专利名称：一种播散肝癌细胞的分离和鉴定方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种播散肝癌细胞的分离和鉴定方法。
背景技术：
肿瘤转移是一个多阶段、多步骤的复杂过程。存在于原发瘤和转移瘤之外的肿瘤细胞统 称为播散肿瘤细月包(Disseminated tumor cell, DTC)，亦称游离肿瘤细胞(Isolated tumor cell, ITC)，包括淋巴结、骨髓和血液等组织中的单个或小簇肿瘤细胞。其中进入血流的又 称循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell, CTC)。
原发性肝细胞癌是我国最常见、多发的恶性肿瘤之一。尽管近年来治疗手段不断增加， 但并没有从根本上改变肝癌高死亡率的状况。究其原因，转移复发率高是影响肝癌远期疗效 的主要因素。肝癌细胞可以在很早期播散，大多通过血液和淋巴系统转移，甚至播散到胸水， 腹水等体液中。因此，播散肝癌细胞检测可以作为肝癌早期诊断的一个标记物、作为肝癌细 胞隐匿播散的一个确凿证据以及作为监测疗效和预测复发的一个独立指标。
以往通常采用RT-PCR检测白蛋白和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)mRNA来检测血 循环中肝癌细胞，但RT-PCR法有其固有局限，如特异性不高、操作复杂、不能估算样本中肿 瘤细胞的数目等。此外，更不可忽视的是，RT-PCR法须破坏细胞形态，不能对单个肿瘤细胞 进行观察、分析和计数，而这些数据可提供CTC恶性程度和侵袭性方面的信息。故创建行之 有效的播散肝癌细胞分离/检测系统，直接对分离到的播散肝癌细胞进行鉴定、分析和计数， 对于进一步提高肝癌的诊断水平乃至治疗效果无疑具有重要意义。
目前常用的播散肿瘤细胞分离方法是利用单克隆抗体识别带有特异表面标记的肿瘤细 胞.包括流式细胞仪和免疫磁珠细胞分选技术。前者仪器昂贵，费用很高，技术复杂，经常 会被所分选细胞的容量、活性、无菌度等问题所困扰，并且也不能提供有关细胞形态学方面 的信息。后者只要是具有特异性表面标记的细胞，不论其含量高低均可以得到分离或富集， 不仅细胞处理量大(可达109以上)，分离纯度高(可达95%-99.9%)，而且易于获得无菌的 细胞制剂。目前这一技术在肿瘤学研究上更多的是利用上皮细胞单克隆抗体来富集外周血上 皮细胞，进而应用RT-PCR等分子生物学方法或流式细胞术鉴定上皮类肿瘤细胞。遗撼的是， 由于缺乏相应的肝癌细胞表面抗体，迄今鲜见上述两种方法用于分选播散肝癌细胞。虽然从理论上讲上皮细胞抗体磁珠也可被用来分选属于上皮类的肝癌细胞，但是这些抗体通常只能 识别部分肝癌细胞。比如上皮细胞抗体Ber-EP4单抗只能识别约67%的肝癌细胞(Latza U et al. Be:r-EP4: new monoclonal antibody which distinguishes epithelia from 腦othelial [J]. J Clin Pathol, 1990, 43(3) :213-9,)。
Ashwell和Morell于20世纪60年代发现，哺乳动物的肝实质细胞膜表面存在一种肝结 合蛋白——去唾液酸糖蛋白受体(asialoglyc叩rotein rec印tor， ASGPR)，又称半乳糖受体 (Morell AG et al. Physical and chemical studies on ceruloplasmin, V. Metabolic studies on sialic acid-free ceruloplasmin in vivo [J]. J Biol Chem' 1968， 243(1) :155-159.) 。 ASGPR是一种跨膜蛋白，其胞外区含有糖识别区(carbohydrate recognition domain, CRD)，能专一性识别和结合以半乳糖残基和N-乙酰半乳糖胺残基为 端基的糖蛋白(配体)。ASGPR主要表达于哺乳动物肝卖状隙的肝实质细胞表面，密度很高， 每个肝细胞表面可多达500， 000个受体。这一特性已被用于设计多种实验研究，比如，利用 放射性核素标记这样的糖蛋白进行肝显像；而以这样的糖蛋白为载体介导基因或药物导向肝 实质细胞，则是肝靶向治疗领域的一个研究命题。但至今未有基于ASGPR来分离播散肝癌细 胞的报道。
因此，本领域迫切需要开发出敏感、特异、高效和简便的播散肝癌细胞分离方法和检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种肝癌细胞的分离和鉴定方法，以及本发明方法所分离到的肝癌细胞。
