专利名称：：一种乙醇酸氧化酶制剂、制备方法及应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物化工领域，涉及黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂、制备方法及其用于催化乙醇酸氧化生产乙醛酸的应用。
背景技术：
：乙醛酸(Glyoxylicacid，GA)，又名二羟醋酸、甲酰甲酸，是最简单的醛酸，分子中包含醛基和羧基两种功能基团，因而兼有醛和羧酸的双重特性，可同时发生醛、酸的反应，有时还会发生环化反应，是一种重要的有机合成中间体。从乙醛酸出发，可以衍生出几十种有广泛用途的精细化工产品，广泛应用于香料、医药、农药、食品添加剂等行业中。随着乙醛酸应用范围的扩大及后继产品的开发，其市场容量不断加大，对产品的质量提出更高的要求。加速研制、开发乙醛酸及其系列产品，对发展我国的乙醛酸工业具有重要的意义。乙醛酸的合成方法包括化学合成法与生物合成法。工业上最常用的化学合成法有草酸电解还原法、乙二醛硝酸氧化法、马来酸(酐)臭氧化法。一般而言，化学合成法工艺复杂，生产成本高，能耗大，并且有较严重的环境污染。以乙醇酸为底物，用乙醇酸氧化酶作为生物催化剂，进行乙醇酸生物转化合成乙醛酸的生物合成法是现今乙醛酸生产的研究热点，与化学合成法相比，具有能耗低，副产物少，环境污染小，产物的后续分离相对简单等独特优点。随着环保措施的不断加强，通过生物法合成乙醛酸是一种必然趋势。到目前为止，在生物法合成乙醛酸的研究中，使用的酶制剂主要是基因工程重组的菠菜乙醇酸氧化酶。例如，文献/CTem.,1993,58:2253-2259报道美国杜邦公司使用游离菠菜乙醇酸氧化酶作为催化剂，在过氧化氢酶以及FMN、乙二胺等添加剂的存在下，催化乙醇酸氧化合成乙醛酸。由于游离菠菜乙醇酸氧化酶的稳定性较差，反应需在低温(15。C)下进行，游离酶无法重复使用。反应完毕后，通过对反应液加热处理，使游离乙醇酸氧化酶变性沉淀，离心去除酶的沉淀后，才能从上清液中提取产物乙醛酸。其后，杜邦公司直接使用含有酶的重组微生物细胞作为催化剂，催化乙醇酸氧化合成乙醛酸[JOze肌，1995，60:3957-3963]，反应完毕后，整细胞催化剂可以回收重复使用。由于存在较严重的细胞壁通透障碍，整细胞催化剂在使用前必须用化学试剂进行通透处理，考虑到酶的稳定性，反应仍然需在低温(5°0条件下进行。低温反应需要额外消耗能量，为了提高酶的温度稳定性，有必要对酶进行改造或进行固定化。菠菜乙醇酸氧化酶的固定化已有专利报道(DavidL.Anton,"a/.USPatent005，439，813A)，选用的载体是环氧树脂，酶活力回收率低，仅为17%，而且商品化的环氧树脂价格昂贵，不适于大规模生产应用。本发明针对以上局限，通过广泛筛选，发现植物黄花苜蓿(俗称"草头")中存在高活力的乙醇酸氧化酶，这种植物的乙醇酸氧化酶尚未见文献报道。与菠菜乙醇酸氧化酶相比，黄花苜蓿乙醇酸氧化酶性能优良，原料充足，酶的提取简便，是生物合成乙醛酸的良好生物催化剂；我们还进一步开发了一种简便、低成本且高效率的酶固定化方法，使用自行制备的纳米磁粉材料，通过简单的物理吸附方法即可很容易地实现乙醇酸氧化酶的固定化；在酶催化反应完成后，使用磁铁即可可以很容易地进行固定化酶的回收，并且进行重复使用，工艺过程非常简单，经济成本也相对较低。5
发明内容本发明的目的是提供一种黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂；本发明的目的还提供一种上述黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂的制备方法;本发明的另一目的是提供一种上述黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂.本发明的乙醇酸氧化酶制剂是采用硫酸铵沉淀法自黄花苜蓿植物破碎液中提取获得的可催化氧化乙醇酸生成乙醛酸的乙醇酸氧化酶。所述的乙醇酸氧化酶的等电点pl>9.0，反应的最适pH与反应温度分别为9.0和15°C，表观米氏常数尺m与Fmax分别为0.138mmol/L和0.173mmol'min力g蛋白。