专利名称：牛基因组假attP位点及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说，是关于牛基因组中能被链霉菌噬菌体cDC31整合酶识别的假attP位点及其应用。
背景技术：
哺乳动物细胞中导入外源基因的方法有很多种，物理方法主要有受精卵原核显微注射法、电穿孔法；化学方法主要有磷酸钙-DNA共沉淀法、DEAE-葡聚糖法、脂质体介导法及生物学的病毒介导方法等等，但所有的外源基因导入方法均涉及到外源基因的随机整合及表达的问题，外源基因整合位点的随机性将给目的基因及宿主细胞带来不可预知的后果1、外源基因的随机整合可能会造成位置效应影响，导致目的基因表达水平的不稳定甚至不表达；2、对宿主细胞的基因组而言，外源基因的随机性插入可能激活或抑制某些内源基因，改变其原先正常有序的基因表达调控模式，致使细胞癌变甚至死亡。
位点特异性重组是自然界中实现遗传物质重组的另一种形式，指在噬菌体整合酶的作用下，噬菌体基因组与细菌基因组在约几十个特定的碱基之间发生的重组反应。人们利用这一特定的整合方式而实现外源基因在哺乳动物基因组中进行定点修饰。Cre酶及Flp酶是目前在哺乳动物基因组修饰中较为常用的两种酶。尽管存在着一些局限如外源基因在整合后还可能解离反应，即已整合的外源基因在重组酶的作用下从染色体上切除等，这两种酶广泛地被运用于基因组的精确修饰(Nagy A， Genesis. 2000 Feb; 26 (2): 99-109) (Nagy A,Methods Mol Biol. 2001; 158: 95-106) (Kolb AF, Cloning Stem Cells. 2002; 4(1): 65-80)。
一种来源于①C31链霉菌(S"e/ tom;;cM)噬菌体的整合酶即①C31整合酶，由于它是以单向整合方式，重组过程无须其他辅助因子，而且整合率高的特点，所以近年来越来越多地被用来介导外源基因与宿主基因组的特异性整合。在自然界中OC31整合酶介导噬菌体基因组中39bp的attP位点(attachment site in phage genome)与细菌基因组中34bp的attB位点(attachment site in bacteria genome)发生特异性整合，OC31整合酶分别切断attP位点及attB位点的核心序列，在链发生交换后，四条链的末端重新连接，这样噬菌体基因组被稳定整合入细菌基因组中，噬菌体基因组的左右两端分别是两个杂合的短序列attL、attR (Thorpe HM， Proc Natl Acad Sci USA. 1998 May 12; 95(10): 5505-10) (Groth AC, ProcNatl Acad Sci USA. 2000 May 23; 97(11): 5995-6000)。因为与其他的重组酶如Cre酶及Flp酶不同，①C31整合酶介导的整合是单向性，它不会发生回复切除，即当attB、 attP两序 列发生特异性重组后，所产生的attL和attR不会被①C31整合酶识别而被再次介导重组(Thorpe HM， Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998 May 12; 95(10): 5505-10) (Groth AC, Proc. Natl. Acad. Sci. US A. 2000 May 23; 97(11): 5995-6000)，这样的整合显得有效、稳定。而 且，①C31整合酶介导的重组过程中无需其他辅助因子，这些优点使OC31整合酶在生物 工程上具有重要的利用价值，有研究发现，①C31整合酶在哺乳动物中能有效介导携带有 attB序列的外源基因与哺乳动物基因组发生高效重组反应，实现位点特异性整合(Thyagarajan B, Mol. Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-34)。事实上，OC31整合酶介导的 重组反应，广泛地被运用于诸多领域，包括转基因动物制备、基因治疗、基因组修饰等(Nimmo D D, Mol. Biol. 2006 Apr; 15(2): 129-36) (Allen BQ Nat. Protoc. 2006; 1(3): 1248-57) (Bertoni C, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006 Jan 10; 103(2): 419-24) (Bateman J R, Genetics. 2006 Jun; 173(2): 769-77) (Ehrhardt A, Mol Ther. 2007 Jan; 15(1): 146-56)。当携带attB序列的质粒在巾C31整合酶的介导下，在attB序列的核心位点断裂并与 哺乳动物基因组的某些位点发生特异性重组时，其基因组上的整合位点被称为假attP位点(Thyagarajan B， Mol Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-34)。假attP位点与噬菌体中的attP 位点有着部分同源性，广泛存在于多种物种的动物基因组中，而且研究发现每种物种往往 存在着多个假attP位点。人们分别从人、小鼠、大鼠、兔、果蝇基因组中检测到31、 57、 3、 3、 3个假attP位点(Thyagarajan B, Mol Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-34) (Chalberg T W， Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005 Jun; 46(6): 2140-6) (Keravala A, J Gene Med. 2006 Aug; 8(8): 1008-17) (Groth AC, Genetics. 