不完全，从而影响药 物纯度和质量；而在药物的贮藏和运输过程中，药物也可能经光照、高温、高湿等特殊 条件降解产生降解杂质；上述有关物质皆无治疗作用，还可能影响药物的稳定性和疗 效，甚至危害人体健康。对于利伐沙班主要控制的有关物质有6个，分别是有关物质1 : 2- {2-〇xo~3- [4- (3-0x0-morpholin-4-yl) -phenyl] -〇xazolidin-5-yl} -isoindole-1, 3- dione，有关物质 2 :2-{2-Hydroxy-3-[4-(3-0xo_morpholin-4-yl)-phenylamino]-pr opyl}-isoindole-l, 3-dione，有关物质 3 :Di-imidazol-1-yl_methanone，有关物质 4 : Dimethyl-pyridin-4-yl-amine，有关物质 5 :5-Chloro_thiophene-2-carboxylic acid，有 关物质 6 :4-[4_ (5-Methylamine-2-0x0-0xazolidin_3-yl) -phenyl] -morpholin-3_one〇
利伐沙班中的杂质去除不完全，将会引入原料药终产品，从而影响药物纯度和质量。因 此，实现利伐沙班及其有关物质的分离和定量测定，在利伐沙班的生产及其质量控制方面 具有重要的现实意义。
【发明内容】
[0004] 对于利伐沙班合成和贮藏过程中引入的杂质，在原料药和制剂中需进行质量控 制，因此，实现利伐沙班及其有关物质的分离，对其合成和质量控制方面具有重要的现实意 义。
[0005] 本发明所述的用液相色谱法分析利伐沙班有关物质的方法，是采用十八烷基硅烷 键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐溶液-离子对试剂-有机相为流动相。
[0006] 上述所说的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，选自Kromasil、Apollo和 Alltima等品牌的色谱柱。
[0007] 上述所说的有机相选自以下化合物：甲醇、乙腈、丙醇、异丙醇，优选甲醇。
[0008] 上述所说的方法，其流动相缓冲盐溶液-离子对试剂-有机相采用梯度洗脱。
[0009] 上述所说的方法中，缓冲盐溶液中缓冲盐选自磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、 高氯酸盐，优选磷酸盐。
[0010] 其中缓冲盐溶液中包含的缓冲盐的浓度为10~100 mmol/L，优选浓度为20 mmol/L〇
[0011] 上述所说的方法中，离子对试剂选自以下试剂：辛烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、十二烷 基磺酸钠、十二烷基硫酸钠，优选辛烷磺酸钠。
[0012] 其中离子对试剂的浓度为10~100 mmol/L，优选浓度为20 mmol/L。
[0013] 本发明所述的分离测定方法，可按照以下方法实现： 1) 取利伐沙班样品适量，用乙腈或流动相溶解样品，配制成每I mL含利伐沙班及其有 关物质〇. 1~I. 5 mg的样品溶液； 2) 设置流动相流速为0. 5~1.5 mL/min，流动相流速优选1.0 mL/min，检测波长为 205~280 nm，最佳检测波长为210 nm，柱温箱温度为30~50 °C，柱温箱温度最佳为40 〇C ； 3) 取1)的样品溶液10~50 yL，注入液相色谱仪，完成利伐沙班与有关物质的分离 测定。
[0014] 其中： 高效液相色谱仪的型号，无特别要求，本发明采用的色谱仪为岛津高效液相色谱仪： LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-lOASvp 色谱柱：C18 (Kromasil，250X4. 6 mm，5 μ m) 流动相A :20 mmol/L磷酸氢二铵缓冲溶液-20 mmol/L辛烷磺酸钠 （pH 3. 0) 流动相B :甲醇 流速：1· 〇 mL/min 检测波长：210 nm 柱温：40 °C 进样体积：10 y L 梯度条件：
本发明采用（^(1(1'〇1]^8；[1，250\4.6 1111]1，5以1]1)，能够有效的分离利伐沙班及其有关 物质。本发明解决了利伐沙班及其有关物质的分离测定问题，从而确保了利伐沙班的质量， 实现利伐沙班原料药及其制剂的质量可控(结果见附图1~5)。
【附图说明】
[0015] 图1为实施例1时的利伐沙班及其有关物质HPLC图； 图2为实施例1时的利伐沙班HPLC图； 图3为实施例2时的利伐沙班及其有关物质HPLC图； 图4为实施例2时的利伐沙班的HPLC图； 图5为实施例2时的溶剂HPLC图；
【具体实施方式】： 以下实施例用于进一步理解本发明，但不限于本实施的范围。
[0016] 实施例1 仪器与条件 高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-lOASvp ; 色谱柱：C18 (Kromasil，250X4. 6 mm，5 μ m)； 流动相A :20 mmol/L磷酸氢二铵-20 mmol/L辛烷磺酸钠缓冲溶液（pH 3. 0) 流动相B :乙腈 流速：1· 〇 mL/min 检测波长：210 nm 柱温：40 °C 进样体积：10 y L 梯度条件： 实验步骤