根据乙醇酸氧化酶是高等植物光呼吸途径中的关键酶这一特征，本发明人对多种具有较强光呼吸的C3植物进行了乙醇酸氧化酶含量与活力的比较。本发明的乙醇酸氧化酶筛选方法简述如下-(1)初筛称取相同重量的不同种类C3植物的新鲜叶片，加入预冷的缓冲液，研磨获得植物细胞破碎液，测定破碎液中乙醇酸氧化酶活力以及蛋白质含量。(2)复筛选定几种乙醇酸氧化酶活力比较高的植物进行详细的考察。取研磨得到的植物细胞破碎液，加入乙醇酸进行转化反应，使用离子色谱监测反应过程中产物与副产物的量。最后选择产物量高、副产物量低的植物作为新的乙醇酸氧化酶来源。采用如下方法测定植物细胞破碎液中游离乙醇酸氧化酶的活力取2.5ml30。C预热的K2HPO4-KH2PO4缓冲液(100mM，pH8.0)，置于光径1.0cm的石英比色皿中，加入0.3ml的盐酸苯肼溶液(50mM，pH8.0)以及0.1ml酶液，混匀后作为空白，在324nm处调零。加入0.1ml的乙醇酸溶液(100mM，pH8.0)，立即混匀开始反应，在读数有变化时开始计时，记录30s间隔吸光值的变化量。将上述反应条件下，1分钟内吸光值变化0.1个单位所需要的催化剂(酶)量定义为一个酶活力单位(lU)。采用如下方法测定固定化乙醇酸氧化酶的活力称取一定质量的固定化酶，置于试管中，加入2ml含50mM乙醇酸的三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)缓冲液(pH9.0，100mM，含0.1mM黄素单核苷酸FMN)，30°C，160rpm反应30min后取样100pL，将反应上清液稀释适当倍数后，取0.4ml置于试管中，加入0.2ml的1%3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(简称MBTH)溶液，摇匀后于30°C保温10min，然后加入2.5ml的氯化铁溶液(0.2n/。,w/v)，摇匀后于30°C保温30min，于紫外-可见分光光度计上610nm处测定吸光值。以0.4ml甘氨酸-HCl缓冲液(IOOmM，pH4.0)加0.2ml的1%MBTH溶液、2.5ml的0.2%氯化铁溶液(保温相同时间)作为空白对照。根据吸光值大小计算反应生成乙醛酸的摩尔量，进而根据二者的对应关系换算为盐酸苯肼法测定的酶活力。通过反复筛选、比较，最终发现黄花苜蓿是乙醇酸氧化酶的理想新酶源。本发明的酶制剂的制备方法是使用黄花苜蓿新鲜叶片作为酶源，经细胞破碎、缓冲液浸泡、提取后进行硫酸铵分级沉淀，在酶蛋白沉淀中添加适量乳糖作为保护剂后，进行冷冻干燥即可获得乙醇酸氧化酶的粗酶制剂。黄花苜蓿新鲜叶片破碎上清液与硫酸铵的重量比为1:(0.10.6);蛋白质与乳糖的重量比为l:(0.52);蛋白质和粗酶粉制剂的区别在于后者是蛋白与乳糖的混合物。这里所说的缓冲液是指磷酸盐缓冲液或者Tris-HCl缓冲液，缓冲液pH为6~9。所述的Tris表示三羟甲基氨基甲烷。在此基础上，进一步将硫酸铵沉淀的粗酶蛋白制剂进行溶解和透析除盐后，加入磁性纳米颗粒，通过物理吸附进行酶的固定化，即可获得磁粉固定化乙醇酸氧化酶制剂。酶蛋白与载体的质量比为1:(10-100)，固定化温度为15。C30。C，固定化时间为12~24小时。所述的蛋白质和透析缓冲液重量比为(15):1000;透析时间512h;透析膜孔径12000-14000Da。这里所说的磁性纳米颗粒是通过水热合成法制备所得的氨基化磁粉颗粒，其制备方法是将1，6-己二胺、无水乙酸钠和FeC^6H20按一定比例混合，溶解于乙二醇中，其中1，6-己二胺的含量为812。/。(w/v)，无水乙酸钠的含量为9~15%(w/v)，FeCl3'6H20的含量为2~5(w/v)。将混合溶液转移至高压反应釜中，于17025(TC高温环境中，静置反应410小时后取出，反应釜中生成的黑色沉淀，即为所需的磁性纳米颗粒，依次用热水和乙醇反复洗涤，烘干，备用。用乙醇酸氧化酶制剂催化乙醇酸氧化反应制备乙醛酸的工艺如下将预先调节好pH值的乙醇酸溶液、乙二胺溶液与缓冲液混合，加入过氧化氢酶、黄素单核苷酸FMN以及如上所述制备的乙醇酸氧化酶制剂，恒温反应。