2004 Apr; 166(4): 1775-82)。多假attP位点的现象使外 源基因的整合变得非特异性。这对于利用该重组系统进行遗传操作带来一定的麻烦。然而， 进一步的研究结果表明在诸多的假attP位点中其整合频率往往不是均等的，存在着若干优 先整合位点(热点)。据报道，在小鼠基因组中发现了一个高频整合位点mpsLl，位于2 号染色体上，处在编码序列以外。与己发现的其他的假attP位点相比，mpsLl位点被整合 的频率明显最高，在所有的受试小鼠中均能检测到该位点(Olivares E C， Nat Biotechnol. 2002 Nov; 20(11): 1124-8) (Held P K， Mol Ther. 2005 Mar; 11(3): 399-408)。而且，更为重 要的是整合入该位点的外源基因均能得到持续高效地表达(Olivares E C， Nat Biotechnol. 2002 Nov; 20(11): 1124-8)。在人基因组中人们同样也检测到了一个热点，命名为假attP位 点A。体内实验的结果表明，外源基因在该位点的整合率高达40%，在该位点整合的外源 基因可保持稳定、高水平地表达，而且所表达的蛋白功能正常(Thyagarajan B， Mol Cell Biol. 2001 Jun; 21(12): 3926-34) (Ortiz-Urda S， Nat Med. 2002 Oct; 8(10): 1166-70)。最近，本申请的发明人通过研究证实①C31整合酶同样能介导attB序列与牛基因组中的某些特定序列发生位点特异性重组，并且首次在牛基因组中发现了两个假attP位点BpsFl、 BpsMl (中国发明专利申请，申请号200510111476.3)，他们均不存在于编码区，其中，BpsFl位于28号染色体上，BpsMl位于19号染色体上(Ma Q W， Biochem BiophysRes Commun. 2006 Jul 7; 345(3): 984-8)。
发明内容
本申请的发明人在已有研究结果的基础上，继续对牛基因组中假attP位点进行检测，在牛耳皮肤成纤维细胞中又发现一个新的假attP位点，该位点能以较高频率地被整合，然后利用同源重组的机制，使目的基因能更高频率地整合于该位点，而且整合于该位点的目的基因能高效稳定地表达。
因此，本发明的首要目的在于提供一个新的牛基因组中链霉菌噬菌体①C31整合酶可识别的假attP位点。
本发明的第二个目的在于提供一种利用该假attP位点的旁侧序列构建的定向整合载体。
本发明的第三个目的在于提供一种所述定向整合载体的构建方法。
本发明的第四个目的在于提供一种所述的牛基因组假attP位点的应用。
本发明的假attP位点位于牛基因组的第4号染色体上，其核心序列具有如SEQ ID
NO.l所示的DNA序列；含所述假attP位点的旁侧序列具有如SEQ ID NO.2所示的DNA序列。
本发明的定向整合牛基因组假attP位点的载体，包括目的基因，假attP位点旁侧序列，attB位点核心序列。
其中，所述目的基因包括绿色荧光蛋白、人第九凝血因子、人血清白蛋白、人转铁蛋白。
本发明的定向整合牛基因组假attP位点的载体的构建方法，包括以下步骤
a、 构建含目的基因和attB位点的质粒载体；
b、 构建含假attP位点旁侧序列的质粒载体；
c、 将步骤b所得载体中含假attP位点核心序列的片段替换为含attB位点核心序列的片段，回收含attB位点核心序列的假attP位点旁侧序列的片段；
d、 将步骤c所回收的片段与含目的基因的载体连接。本发明的牛基因组假attP位点的应用，用于在牛细胞中整合目的基因。所述的整合目的基因的步骤包括将所述载体和含链霉菌噬菌体①C31整合酶基因的质粒按一定比例混合后转染牛细胞，然后筛选阳性克隆细胞株。利用本发明的假attP位点构建定向整合载体，将该载体与表达①C31整合酶的质粒 pCMV-INT共转染牛耳皮肤成纤维细胞(FC)，可将目的基因以较高的整合率整合于牛基 因组中，并且目的基因能得到较高水平地表达。本发明大大提高了目的基因的定向整合率， 极大地减少筛选工作，并且目的基因还能高效表达，使获得的转基因细胞能在较短时间内 用于下游的生产，如作为转基因克隆牛的供体细胞，促进目的基因的定向整合技术在转基 因牛制备中的进一步应用。
图1是半巢式反向PCR —扩产物电泳图泳道l一泳道6依次为退火温度51.4°C、 53.2°C、 55.7°C、 57.1°C、 59.6°C、 61.2。C的PCR扩增产物；泳道7为空白对照(水)；泳 道8为1KbDNAMarker。图2是半巢式反向PCR 二扩产物电泳图泳道1为1Kb DNA Marker,泳道2 — 6依 次为退火温度50.4"、 52.2°C、 54.7°C、 56.1°C、 58.6°C、 60.2'C的PCR扩增产物。图3是pEGFP-Nl-P4B载体的构建过程流程图。
具体实施方式
发明人在研究中发现在牛基因组中有一个能在。C31整合酶介导下与目的基因高频 率整合并高效表达的假attP位点(BF4),通过对BF4的旁侧序列进行扩增，进而将该片段 转入目的基因载体中attB序列两侧的方法，使目的基因高效定向整合于该位点，并能稳定 高效表达。以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。需要指出的是，本实施例仅用于 解释本发明而不是对本发明范围的限制。本发明的实施例中所用到的含目的基因绿色荧光蛋白(EGFP)和attB位点的质粒 pEGFP-Nl-attB、以及含链霉菌噬菌体①C31整合酶基因的质粒pCMVInt的构建参考申请 号为20051011476.3的中国发明专利申请。以下实施例中，所使用的限制性内切酶购自TakaRa公司；培养基购自吉诺生物公司； 抗体购自KPL公司。实验所用的牛耳皮肤成纤维细胞(FC)取自上海医学遗传研究所松江科研基地的奶牛。实施例l、细胞转染、筛选