发明人利用ASGPR配体或针对ASGPR胞外区的单克隆抗体，创建了基于ASGPR的免疫磁 珠分离播散肝癌细胞的技术，从而解决由于缺乏肝癌细胞表面单克隆抗体所面临的困扰。由 于正常肝细胞不会进入血循环或体液中，只有肝癌细胞才有可能，因此按照本发明方法分离 得到的细胞就是肝癌细胞。然后采用针对上皮组织来源肿瘤细胞的抗体CK3-6H5进行免疫细 胞化学检测或者采用流式细胞仪检测分离到的播散肝癌细胞。
本发明的第一方面提供了一种肝癌细胞的分离方法，所述分离方法包括下述步骤-
(a) 采集样品；
(b) 从样品中分离单个核细胞；
(c) 以与ASGPR特异结合的物质A与单个核细胞中表达ASGPR的细胞结合，所述物质A与磁珠间接连接，形成复合物B;
(d)磁性分离步骤(c)中的复合物B。 上述物质A选自ASGPR的配体或抗体。
上述ASGPR的配体为可与ASGPR的糖识别区(CRD)特异结合的蛋白、糖、多肽或核酸。 上述与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为以半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基为端基的糖蛋白， 优选去唾液酸胎球蛋白。
上述ASGPR的抗体为针对ASGPR胞外区的抗体。上述抗体为单克隆抗体。在实施例中， 所述抗体为小鼠抗人ASGPR单抗、兔抗人ASGPR单抗或大鼠抗人ASGPR单抗。
上述肝癌细胞的分离方法，所述样品选自骨髓、血液或其他体液。其他体液为淋巴液、 胸水或腹水等。
上述步骤(b)中采取的分离方法为密度梯度细胞分离法。上述密度梯度细胞分离法所 采用的密度梯度液为Ficoll或Percoll。
上述物质A为ASGPR的配体，上述步骤(c)的具体歩骤为
(f) 先以ASGPR的配体-生物素与单个核细胞中的肝癌细胞结合形成复合物1;
(g) 再以C-磁珠与复合物1结合，形成复合物Bl;
所述C为与生物素特异结合的物质。 上述C为生物素抗体或链霉亲和素。
上述步骤(f)中去唾液酸胎球蛋白的反应浓度为0. 1-0.8mg/ml，较佳的去唾液酸胎球 蛋白的反应浓度为0. 4-0. 8mg/ml ，优选0. 4mg/ml 。
上述物质A为ASGPR抗体，上述步骤(c)的另一具体步骤为
(h) 先以ASGPR抗体与单个核细胞中的肝癌细胞结合形成复合物3; (I)再以二抗-磁珠与复合物3结合，形成复合物B3。
上述抗体为ASGPR单抗；上述步骤(h)中ASGPR单抗的浓度为0. 1-5. On g/ml，较佳的 ASGPR单抗浓度为2. 0-4. 0 u g/ml ，优选2. 0 u g/ml 。
上述ASGPR单抗为小鼠抗人ASGPR单抗、兔抗人ASGPR单抗或大鼠抗人ASGPR单抗。
本发明的第二方面提供一种上述分离方法分离到的肝癌细胞。所分离到的肝癌细胞完整 无破坏。所述肝癌细胞可以用于形态学观察、免疫细胞化学染色，从而进行计数；并可用于 培养扩增以及进一步的分子生物学研究。
本发明的第三方面提供了一种肝癌细胞的鉴定方法，所述鉴定方法为在上述分离方法后增加步骤(e)，检测鉴定肝癌细胞是否存在。
上述步骤(e)中可以采用免疫细胞化学法或者流式细胞仪检测鉴定。 免疫细胞化学法是一个成熟的技术。将磁性分离获得的细胞，通过细胞离心涂片机或手 工制成细胞涂片，然后进行免疫细胞化学染色，即可在一张细胞涂片上进行肝癌细胞的检测 和计数。所采用的一抗可为针对上皮组织来源肿瘤细胞的抗体、针对肝癌细胞的抗体或针对 肝细胞的抗体。上述抗体包括但不限于针对上皮组织来源肿瘤细胞的抗体如CK3-6H5;针 对肝癌细胞的抗体如AFP抗体；或针对肝细胞的抗体如Hep par 1抗体或白蛋白抗体等都可 以用于鉴定肝癌细胞。
对于流式细胞仪检测鉴定，若采用ASGPR抗体，其工作浓度为0. l-5.0ng/ml。较佳的 工作浓度为2. 0-4. On g /ml，优选2.0itg /ml。若采用去唾液酸胎球蛋白，其工作浓度为 0. 1-0. 8mg/ml 。较佳的工作浓度为0. 4-0. 8mg/ml ，优选0. 4mg/ml 。
在流式细胞仪检测中，根据荧光标记抗体的情况不同，我们将荧光染色法分为直接荧光 染色法和间接荧光染色法，然而直接荧光标记法虽然简单快速，引入的非特异性结合千扰少， 但是需要有相对应的荧光直接标记抗体，不仅价格较贵，而且在抗体的来源和使用上也受到 极大限制。荧光标记的ASGPR配体和ASGPR抗体并无现成的商品，标记起来也比较复杂。因 此，本发明实施例中采用间接荧光染色法。
采用本发明的分离方法和鉴定方法，敏感性高，特异性强，操作简便。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1.氨基生物素试剂Sulfo-NHS-lC-Biotin与蛋白质的反应原理。 图2.不同浓度的生物素化去唾液酸胎球蛋白标记H印3B细胞的流式图。 A、 B、 C中，生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度依次为0. 2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.8mg/ml。 D 中，生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度为0. 4mg/ml。