底物乙醇酸的浓度为50mM1000mM;乙二胺与乙醇酸的摩尔比为(11.2):1;乙醇酸氧化酶制剂的用量为10100U/mol乙醇酸；过氧化氢酶的浓度为(l10)xi()4u/ml;FMN的浓度为0.010.1mM;反应液pH为7.0~10.0;反应温度为10~35°C，反应时间为0.272h。图1黄花苜蓿乙醇酸氧化酶粗酶粉催化乙醇酸氧化反应进程；图2磁粉固定化酶制剂催化乙醇酸氧化生产乙醛酸的批次反应。图l中，(參)乙醇酸；(〇)乙醛酸；(A):甲酸；(口):草酸。具体实施方式下述实施例将有助于理解本发明，但并不限制本发明的内容和范围。实施例1黄花苜蓿乙醇酸氧化酶的制备称取100g新鲜黄花苜蓿，冷却至4°C，加入140ml预冷的磷酸钾缓冲液(100mM，pH8.0)，加少量石英砂助研，四层纱布过滤。8000rpm离心8min，上清液体积约200ml，冰浴，低速磁力搅拌，缓慢加入研细的硫酸铵粉末9.35g，静置30min，13000rpm离心8min，取上清液，约170ml，再缓慢加入9.52g研细的硫酸铵粉末，静置30min，13000rpm离心8min，取沉淀，加入5g乳糖粉末作为冻干保护剂，冷冻干燥后制成粗酶制剂，活力约297U/g,4t保存。实施例2磁性纳米材料的制备称取l，6-己二胺3.6g，无水乙酸钠4.0g，FeCl3'6H20l.Og，置于锥形瓶中，加入30ml乙二醇，磁力搅拌下使其混溶，形成透明液体，转移至高压反应釜中，于20(TC静置反应6小时后取出，釜底可见有黑色沉淀，即为所需的磁性纳米颗粒，用热水和乙醇清洗(3次)所得的磁粉颗粒，洗去残留的溶剂和l，6-己二胺，5(TC烘干，备用。实施例3磁性纳米材料固定化乙醇酸氧化酶称取500mg磁粉，置于100ml圆底玻璃烧瓶中，加入50mlTris-HCl缓冲液(pH9.0，100mM，含O.lmMFMN)，超声使磁粉悬浮后，加入1.0g乙醇酸氧化酶粗酶粉(约297U)，于15。C、160rpm缓慢搅拌24h，用磁铁将获得的固定化酶吸在容器底部，用吸管移去上清液。用100ml含0.1mMFMN的Tris-HCl缓冲溶液(pH9.0，100mM)反复洗涤获得的固定化酶，至洗涤液中检测不到蛋白为止，4。C保存。固定化酶活力约214U/g。实施例4氧化酶制剂催化乙醇酸的转化称取0.4g粗酶粉溶解于4ml磷酸钾缓冲液(100mM，pH8.0)中，加入0.1g过氧化氢酶(约26800U);再加入1ml525mM的乙二胺溶液(KPB稀释，盐酸调节pH至8.0)，以及5mllOOmM的乙醇酸溶液(KPB稀释，NaOH调节pH至8.0)，15°C反应5h，结果如图1所示，乙醇酸的转化率达88.7%，产物乙醛酸的浓度达43.3mmol/L。实施例5磁粉固定化酶催化乙醇酸的转化在50ml锥形瓶中加入Tris-HCl缓冲液(pH9.0，500mM，含0.1mMFMN)、乙醇酸、乙二胺(与乙醇酸的摩尔比为1.05:1)、50mg过氧化氢酶(1.31xl(^IU)以及固定化乙醇酸氧化酶，反应液总体积为10ml。30°C，200rpm恒温震荡反应，用MBTH法定时检测产物浓度，至产物浓度不再增加为止，结果见表l。表1磁粉固定化酶催化乙醇酸的转化反应<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>实施例6固定化酶生产乙醛酸的批次反应在圆底烧瓶中加入50ml含乙醇酸100mM、乙二胺102mM、过氧化氢酶50mg(1.31x106IU)的Tris-HCl缓冲液(pH9.0，100mM，含0.1mMFMN)，107U的固定化乙醇酸氧化酶，3(TC水浴保温，200rpm恒速搅拌反应，MBTH法定时检测产物浓度。底物乙醇酸完全转化后，用磁铁将固定化酶吸在反应器底部，移除反应上清液后用Tris-HCl缓冲液(pH9.0，100mM，含0.1mMFMN)洗涤固定化酶(2xl00ml)，然后再加入含底物的新鲜缓冲溶液，再次开始反应。结果如图2所示，经过四批反应，约70小时后，得到产物乙醛酸量为19.79mmol，得率为98.9%。