转染的前一天，接种0.5-2X10S个牛耳皮肤成纤维细胞于25cr^细胞培养瓶中培养以保证在转染时候细胞的丰度达到90%-95%。转染包括如下步骤
(1) 在EP管中加入2)tig的pEGFP-Nl-attB及6pg的pCMV-INT质粒DNA，用500pl无血清的D/F12培养基稀释DNA，并轻轻混匀，室温下静置5分钟。
(2) 在另一个EP管中加入20^1 LipofectamineTM 2000 (invitrogen公司)，用50(^1无血清的D/F12培养基稀释，室温下静置5分钟。
(3) 将LipofectamineTM 2000稀释液和DNA的稀释液(总体积为1000pl)轻轻混匀并在室温下静置20分钟。
(4) 将lml的混合液加入待转染的细胞中，混匀，置37°C、 5%<:02条件下继续培养。
(5) 4-6小时后，对细胞进行换液，换成含10%胎牛血清的完全培养基。
(6) 转染24小时后将细胞以1: 10 (或更高的稀释度)稀释度转移到12孔板中。筛选l一2天后，换成选择培养基(300ng/pl G418+10。/。胎牛血清+D/F12培养基)
对细胞进行选择培养。选择培养持续2周之后，在显微镜下，可见到一个个独立的细胞克隆。
G418抗性细胞的扩增对在紫外灯下能发出绿色荧光的细胞克隆进行挑取。吸去培养液，用无钙镁的PBS洗1一2遍，并于显微镜下，在细胞克隆处加10—20W 0.25%的胰酶溶液，待细胞逐渐变圆时，用20pl的枪吸出，转移到12孔板中继续培养。
实施例2、牛基因组假attP位点的克隆
(1) 牛耳皮肤成纤维细胞基因组DNA的提取选取实施例1中GFP表达水平最高(绿色荧光最强)的细胞克隆，按常规方法抽提取牛耳皮肤成纤维细胞基因组DNA。
(2) 反向PCR模板的制备取步骤(1)的1吗牛耳皮肤成纤维细胞基因组DNA，用EcoRI、 BanHI、 BglII进行酶解。酶解体系10XBuffer(K)， 20nl; EcoRI， 5.5^1; BanHI，5.5pl; BglII, 6^1; DNA， 18^1; ddH20， 145^1。共200^1反应体积，37。C过夜。
分别对酶解产物进行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，最后用20plTE溶解后进行自连接，体系10xBuffer， 15^1;酶解产物，9^1; T4DNAligase(TaKaRa)，6pl; ddH20， 120pl，共150^1。16。C过夜。对连接产物进行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，TE溶解后即可作为模板DNA用于反向PCR(3)半巢式反向PCR (iPCR): 设计正向引物attB-Fl、 attB-F2位于attB核心序列的上游，EGFP为反向引物，位于 attB-Fl、 attB-F2上游。EGFP: TCG TCC ATG CCG AGA GTG ATG C attB-Fl: CTA GTA CTT CTC GAG GTC G attB-F2: ATG TAG GTC ACG GTC TCGPCR反应体系10xBuffer (Mg2plug)， dNTP mixture (各2.5mM), 4pl;引物EGFP (lOpmol), 1^1;引物attB-Fl (lOpmol)， l^il;模板DNAl^il; LATaqE (TaKaRa) (5U/nl), ddH20， 15.2^1;共25pl。PCR反应条件94°C预变性5min，进入循环；循环条件为94°C 45s， 50—60。C 45s， 72°C 5min， 31个循环；最后72°C延伸10min。将一扩PCR产物走电泳，电泳结果如图l所示。取上述退火温度为57.rC的产物1^1，用引物EGFP、 attB-F2进行二扩，反应体系及 扩增条件均同上，电泳结果如图2所示，其中1.8Kb处有条带。实施例3、假attP位点旁侧序列的测定和分析对假attP位点旁侧序列的分析，是通过将半巢式反向PCR扩增产物克隆进T载体后 进行测序，然后将测序结果进行两次比对，第一次是与NCBI网站公布的牛基因组序列进 行比对，第二次是与pEGFP-Nl-attB载体序列进行比对。如果扩出的序列经两次比对之后， 发现该序列含有一段pEGFP-Nl-attB序歹ij，并且在attB核心序列之后与pEGFP-Nl-attB序 列不一样，而是牛基因组的序列，则认为牛基因组中的该位点为假attP位点，具体测定和 分析步骤如下将实施例2所得半巢式反向PCR产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，并对片段用琼脂 糖凝胶DNA回收试剂盒(天根公司)进行回收，操作步骤同说明书。将回收片段与pMD19-T (TaKaRa)载体连接，体系PCR片段，3^1; T载体， ligation mix(TaKaRa),5nl; ddH20 1^1。共IOW。 16°C过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，经质粒抽提，电泳检测后，将较大质粒的克隆 送出测序。在NCBI网站上，将测序的结果首先与公布的牛基因组的序列进行比对(http://www. ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BtaBlast.html)，然后和pEGFP-Nl-attB载体序列进行比对，结果发现，目的基因EGFP质粒载体中attB的核心序列发生断裂，表明目的基因与牛基因组发生了位点特异性重组，在该细胞克隆中目的基因整合于牛基因组的4号染色体上，将其命名为BF4假attP位点，该假attP位点核心的序列约39bp，其序列如SEQ ID NO.l所示，与噬菌体attP位点的核心序列具有35%的同源性；包含该假attP核心位点的旁侧序列约4.7kb，其序列如SEQ ID N0.2所示。