图3.不同浓度的小鼠抗人ASGPR单抗标记Hep3B细胞的流式图。
A、 B、 C中，小鼠抗人ASGPR单抗浓度依次为1.0ug/ml、 2. Oug/ml、 4. Owg/ml。 D中， 小鼠抗人ASGPR单抗浓度为2. 0 u g/ml 。
图4.利用生物素化去唾液酸胎球蛋白从肝癌患者外周血中分离到的播散肝癌细胞 (CK3-6H5， DAB染色)(X200)。
图5.利用ASGPR单抗从肝癌患者外周血中分离到的播散肝癌细胞(CK3-6H5， DAB染色)(X200)。
具体实施例方式
本文所述二抗，即第二抗体，是相对第一抗体而言的。在本发明中，ASGPR为抗原，ASGPR 抗体为第一抗体，针对ASGPR抗体的抗体是二抗。
本发明所述其他体液为除血液外的常规体液，包括但不限于淋巴液、胸水、腹水。
所述"反应浓度"为步骤(f)或步骤(h)中与肝癌细胞上的ASGPR结合时，ASGPR的配体 或者抗体的初始浓度，在具体实施例中，为去唾液酸胎球蛋白的初始浓度或小鼠抗人ASGPR 单抗的初始浓度。在本发明中，分别通过在分离到的单核细胞中加入无血清DMEM培养液或 PBS洗液来调节ASGPR的配体或抗体的初始浓度。
本发明所述"多肽"是指由3-50个氨基酸通过酰胺键(也称肽键)相互连接而成的化合 物。氨基酸数目在50个以上的多肽称为蛋白质。
本发明所述"糖"包括多糖和单糖。单糖如半乳糖或N-乙酰半乳糖等，均可以作为配体 与肝癌细胞上的ASGPR结合。
本发明所述步骤(b)中从样品中分离单个核细胞的方法有多种方法。如可以采用Ficoll
或Percoll等密度梯度液分离单个核细胞，也可以采用红细胞裂解液裂解样品中的红细胞，
再离心获得单个核细胞。
本发明所述"磁珠间接连接"指，生物素化的ASGPR的配体或ASGPR的抗体先与目的细
胞(即肝癌细胞)上的ASGPR结合，然后用链霉亲和素-磁珠或二抗-磁珠与ASGPR的抗体或
生物素化的ASGPR的配体结合。因此复合物B的结构为目的细胞-ASGPR的配体-生物素-C-
磁珠(复合物B1)或目的细胞-ASGPR的抗体-二抗-磁珠(复合物B3)。上述C选自生物素抗
体或链霉亲和素。当然本发明也可以采取其他磁性颗粒。生物素与ASGPR的配体以共价键连接。
本发明所述荧光素选自异硫氰酸荧光素(FITC)、四乙基罗达明、四甲基异硫氰酸罗达 明或藻红蛋白(PE)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重 量计算。实施例l生物素化去唾液酸胎球蛋白的制备
主要材料氨基生物素化试剂Sulfo-NHS-lC-Biotin (Pierce)，去唾液酸胎球蛋白 (Sigma) ， BCA蛋白定量试剂盒(Pierce) ， L-赖氨酸(国药)，离心超滤管(截留分子量 50， 000) (Millipore)。
实验步骤去唾液酸胎球蛋白与氨基生物素化试剂反应按照产品说明书进行。氨基生物 素化试剂Sulfo-NHS-lC-Biotin能选择性地与蛋白质中的游离氨基发生反应，反应式如图1 所示。
反应结束后，将反应液移入离心超滤管，25°C， 4000g，离心20min。然后在离心管中加 入双蒸水和L-赖氨酸，使总体积为3ml， L-赖氨酸终浓度为0. 08mg/ml，室温放置lh。再将 离心超滤管于25°C， 4000g，离心20min。吸出超滤管中残留液体，加适量双蒸水稀释。用 BCA蛋白定量试剂盒按照说明书操作，测定生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度。最后用双蒸水 调整去唾液酸胎球蛋白浓度为3mg/ml， 0.22um滤器无菌过滤后50ul/管分装，-20'C保存。
实施例2确定ASGPR配体和抗体的理想流式工作浓度
1.以下实验用流式细胞仪验证生物素化去唾液酸胎球蛋白与ASGPR的反应性，及确定生 物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作浓度。
主要材料PE标记的小鼠抗人CD45单抗(IgGl)、 PE标记的小鼠同型单抗(IgGl) 、 FITC 标记的链霉亲和素，均购自晶美公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自制。PBS洗液 (PBS+1%FBS)，自配。
实验步骤