取利伐沙班及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含利伐沙班及其有关物 质约1.0 mg/mL的样品溶液。取上述利伐沙班及其有关物质溶液适量，配制成系统适用性溶 液；按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图1~2,图1中保留时间 为57. 332min的色谱峰为利伐沙班，其余色谱峰为利伐沙班有关物质的色谱峰；图2中保留 时间为57. 805 min的色谱峰为利伐沙班。
[0017] 实施例2 仪器与条件 高效液相色谱仪：岛津：LC-20AT，CBM-20A，SIL-20AC，SPD-M20A，CTO-lOASvp ; 色谱柱：C18 (Kromasil，250X4. 6 mm，5 μ m)； 流动相A :20 mmol/L磷酸氢二铵-20 mmol/L辛烷磺酸钠缓冲溶液（pH 3. 0) 流动相B :甲醇 流速：1· 〇 mL/min 检测波长：210 nm 柱温：40 °C 进样体积：10 y L 梯度条件：
实验步骤 取利伐沙班及其有关物质适量，分别用乙腈溶解样品，配制成含利伐沙班及其有关物 质约1.0 mg/mL的样品溶液。取上述利伐沙班及其有关物质溶液适量，配制成系统适用性溶 液；按上述条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。结果见附图3~5,图3中保留时间为 59. 068min的色谱峰为利伐沙班，其余色谱峰为利伐沙班有关物质的色谱峰；图4中保留时 间为59. 343min的色谱峰为利伐沙班，；图5为空白溶剂色谱图。
[0018] 溶液稳定性 取利伐沙班及其有关物质的供试液，以实施例2中的方法，分别于0、2、4、6、8、10、12、 24小时进样，考察样品含量测定时溶液的稳定性，由结果可见，本溶液在24小时内稳定。
[0019] 耐用性 由于上述确定的色谱条件为梯度洗脱，并确定了相应的流速、柱温、流动相PH和色谱 柱型号，故将这些条件作相应的微调，考察色谱条件的耐用性。
[0020] 流速变化在±0. lmL/min范围内，利伐沙班其有关物质的峰形没有变化，保留时 间有相应的前移和后移；柱温变化在±5°C范围内，各物质的峰形和保留时间均无较大变 化；流动相的pH变化在±0. 2范围内，各物质的峰形和保留时间也无较大变化；色谱柱的 耐用性考察中，Apo 11 〇、Kromas i 1各物质保留时间和分离度均无较大标化，色谱柱耐用性良 好。
【主权项】
1. 一种液相色谱法分离测定利伐沙班有关物质的方法，其特征在于：十八烷基硅烷键 合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐溶液-离子对试剂-有机相为流动相。2. 根据权利要求1所述的分离测定方法，色谱柱选自品牌为Kromasil、Apollo和 Alltima的色谱柱。3. 根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的有机相选自以下化合物中的一种：甲 醇、乙腈、丙醇、异丙醇。4. 根据权利要求3所述的分离测定方法，所说的有机相为甲醇。5. 根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的缓冲盐溶液选自以下缓冲盐：磷酸盐、 甲酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、高氯酸盐等。6. 根据权利要求5所述的分离测定方法，所说的缓冲盐优选磷酸盐，缓冲盐溶液中缓 冲盐的浓度优选20mmol/L。7. 根据权利要求1所述的分离测定方法，所说的离子对试剂选自以下离子对试剂：辛 烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠、十二烷基硫酸钠等。8. 根据权利要求7所述的分离测定方法，所说的离子对试剂是辛烷磺酸钠，浓度优选 20mmol/L〇9. 根据权利要求1所述的分离测定方法，其特征在于，包括以下几个步骤： 1) .取利伐沙班样品适量，分别用乙腈溶解样品，配制成每lmL含利伐沙班及其有关物 质0. 1~1. 5mg的样品溶液； 2) .设置流动相流速为0. 5~1. 5mL/min，检测波长为205~280nm，色谱柱柱温箱温度 为 30 ~50°C。 3) .流动相A为10~100mmol/L磷酸二氢铵溶液，10~100mmol/L辛烷磺酸钠，用磷 酸调pH至2. 5~4. 0 ;流动相B为乙腈或甲醇；流动相的洗脱梯度设置如下：10. 根据权利要求5所述的分离分析方法，缓冲盐优选磷酸二氢铵。11. 根据权利要求6所述的分离分析方法，缓冲盐溶液的pH值优选3. 0。12. 根据权利要求9所述的分离分析方法，步骤2)所说的流动相流速优选1.OmL/min。13. 根据权利要求9所述的分离分析方法，步骤2)所说的检测波长为210nm。
【专利摘要】本发明属分析化学领域，本发明公开了一种用液相色谱法分离测定利伐沙班有关物质及含量的方法，该方法以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以一定比例的缓冲盐溶液-有机相为流动相，可以定量测定利伐沙班及其有关物质的含量，从而有效控制利伐沙班的质量。本发明方法专属性强，准确度高，操作简便。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105259282
【申请号】CN201510603166
【发明人】牟立燕, 刘秋叶
【申请人】万特制药(海南)有限公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月20日