固定化酶的残留活力为初始活力的70%，在该反应条件下固定化酶的半衰期大约为117h。权利要求1.一种乙醇酸氧化酶制剂，其特征在于所述的乙醇酸氧化酶是采用硫酸铵沉淀法自黄花苜蓿植物破碎液中提取获得的可催化氧化乙醇酸生成乙醛酸的乙醇酸氧化酶。2.如权利要求1所述的乙醇酸氧化酶制剂，其特征在于所述的乙醇酸氧化酶的等电点p1〉9.0，反应的最适pH与反应温度分别为9.0和15°C，表观米氏常数ATm与Fmax分别为0.138mmol/L和0.173mmol'min'Vg蛋白。3.—种如权利要求1所述的乙醇酸氧化酶制剂的制备方法，其特征在于所述的乙醇酸氧化酶采用如下(1)或(2)步骤分别获得乙醇酸氧化酶的粗酶粉制剂或磁粉固定化酶制剂(l)乙醇酸氧化酶粗酶粉制剂将新鲜黄花苜蓿叶片破碎、离心，收集上清液，缓慢加入硫酸铵粉末待完全溶解后，继续缓慢搅拌30min，收集沉淀的蛋白质，加入适量乳糖作为冻干保护剂，冷冻干燥后制得粗酶粉制剂；所述的上清液与硫酸铵的重量比为1:(0.10.6);蛋白质与乳糖的重量比为l:(0.52);(2)磁粉固定化乙醇酸氧化酶制剂将新鲜黄花苜蓿叶片破碎、离心，收集上清液，缓慢加入硫酸铵粉末，收集沉淀的蛋白质，溶解于pH为69的缓冲液中，透析除去硫酸铵，然后加入磁性纳米颗粒作为固定化载体，通过吸附和洗涤制成磁粉固定化酶制剂；所述的上清液与硫酸铵的重量比为1:(0.10.6);蛋白质和缓冲液重量比为(15):1000;透析时间5~12h;透析膜孔径12000-14000Da。4.如权利要求3所述的乙醇酸氧化酶制剂的制备方法，其特征在于步骤(2)进行硫酸铵沉淀酶时，所加硫酸铵的量为10%~70%的饱和度;所述的缓冲液是磷酸盐缓冲液或Tris-HCl缓冲液。5.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中所述的磁性纳米颗粒固定化载体为用水热合成法制备所得的氨基化磁性纳米颗粒；酶蛋白质与磁性载体的重量比为1:(10~100)，固定化温度为15。C30。C，固定化时间为12~24小时。6.如权利要求5所述的方法，其特征是所述磁性纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤将1，6-己二胺的含量为8~12%(w/v)、无水乙酸钠的含量为9~15%(w/v)和FeCl3.6H20的含量为25。/。(w/v)的乙二醇溶液于170250。C静置反应410小时后生成的黑色沉淀的磁性纳米颗粒，依次用热水和乙醇反复洗涤，烘7.—种如权利要求l所述的乙醇酸氧化酶制剂应用于催化氧化乙醇酸制备乙醛酸。8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的制备为在50mM-lOOOmM的pH为7.0-10.0的乙醇酸溶液，加入如权利要求3(1)或(2)所述的乙醇酸氧化酶制剂，在1035。C反应0.272h;其中，基于底物量的乙醇酸氧化酶制剂使用量为10-100U/mo1乙醇酸。9.如权利要求8所述的应用，其特征在于在制备时添加适量的乙二胺、黄素单核苷酸以及过氧化氢酶，乙二胺与乙醇酸的摩尔比为(1~1.2):1;黄素单核苷酸的浓度为0.01-0.1mM;过氧化氢酶的添加量为(110)X104U/ml。全文摘要本发明公开了一种黄花苜蓿乙醇酸氧化酶制剂，其制备方法及用于乙醇酸氧化以制备乙醛酸的应用。所述的乙醇酸氧化酶制剂是将植物黄花苜蓿汁液经过硫酸铵沉淀、冷冻干燥等步骤制备而得；亦可将硫酸铵沉淀所得的酶蛋白溶解、透析除盐后，上载于磁性纳米颗粒材料，即可制得磁粉固定化的乙醇酸氧化酶制剂。利用乙醇酸氧化酶作为生物催化剂，在温和的条件下催化乙醇酸有限氧化为乙醛酸，当底物浓度为50～1000mM时，乙醛酸的产率最高可达98.9％。若使用磁粉固定化的乙醇酸氧化酶作为催化剂，则在反应结束后，可通过磁场作用很容易地将固定化酶从反应体系中分离出来，并可以多次反复使用。文档编号C12N11/00GK101307307SQ200810040498公开日2008年11月19日申请日期2008年7月11日优先权日2008年7月11日发明者虹朱,江潘,彬胡,许建和申请人:华东理工大学