1) 计数500万个H印3B肝癌细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)，20'C， 300g，离心5min,弃上清，用550 U 1无血清DMEM培养液重悬，充分混匀，100pl/管，分装 入5个EP管，依次编为1 5号。l号管为空白对照管，2号管为同型对照管，3 5号管为 测试管。
2) 向3 5号管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3 5号管生物素化去唾液酸胎 球蛋白的终浓度依次为O. 2mg/ml、 0.4mg/ml、 0.8mg/ml'终体积均为150ul (体积不足部分 用无血清DMEM培养液补充)。向1、 2号管中各加入无血清DMEM培养液50u 1。 1~5号管 37。C孵育lh。
3) 向1 5号管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。4) 向1 5号管中各加入100 u 1无血清DMEM培养液。向2 5号管中各加入10 u 1 FITC 标记的链霉亲和素。向l号管中加入10y l无血清DMEM培养液。l 5号管室温避光孵育20min。
5) 向1 5号管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。 每管500nl PBS洗液重悬。
6) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果
图2中，A、 B、 C所对应的生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度依次为O. 2mg/ml、 0.4mg/ml、
0. 8mg/ml。从图中可以看出，当生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度从0. 2mg/ml增加到0. 4mg/ml 时，H印3B细胞荧光强度也相应增加；而当浓度继续增加到0.8mg/ml时，H印3B细胞荧光强 度与浓度为0. 4mg/ml时相比并未增加。可见，生物素化去唾液酸胎球蛋白与ASGPR的反应性 好，当生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度为0. 4mg/ml时，H印3B细胞表面的ASGPR即已饱和； 而当浓度为0.8mg/ml时，生物素化去唾液酸胎球蛋白是过量的。故选择0.4mg/ml作为生物 素化去唾液酸胎球蛋白的候选流式工作浓度。
以下实验进一步评价0. 4mg/ml是否为生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作浓度。 实验步骤
1) 计数250万个HL-60细胞(中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)和100万个 H印3B肝癌细胞，混合后2(TC， 300g，离心5min，弃上清，用350 u 1无血清DMEM培养液重 悬，充分混匀，100ul/管，分装入3个EP管，依次编为1 3号。l号管为空白对照管，2号 管为同型对照管，3号管为测试管。
2) 向3号管中加入生物素化去唾液酸胎球蛋白，使得3号管生物素化去唾液酸胎球蛋白 的终浓度为0.4mg/ml,终体积均为150 ixl (体积不足部分用无血清DMEM培养液补充)。向
1、 2号管中各加入无血清DMEM培养液50u 1 。 1 3号管37。C孵育lh。
3) 向1 3号管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。
4) 向1 3号管中各加入100ul无血清DMEM培养液。向3号管中各加入10 u 1 PE标记 的小鼠抗人CD45单抗和10 u 1 FITC标记的链霉亲和素。向2号管中加入10ul PE标记的小 鼠同型单抗和10 u 1 FITC标记的链霉亲和素。向1号管中加入20ul无血清DMEM培养液。1 3号管室温避光孵育20min。
5) 向1 3号管中各加入lml PBS洗液'20'C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。 每管500ul PBS洗液重悬。
6) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。结果-
图2 (D)中，橫坐标为ASGPR-FITC，纵坐标为CD45-PE。 CD45-ASGPR+定义为H印3B细胞， CD45+ASGPR—定义为HL-60细胞，CD45+ASGPR+定义为非特异性染色细胞。从图中可以看出，当 生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度为0. 4mg/ml时，H印3B细胞被充分标记，且无非特异性染色。 可见，0.4mg/ml为生物素化去唾液酸胎球蛋白的理想流式工作浓度。