进一步对该位点进行分析，发现该假attP位点在Gli蛋白家族3 (Hedgehog—Gli信号通路中的信号分子)基因的下游3'的UTR区，附近序列富含A-T碱基，与下游的一个功能未知的蛋白的基因相距17K多。
实施例4、 pEGFP-Nl-P4B载体的构建过程
从假attP位点两边旁侧序列扩增4.7kb的片段，经切除假attP的核心序列之后，连上attB G38bp)序列。将该片段与目的基因(绿色荧光蛋白，GFP)相连，构建携带有attB序列、BF4假attP位点的旁侧序列以及GFP基因的表达载体pEGFP-Nl-P4B载体，具体构建过程见图3。
第一步，pcDNA3.1-(-)-neo-Pl的构建
(1) 、假attP旁侧序列的PCR扩增
根据实施例3所得的位于牛4号染色体上的假attP位点的序列设计引物，用正常牛全
基因组作为模板，对假attP位点BF4的旁侧序列进行扩增。上下游引物的5'分别加上Mlul
和NheI酶切位点。
引物1: NFIX-1L: TCA ACG CGT CAC CTG CGA AGG AGC TTA AC引物2: NFIX-1R: TCA GCT AGC GTG CAG GAG GAG GAA GAC AGPCR反应体系10xBuffer， 2.5^1; dNTP mixture (各2.5mM)， 2pl;引物NFIX-1L(lOpmol)， 1^1;引物NFIX-1R (lOpmol) lfil;牛基因组DNA2pl (300ng); TaKaRaTaqE(5U尔1) 0.2nl; ddH20 16.3nl;共25pl。
PCR反应条件94°C预变性5min，进入循环；循环条件为94°C 45s， 57—67。C 45s,
72°C lm30s， 35个循环；最后72°C延伸10 min。 PCR产物走0.8%的琼脂糖凝胶电泳，
并对4.7kb片段进行回收。
(2) 将PCR的片段连入pMD19-T载体，连接体系PCR片段，3^1; T载体，1^1;ligation mix (TaKaRa)， 5^1; ddH20 1^1，共10^1， 16°C过夜。
(3) 连接产物转化大肠杆菌，挑斑，摇菌，并抽提质粒，将阳性质粒命名为TPl。(4) 载体酶切载体TP1及pcDNA3.1-(-)-neo (购自Invitrogen公司)分别用Mlul和NheI双酶切。先进行NheI酶切，体系载体，12pl; 10xBuffer， lOpl; Nhel， 2.5pl;ddH20， 75.5nl。共100W， 37°C， 2hr。乙醇沉淀，再用MluI酶切，体系载体，O[il; 10XBuffer, 5pl; Mlul， 1.5jil; ddH20， 43.5^1。共5(HU， 37°C, 2hr。酶切产物走0.8%的琼脂糖凝胶电泳，并分别对载体TP1及pcDNA3.1-(-)-neo的4.7k左右的片段进行回收。
(5) 将回收的片段进行连接，体系TP1的回收片段，12pl(0.6吗)；pcDNA3.1-(-)-neo4^1 (0.2吗)；10xBuffer， 2pl; T4DNA ligase (TaKaRa)， 1.5|al; ddH20 0.5pl。共10pl。16°C过夜。
(6) 连接产物转化大肠杆菌，挑斑，摇菌，并抽提质粒，经酶切鉴定后送出测序，将阳性质粒命名为pcDNA3.1-(-)-neo-Pl 。
第二步，pcDNA3.1-(-)-neo-PlB载体构建
(1) 载体酶切对pcDNA3.1-(-)-neo-Pl用Agel， PshAI双酶切，先进行AgeI酶切，体系载体，90nl (15吗);10xBuffer， 15^1; Agel (NEB)， 3^1; ddH20， 42^1。共150(^1，37°C， 2hr。乙醇沉淀，再用PshAI酶切，体系10XBuffer， 15|_d; PshAI， 3^1;载体DNA;ddH20， 132^1。共150nl， 37°C， 2hr。同时对pEGFP-Nl-attB进行Aflll酶切，体系载体，7pl(15吗);10xBuffer， 15— 100xBSA， 1.5^1; Aflll (NEB)， 3pl; ddH20， 123，。共150nl， 37°C， 2hr。分别对酶切产物进行乙醇沉淀。
(2) 对酶切片段补平体系10xT4po旧uffer， 5^1; 0.1%BSA， 5^1; dNTP， 5^1;酶切产物；ddH20， 33nl，总体积48pl。 70"C水浴，5 — 10min;在37"C水浴中加入T4Po1酶，2nl，温浴5—10min;振荡，使酶失活。对pEGFP-Nl-attB的AflII酶切产物走0.8%的琼脂糖凝胶电泳，并回收338bp的片段。对pcDNA3.1-(-)-neo-Pl的酶切产物进行酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后去磷酸化处理，体系10xCIAPBuffer， 5^1;碱性磷酸酶CIAP， 2^1;乙醇沉淀酶切后的载体DNA; ddH20, 43pl。总体积50^1。 37。C水浴，45min。之后走回收胶，对8633bp的片段进行回收。
(3) 将回收的片段进行连接，体系attB的回收片段，4nK212ng); pcDNA3.1-(-)-pl,2^1 (112ng); 10xBuffer， T4DNAligase (TaKaRa)， 1^1; ddH20， 2^1。共10pl。 16'C过夜。
(4) 连接产物转化大肠杆菌，挑斑，摇菌，并抽提质粒，经Pmad酶切鉴定后送出测序，将阳性质粒命名为pcDNA3.1-(-)-neo-PlB。第三步，pEGFP-Nl-P4B载体的构建
(1) 对pcDNA3.1-(-)-neo-PlB用Mlul，载体TP1及pcDNA3.1-(-)-neo分别用Mlul和Nhel双酶切。先进行NheI酶切，体系载体，20^1; 10xBuffer， 15^1; Nhel， 3^1; ddH20，120^1。共150pl， 37°C， 2hr。乙醇沉淀，再用MluI酶切，体系10XBuffer， 15^1; Mlul，3^1;载体；ddH20， 132ul。共150W， 37°C， 2hr。酶切产物进行乙醇沉淀；同时对pEGFP-Nl-attB进行AflII酶切，体系载体，7pl (15吗)；10xBuffer， 15^1; 100xBSA，1.5^1; AflII (NEB)， 3pl; ddH20， 123.5^1。共150^1， 37°C， 2hr。对酶切产物进行乙醇沉淀。
(2) 对酶切片段补平，体系10xT4polBuffer， 5^1; 0.1%BSA， 5^1; dNTP， 5|^1;酶切产物；ddH20， 33^1，总体积48pl。 70。C水浴，5—10min;在37。C水浴中加入T4Po1酶，2^1，温浴5 — 10min;振荡，使酶失活。对pcDNA3.1-(-)-neo-PlB的酶切产物走0.8%的琼脂糖凝胶电泳，并回收4207bp的片段。对pEGFP-Nl-attB的酶切产物经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后去磷酸化处理，体系10xCIAPBuffer， 5^1;碱性磷酸酶CIAP， 2^1;乙醇沉淀酶切后的载体DNA; ddH20， 43^1。总体积50pl。 37'C水浴，45min。之后走回收胶，对4733bp的片段进行回收。
(3) 将回收的片段进行连接，体系10xBuffer， l|il; P1B的回收片段，2pl (88ng);pEGFP-Nl， 4^1 (88ng); T4DNA ligase (TaKaRa)， ddH20， 2^1。共lOpl。 16。C过夜。
(4) 连接产物转化大肠杆菌，挑斑，摇菌，并抽提质粒，经BanHI酶切鉴定后送出测序，将阳性质粒命名为pEGFP-Nl-P4B。
容易理解，本领域的技术人员通过类似的分子生物学方法，利用载体中的多克隆位点可以将人第九凝血因子、人血清白蛋白、人转铁蛋白等目的基因构建到pEGFP-Nl-P4B表达载体中，进一步构建表达目的基因的载体。
实施例5、目的基因在牛基因组假attP位点(BF4)处整合的检测将载体pEGFP-Nl-P4B与表达①C31整合酶的质粒pCMV-INT共转染牛耳皮肤成纤维细胞(FC)，经克隆筛选，检测整合位点，同时以不加旁侧序列载体作为对照，分析其整合率，具体步骤如下
(1)按实施例1所述方法，将pEGFP-Nl-P4B与pCMV-INT (质量比10: 1)共转染牛耳皮肤成纤维细胞，经G418筛选获得各细胞克隆。(2) 按常规方法抽提各细胞克隆基因组DNA。
(3) PCR检测根据该假attP位点和载体上的attB序列设计引物5L: GCT GGA CGT GTA ACC CCT TA
5R: GGA TCA ACT ACC GCC ACC T
PCR反应体系:10xBuffer (Mg2plug)， 2 1; dNTP mixture (各2.5mM)， 2^1;引物5L(l(Himo1)， 1^1;引物5R (l(Himol)， lpl;模板DNA， 1^1; LATaqE (TaKaRa) (5U尔1)，0.3^1; ddH20， 16，。共25pl。
PCR反应条件94°C预变性5min，进入循环；循环条件为94°C 45sec， 65°C 45sec，72°C 30s， 32个循环；最后72'C延伸10 min。 PCR产物进行0.8%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增条带，302bp的条带为阳性，表明该细胞克隆中目的基因整合于BF4位点。
经检测发现转染GFP载体的细胞克隆中整合在BF4假attP位点的细胞克隆数占93%(55/59)，比不加旁侧序列载体的整合率(42/57， 74%)提高19%。
实施例6、双夹心ELISA法测定目的基因(GFP)的表达水平
样品的制备将实施例5中整合在假attP位点(BF4)的细胞用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒(碧云天生物公司)抽提蛋白，作为待测样品进行检测，具体步骤如下
1、 将鼠抗GFP抗体用0.2M碳酸盐缓冲液(PH 9.6) 1:4000稀释，酶标板中每孔加入120^d上述稀释的抗体，37°C， 2hr。倾去包被抗体，用含0.5%Tween20的PBS室温洗漆5次。
2、 每孔加入150^1含2XBSA的PBS， 4'C封闭过夜，倾去封闭液，洗漆4次。
3、 酶标板上每孔依次加入100plPBS (空白对照)、GFP浓度为100ng/ml、 50ng/ml、25 ng/ml、 12.5 ng/ml、 6.25 ng/ml、 3.13 ng/ml、 1.56ng/ml的标准品，以及待测的GFP样品。37'C温育2hr，倒去样品，洗涤5次。
4、 每孔中均加入100^1用含2%BSA的PBS 1: 32000稀释的生物素标记的羊抗GFP抗体，37'C温育2hr。倒去一抗，洗漆5次。