2、流式细胞仪验证小鼠抗人ASGPR单抗与ASGPR胞外域的反应性，及确定小鼠抗人ASGPR 单抗的理想流式工作浓度。
主要材料小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，为法国Dendritics公司产品。小鼠同型单抗 (IgGl) 、 FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体、PE标记的大鼠抗人CD45单抗(IgG2a)、 PE标 记的大鼠同型单抗(IgG2a)，均购自晶美公司。PBS洗液(PBS+1%FBS)，自配。FACSAria 流式细胞仪，为Becton Dickinson公司产品。
实验步骤-
1) 计数500万个H印3B肝癌细胞，20°C， 300g，离心5min，弃上清，用550 u 1 PBS洗 液重悬，充分混匀，100y 1/管，分装入5个EP管，依次编为1 5号。l号管为空白对照管， 2号管为同型对照管，3 5号管为测试管。
2) 向3 5号管中加入小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，使得3 5号管小鼠抗人ASGPR单抗 的终浓度依次为1.0ug/ml、 2.0ug/ml、 4.0ug/ml，终体积均为110ul。向1号管中加入 PBS洗液10u 1，向2号管中加入lOu 1小鼠同型单抗(IgG1)。1 5号管室温避光孵育20min。
3) 向1 5号管中各加入lml PBS洗液，2(TC， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。
4) 向1 5号管中各加入10CUi1 PBS洗液。向2 5号管中各加入10ul FITC标记的大 鼠抗小鼠IgGl。向l号管中加入10ul PBS洗液。1 5号管室温避光孵育20min。
5) 向1 5号管中各加入lml PBS洗液，20'C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。 每管500ul PBS洗液重悬。
6) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果
图3中，A、 B、 C所对应的小鼠抗人ASGPR单抗浓度依次为1.0ug/ml、 2. Oug/ml、 4.0 Ug/ml。从图中可以看出，当小鼠抗人ASGPR单抗浓度为2. 0ug/ml和4. Owg/ml时，H印3B 细胞荧光强度也相应增加；而当浓度继续增加到4.0ug/ml时，H印3B细胞荧光强度与浓度 为2.0ng/ml时相比并未增加。可见，小鼠抗人ASGPR单抗与ASGPR的反应性好，当小鼠抗人ASGPR单抗浓度为2. 0 u g/ml时，H印3B细胞表面的ASGPR即已饱和；而当浓度为4. 0 u g/ml 时，小鼠抗人ASGPR单抗是过量的。故选择2.0ug/ml作为小鼠抗人ASGPR单抗的候选流式
工作浓度。
以下实验进一步评价2. 0 u g/ml是否为小鼠抗人ASGPR单抗的理想流式工作浓度。 实验步骤
1) 计数250万个HL-60细胞和100万个H印3B肝癌细胞，混合后20'C， 300g，离心5min， 弃上清，用350ulPBS洗液重悬，充分混匀，100yl/管，分装入3个EP管，依次编为1 3 号。l号管为空白对照管，2号管为同型对照管，3号管为测试管。
2) 向3号管中加入小鼠抗人ASGPR单抗，使终浓度为2. Ong/ml，终体积为110ul。向 1号管中加入PBS洗液10n 1，向2号管中加入10n 1小鼠同型单抗(IgGl) 。 1 3号管室 温避光孵育20min。
3) 向1 3号管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。
4) 向1 3号管中各加入100u 1PBS洗液。向3号管中各加入10ulPE标记的小鼠抗人 CD45单抗(IgG2a)禾卩10ul FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体。向2号管中加入10ul PE 标记的大鼠同型单抗(IgG2a)和10u 1 FITC标记的大鼠抗小鼠IgGl抗体。向1号管中加入 20ulPBS洗液。1 3号管室温避光孵育20min。
5) 向1 3号管中各加入lml PBS洗液，20°C， 300g，离心5min，弃上清。重复1次。 每管500y 1 PBS洗液重悬。
6) FACSAria流式细胞仪及CellQuest软件检测分析。 结果
图3 (D)中，横坐标为ASGPR-FITC，纵坐标为CD45-PE。 CD45-ASGPR+定义为H印3B细胞， CD45+ASGPR—定义为HL-60细胞，CD45+ASGPR+定义为非特异性染色细胞。从图中可以看出，当 生物素化去唾液酸胎球蛋白浓度为2. Oug/ml时，H印3B细胞被充分标记，且无非特异性染 色。可见，2.0ug/ml是小鼠抗人ASGPR单抗的理想流式工作浓度。
实施例3利用ASGPR配体分离和鉴定播散肝癌细胞
主要材料5ml肝癌患者志愿者的外周血，肝素抗凝。Ficoll-Paque Plus,购自GE Healthcare。磁性分离器、抗生物素磁珠、MS磁性分选柱、30 n m滤网、CK3-6H5抗体(上 皮组织来源的肿瘤细胞标志物抗体)均购自德国Miltenyi公司。Labofuge②400R台式离心机 (带细胞离心涂片附件)，购自德国Heraeus公司。多聚赖氨酸玻片，购自福建迈新公司。PV9000 二步法免疫组化试剂盒，购自美国GBI公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自制。PBS 洗液(含O. 5%BSA、 80UAil肝素)，自配。试剂1: PBS洗液(含0. 5%BSA、 80U/ml肝素)试剂2:无血清DMEM培养液试剂3:生物素化去唾液酸胎球蛋白，3mg/ml试剂4:抗生物素磁珠步骤(A) Ficoll分离外周血单个核细胞1) 将5ml肝素抗凝血、0. 2ml肝素、5ml试剂1于50ml离心管中混匀，平铺于7ml Ficoll 上，18°C， 600g，离心25min。2) 吸弃上层血清。3) 吸取单个核细胞层，置于15ml离心管中。4) 加3倍体积试剂1， 18'C， 300g，离心10min。5) 吸弃上清，8ml试剂l重悬，18°C， 300g，离心10min。6) 彻底吸弃上清。(B) 磁珠分离播散肝癌细胞1) 力口 130y 1试齐U2。2) 力口20uli式齐U3，混匀。3) 37°C，孵育lh。4) 加5ml试剂l， 18。C, 300g，离心10min，吸弃上清。5) 重复上一步。6) 力口80u 1试齐U 1。7) 力口20u 1试齐IJ4，混匀。8) 4°C，孵育15min。9) 加5ml试剂l， 18°C， 300g，离心10min。10) 吸弃上清，500ul试剂l重悬(注意尽量不要产生气泡)。11) 安装MS磁性分选柱和滤网。12) 500 u 1试剂1加入滤网。13) 待分选柱下方液滴刚刚停止，即向滤网加入500u 1细胞悬液。14) 加500 u 1试剂1于15ml离心管中，洗涤残留细胞。15) 待分选柱上方液体快流完时，加入500ul细胞悬液。16) 待分选柱上方液体快流完时，加入500ul试剂l。17) 重复上一步2次。18) 待分选柱下方液滴刚刚停止，将分选柱移出磁场，置于另一个无菌的15ml离心管上。19) 加lml试剂1于分选柱中，立即用活塞将液体快速推入离心管中。20) 重复上一步。21) 18°C， 300g，离心10min。22) 吸弃上清，100ul试剂l重悬。(C)播散肝癌细胞的免疫细胞化学鉴定。 步骤1) 用离心涂片机将细胞涂片于多聚赖氨酸玻片上。2) 将玻片置于烤箱中，48°C。3) 待完全干燥后取出。4) 凉至室温后，滴加lml固定液(95%乙醇)，置于湿盒中，15min 。5) 自来水冲洗数秒后浸泡于PBS中，2min。6) 甩去PBS，用吸水纸吸去细胞周围水分。7) 免疫组化油笔画圈(距离细胞区域边缘约O. 5mm)。8) 滴加l滴Triton X-100,湿盒中常温孵育10min。9) PBS洗，2min。10) 甩去PBS，滴加1滴3XHA，湿盒中常温孵育10min。11) PBS洗，2minX3次。12) 加50nl l:50—抗(CK3-6H5)，湿盒中常温孵育lh。13) PBS洗，2minX3次。14) 滴加1滴PV卯00试剂1，湿盒中常温孵育20min。15) PBS洗，2minX3次。16) 滴加1滴PV9000试剂2，湿盒中常温孵育20min。17) PBS洗，2minX3次。18) 力Q70ti1 DAB显色液，显色3 8min，镜下观察显色情况。19) PBS冲洗，终止反应。 结果从肝癌患者外周血中分离到19个播散肝癌细胞。免疫细胞化学染色结果见图4(CK3-6H5， MB染色)(X200) 。 A、 B、 C所示视野中分别有l个、2个、1个较大的、胞浆呈棕黄色(图 中为深灰)的细胞，即肝癌细胞。实施例4生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗体磁珠与Ber-EP4抗体磁珠的回收率比较主要材料健康志愿者静脉血，采用真空肝素抗凝管采血。H印3B肝癌细胞系，用含10%FBS (GIBCO)的DMEM培养液(GIBC0)培养。