5、 每孔中均加入lOOjal用含2%BSA的PBS h 4000稀释的羊抗生物素HRP抗体(abeam公司，UK)， 37'C温育2hr。倒去二抗，洗涤5次。
6、 每孔中均加入100plTMB显色，待标准品显色梯度明显后加入lOOpl 1MH2S04,止反应。
7、 用酶标仪上测定每孔的OD值，读取数据。经过计算，结果显示整合在BF4位点的GFP基因的表达水平可高达280ng/ml左右。 结果表明目的基因依然能得到较高水平地表达，比整合于别的位点如位于IO号染色体上 的位点高四倍左右。
通过本发明的策略，大大提高了目的基因的定向整合率，极大地减少筛选工作，并且 目的基因还能高效表达，使获得的转基因细胞能在较短时间内用于下游的生产。序列表
<110>上海市儿童医院
〈120>牛基因组假attP位点及其应用
〈130> P5081034
〈160〉 2
〈170〉 Patentln version 3.3
〈210〉 1
〈211> 39
〈212〉 DNA
<213〉 Bos taurus
<220>
〈221〉 gene
<222> (1)..(39)
<400〉 1
aaggactctg aaaaacccta aagtattcta gggagaaac 39
〈210〉 2
〈211〉 4684
〈212〉 腿
〈213〉 Bos taurus
<220>
〈221〉 gene
<222> (1)..(4684)
<400〉 2
cacctgcgaa ggagcttaac tcatccaggg tccaccactg cagcctgcca cctgctcacc cattgcaggg caggggtggg tcaccgtgac ttggtttcgg gccccagaac ctgtgttgtc gtctctgcag gcacgcagcc cagtaccagc
agttgttact gctttgttta agccagggaa 60
caccccctta cttcatcact ggcccttcga 120
c卿ctggtc atggtttggt ttggtttggt 180
atcccgaggt aaacccgtgt ctcccacgct 240
tgcagtctgg gcgggcccat gcccctcctc 300ccg犯cag犯gcgacctgtc tggggtggac atcaccatgt tg犯catgct caaccggagg 360
gacagcagca ccagcaccgt cagctccgcc tacctgagca gccgccgctc ctctggcatc 420
tcgccctgct tctccagccg ccggtccagc g鄉cgtccc aggccgaggg gcgaccccag 480
aacgtgagcg tggccgactc ttacgacccc atctccaccg acgcctctcg caggtccagc 540
gaggccagcc agggcgscgg tctgcccagc ctgctcagcc tcactcccgc ccagcagtac 600
cgcctgaaag ccaagtacgc tgccgccacg ggcggccccc cgcccacccc gctgcccaac 660
atggagagga tgagcctcaa gacccggatg gccctgttgg g卿tggcag ggagccggcg 720
gggaccctgc ctcccgtgca tcctxctcgg agatgcagcg acggcggggc ccacggttac 780
agccggcgcc cactgctgcc ccaggstgcg ctgggc犯cg gcgtgagsag agccagcgac 840
ccggtgagga cggtttcgga gagcctctct ctgccccggg tacagcggtt c犯cagcctt 900
aacagcttca accctccggt gttgcctcca tccctggaaa agcgcaacct cgtgcttcag %0
aactacacgc ggcccgatgg gggccaggcc cgccacttcc actcctctcc ctgtcccccg 1020
agcatcactg agaatgtcac cctggagtcc ctgaccatgg acgccgacgt gagcctg犯c 1080
gatgaggacc tcctgcctga tgacgtggtg cagtatttaa attcccag犯cccagccggg 1140
tatgagcagc acttcccagg caccttctct gatgacagca aagtgcccca tggcttaggg 1200
agtggacccg gggactttga cccactgggg ctgcccgaca gccacgccag ccacaccggc 1260
agccagcagt accgcagcct ggagcagccc tgccccgatg ccagtaaatc cgacctgccc 1320
attcagtgga acgaagtcag ctccggcagc gcggacctgt cctcctccaa gctgaaatgt 1380
ggccagcggt ccatggggca gcaggcccgg gccttcgggt cgtacagcca catgggtgtt 1440
cacccacaga atccattgag gagtggggct ggcccagctg gggggtatcc gacccttggg 1500
gagcatgcca gctccttcgg gggcccggaa cacttagtga gccacggtgg cggagctggc 1560
accaatggga atgccttcca tgaaccaccc tataaggccc agcagtatgg gaactgcctc 1620
aac已ggcagc ctggtgcccc caccttactc gatggggcct gtggccctgg gatccaggcg 1680
gcaaagctga aaagcatcac catgcaaggg agcgggagcc atctggattt tggcctgtcg 1740
gtggtgccga atgagtcaac cggcagcacg gtgaatggca tacccacccc agaccccaca 1800ggacaggggt acctggctca gcagctcctc ggtgacagca cscacaccca gggggcaggc 賜0
cgctccgggc ag犯cctgct ggggcaggct agtgctacct cacacatcta tcaagggccg 1920
gagagcagcc tgcccgggcc tcccagcatc agcgtgcagc cgccaaacgt ggcagccgtc 1980
aggggctacc agccatgtgt tggctacggg ggcagccggc gccaggctgg gccgaggggt 2040
ggtctcgctc tgcagccagg acagtttagt gacccgagtc agacctgcag ggtg犯tggc 2100
atcaagatgg agatgccagg acagccccat cagctctgtt cg犯tgtgca gagttactct 2160
ggtcagttct atgaccaaac tgttggcttc ggtcagcaag acatgaaaac tggttccttc 2220
tccatgtcag aagccaBctg cctgctccag ggggccggcg ccgaaaactc tgaattactc 2280
tccccaggtg ctaaccaggt gacaagcaca gttgacagcc tcgacagcca tgacctggaa 2340
ggggtgcaga ttgatttcga cgctatcata gacgacgggg accacgccag cctgatgtca 2400
ggagccctga gcccaagcat tattcagaac ctttctcata gctcctcccg actcaccacg 2460
ccgcgagccg cccttccgtt cccgcctctg tctttgagca ccaccaacat ggcaatcggg 2520
gacatgagct ctctgctgac ctccctcgcg gaagaaagca aattccttgc ggttatgcag 2580
taagcattag gggaaaaaaa cgactgccaa gagacctgaa actttaggag tttaaaagat 2640
taaattgacc cttttttgtt tggctgagtt tttttagttc tgtatgtatt ttagcgatct 2700
catctcacct aactgggatg tgtttcaagt atattccttt tatggaaaag gactctgaaa 2760
aaccctaaag tsttctaggg agaaactgtc ttccatttca gttttgaatc sgtattgtta 2820
cactcaaaac atcctcttaa aaaaaaaaag aaaactgtaa gcctattcct ccctccccct 2880
tctttttttt agtaaaccgg tgtaaatggt gatgtgcgcg ttctttcttt tcagagagag 2940
ggcaagtgaa aggatttgac gtgtctctcc gttattccaa ggaactagga agttggtgtg 3000
cttgtgacta aggggttaca cgtccagcgt ttttccattt tcctttacat atgctcaatg 3060
tttgtttttg tgttttgttt cttttgtttt tgaattccca cactgggctc aggagtcgga 3120
agttgg聊g tgagtttggg犯tctcttgt gggtgtsctg tsgccgaggt犯c鄉cttt 3180
tgagaagctc ccaacccccg ttcagtttgg ggaatgcttc agacagatac acacaagtgg 3240
aaattcaggg ctcctgtgca gaggagatac aactttgccc acagttgggg gttaaaatcc 3300ttcctgtcca tacgtgtgct ggacaggaag atcgaccctg cctcccctct ctgtctgtcc c鄉g郷ag tgttgggcga cgcccacaca ggtagatatg ttataga tta aagctattgc atatgattag ttccatctct cgccccattt tatatctsgt tttgagtata taggtactta tattaattcc actatagcaa aagagtattt stgsa^tttg gttgt犯a3g aa朋gctcat 犯c8ttttC3 gt3ttta犯a sctctaaggg taacactcta ttacattatg cagccgttta taaggtggac tta^gctaga ctttcagatg actccccatg tgtacagttg ctacacataa gact已tccag cattttscct tta已aaagta gcagtcgaca tgttgtattc tgccccattc catgagtccg ttatgtgttt tttctccttt caaataaaag tatgagataa tggaatatta ctcttatttg gaccaagaat ctcacgtggg gggactUag ctg卿cagt tgggtUgct ggtcctcccg ctgttcccca tgtgcagcac tgg犯cag3g cccc犯3tc3 a犯gscaagc atcatctcttc agtgga犯犯tcgaggcctt gtcscagaat cggcagtcca attcgctgaB ggtcctggtc tgagctcgcc tgctcttgtg gcac