磁性分离器、Ber-EP4抗体磁珠、抗生物素磁珠、 MS磁性分选柱、30ym滤网、CK3-6H5抗体(上皮组织来源的肿瘤细胞标志物抗体)均购自 德国Miltenyi公司。Labofuge 400R台式离心机(带细胞离心涂片附件)，购自德国Heraeus 公司。多聚赖氨酸玻片，购自福建迈新公司。PV9000 二步法免疫组化试剂盒，购自美国GBI 公司。生物素化去唾液酸胎球蛋白，自制。PBS洗液(含0.5MBSA、 80U/ml肝素)，自配。实验方法将10 40个H印3B肝癌细胞掺入5ml肝素抗凝的健康志愿者静脉血样本中。 按照实施例3的方法分离单个核细胞。生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗体磁珠组分离 H印3B细胞步骤同实施例3。 Ber-EP4抗体磁珠组分离H印3B细胞步骤按照说明书进行。离心 涂片、免疫细胞化学鉴定步骤同实施例3。实验重复4次。回收率用均数土标准差表示。健康志愿者的静脉血中掺入不同数目(10 40)的H印3B细胞，经Ficoll分离单个核细 胞后，分别用生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗体磁珠和Ber-EP4抗体磁珠分离回收 H印3B细胞，生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗体磁珠的回收率(82. 6 0显著高于Ber-EP4 抗体磁珠的回收率(48.9%)(代0.Q5)(见表l)。表l.不同磁珠从播散肝癌细胞实验模型中分离所掺入的H印3B肝癌细胞细胞株磁珠掺入的细胞数回收率(％)H印3B生物素化去唾液 酸胎球蛋白/生物 素抗体磁珠10/20/30/4082. 6±6. 7H印3BBer-EP4抗体磁珠10/20/30/4048. 9±5. 6实施例5利用针对ASGPR胞外区的单克隆抗体分离和鉴定播散肝癌细胞 主要材料5ml肝癌患者志愿者的外周血，EDTA抗凝。Ficoll-Paque Plus,购自GE Healthcare。小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，购自法国Dendritics公司。磁性分离器、大鼠抗小鼠IgGl抗体磁珠、MS磁性分选柱、30um滤网、CK3-6H5 (针对上皮组织来源肿瘤细胞的 抗体)均购自德国Miltenyi公司。LabofUge 400R台式离心机(带细胞离心涂片附件)，购 自德国Heraeus公司。多聚赖氨酸玻片，购自福建迈新公司。PV9000 二步法免疫组化试剂盒， 购自美国GBI公司。PBS洗液(含2mM EDTA和0. 5%BSA),自配。 步骤(A) Ficoll分离外周血单个核细胞 具体操作步骤同实施例3 Ficoll分离外周血单个核细胞部分。(B) 磁珠分离播散肝癌细胞1) 130ul PBS洗液重悬细胞。2) 加20u 1小鼠抗人ASGPR单抗，混匀。3) 室温孵育20min。4) 加5ml PBS洗液，18°C， 300g，离心10min，吸弃上清。5) 重复上一步。6) 力口80u 1 PBS洗液。7) 加20ul大鼠抗小鼠IgGl抗体磁珠，混匀。8) -22)步同实施例3相应部分。(C) 播散肝癌细胞的免疫细胞化学鉴定 操作步骤同实施例3相应部分。结果从肝癌患者外周血中分离到13个播散肝癌细胞。免疫细胞化学染色结果见图5(CK3-6H5， DAB染色)(X200) 。 A、 B所示视野中各有l个较大的、胞浆呈棕黄色(图中为深灰)的细 胞，即肝癌细胞。实施例6抗ASGPR单抗/二抗磁珠与Ber-EP4抗体磁珠的回收率比较主要材料健康志愿者静脉血，采用真空EDTA抗凝管采血。H印3B肝癌细胞系，用含10%FBS (GIBC0)的DMEM培养液(GIBC0)培养。小鼠抗人ASGPR单抗(IgGl)，购自法国Dendritics 公司。磁性分离器、Ber-EP4抗体磁珠、大鼠抗小鼠IgGl抗体磁珠、MS磁性分选柱、30 y m 滤网、CK3-6H5 (针对上皮组织来源肿瘤细胞的抗体)均购自德国Miltenyi公司。 LabOfuge 400R台式离心机(带细胞离心涂片附件)，购自德国Heraeus公司。多聚赖氨酸 玻片，购自福建迈新公司。PV9000 二步法免疫组化试剂盒，购自美国GBI公司。PBS洗液(含2mM EDTA禾tl 0. 5%BSA)，自配。实验方法将10 40个H印3B肝癌细胞掺入5ml EDTA抗凝的健康志愿者静脉血样本中。 按照实施例5的方法分离单个核细胞。抗ASGPR单抗/二抗磁珠组分离H印3B细胞步骤同实施 例5。 Ber-EP4抗体磁珠组分离H印3B细胞步骤按照说明书进行。离心涂片、免疫细胞化学鉴 定步骤同实施例5。实验重复4次。回收率用均数土标准差表示。