gtgggcacat ctatatgtca gttctcagtt 3360
鄉agtgttc agcgctgttc caggggg卿 3420
cactgttact tccatctgtt ctggtaagaa 3480
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tcat3gataa cagagt犯ct gagaattgat 3600
atcccacagc tggctatgtt atcaacaata 3660
ctattctaag tgccctattt taggggactc 3720
agaccaagat atttgg犯ta犯ttgcttca 3780
cacagtttca tagctgtgtg gatacattct 3840
agaagctaag tcttctatgc agtttgtcct 3900
aa犯ggttta aagactt犯a aagtgcagct 3960
犯gacatacc atgtgtgcac agggtatgtg 4020
tgtaaactat ga犯atac犯catcagcact 4080
atcttggagt tagatttatc caaagtgatt 4140
ctgccattta aattagtagt agaca犯aat 4200
ggaccagctc atttttctca ggtttatgtt 4260
gtaaaattcc cctctg犯tt ttagactttt 4320
ttcaactaga tgaBagC3ga ggggtattga 4380
cttcttttaa atcaaaggaa gcatcccctt 4440
agtgatctga gctagtagag ttgagtctct 4500
ttctgtattc ttcaaacggg tcatgatctg 4560
tctcgtctct aggtg犯ctc aaagtcccaa 4620
gcttaaccgc ctttctgtct tcctcctcct 4680
468权利要求
1、一个牛基因组中假attP位点，其特征在于，所述假attP位点位于牛基因组的第4号染色体上，其核心序列具有如SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
2、 如权利要求l所述的牛基因组假attP位点，其特征在于，含所述假attP位点的旁 侧序列具有如SEQ ID N0.2所示的DNA序列。
3、 一种定向整合牛基因组假attP位点的载体，其特征在于，所述载体包括目的基因， 假attP位点旁侧序列，attB位点核心序列。
4、 如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述目的基因包括绿色荧光蛋白、人第 九凝血因子、人血清白蛋白、人转铁蛋白。
5、 一种如权利要求3所述载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤-a、 构建含目的基因和attB位点的质粒载体；b、 构建含假attP位点旁侧序列的质粒载体；c、 将步骤b所得载体中含假attP位点核心序列的片段替换为含attB位点核心序列的 片段，回收含attB位点核心序列的假attP位点旁侧序列的片段；d、 将步骤c所回收的片段与含目的基因的载体连接。
6、 如权利要求1所述牛基因组假attP位点的应用，其特征在于，用于在牛细胞中整 合目的基因。
7、 如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述在牛细胞中整合目的基因的步骤包 括将权利要求3所述载体和含链霉菌噬菌体①C31整合酶基因的质粒按一定比例混合后 转染牛细胞，然后筛选阳性克隆细胞株。
8、 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤中权利要求3所述载体和含链 霉菌噬菌体OC31整合酶基因的质粒的质量比为10: 1。
9、 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤采用脂质体介导的细胞转染法。
10、 如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述牛细胞为牛耳皮肤成纤维细胞。
全文摘要
本发明公开了一个新的牛基因组中链霉菌噬菌体ΦC31整合酶可识别的假attP位点，本发明还提供一种利用该假attP位点的旁侧序列构建的定向整合载体及其构建方法。本发明首先从牛基因组中分离了一个能被高频率整合并高效表达外源基因的假attP位点，该位点位于牛4号染色体。在此基础上，构建含有该假attP位点旁侧序列的特异定向整合载体，使外源基因以90％以上的概率整合于该假attP位点上，并且外源目的基因也能获得高效表达。
文档编号C12N15/11GK101624592SQ20081004047
公开日2010年1月13日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者曾溢滔, 欧海龙, 英 黄, 黄淑帧 申请人:上海市儿童医院;上海滔滔转基因工程股份有限公司