健康志愿者的静脉血样本中掺入不同数目(10 40)的H印3B细胞，经Ficoll分离单个 核细胞后，分别用抗ASGPR单抗/二抗磁珠和Ber-EP4抗体磁珠分离回收H印3B细胞，抗ASGPR 单抗/二抗磁珠的回收率(85. 3%)高于Ber-EP4抗体磁珠的回收率(48.9%)(代0.05)(见 表2)。表2.不同磁珠从播散肝癌细胞实验模型中分离所掺入的H印3B肝癌细胞细胞株磁珠掺入的细胞数回收率(％)Hep3BASGPR单抗/二抗 磁珠10/20/30/4085. 3±4. 1Hep3BBer-EP4抗体磁珠10/20/30/4048. 9±5. 6本发明使用生物素化去唾液酸胎球蛋白/生物素抗体磁珠或抗ASGPR单抗/二抗磁珠分离 肝癌细胞，其回收率均显著高于Ber-EP4抗体磁珠的回收率。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作 为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种肝癌细胞的分离方法，其特征在于，包括下述步骤(a)采集样品；(b)从样品中分离单个核细胞；(c)以与去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)特异结合的物质A与单个核细胞中的肝癌细胞结合，所述物质A与磁珠间接连接，形成复合物B；(d)磁性分离步骤(c)中的复合物B。
2. 权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述物质A选自ASGPR的配体或抗体。
3. 权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(b)中采取的分离方法为密度梯度细 胞分离法。
4. 权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述样品选自骨髓、血液或其他体液。
5. 权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述其他体液为淋巴液、胸水或腹水。
6. 权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR的配体，所述ASGPR的配 体为可与ASGPR的糖识别区(CRD)特异结合的蛋白、糖、多肽或核酸。
7. 权利要求6所述的分离方法，其特征在于，所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为以半 乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基为端基的糖蛋白。
8. 权利要求7所述的分离方法，其特征在于，所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为去唾 液酸胎球蛋白。
9. 权利要求2所述的分离方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR胞外区的抗体。
10. 权利要求9所述的分离方法，其特征在于，所述ASGPR胞外区的抗体为单克隆抗体。
11. 权利要求1-8任一权利要求所述的肝癌细胞的分离方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR 的配体，所述步骤(c)的具体步骤为(f )先以ASGPR的配体-生物素与单个核细胞中的肝癌细胞结合形成复合物1; (g)再以C-磁珠与复合物1结合，形成复合物B1; 所述C为与生物素特异结合的物质。
12. 权利要求11所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(f)中ASGPR的配体为去唾液酸胎 球蛋白；C为链霉亲和素或生物素抗体。
13. 权利要求12所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(f)中去唾液酸胎球蛋白的反应浓 度为0. 1-0. 8mg/ml。
14.权利要求13所述的肝癌细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(f)中去唾液酸胎球蛋 白的反应浓度为0.4-0.8mg/ml。
15. 权利要求1-5、 9-10任一权利要求所述的肝癌细胞的分离方法，其特征在于，所述物质A 为ASGPR抗体，所述步骤(c)的具体步骤为(h)先以ASGPR抗体与肝癌细胞结合形成复合物3;(I)再以二抗-磁珠与复合物3结合，形成复合物B3。
16. 权利要求15所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(h)中ASGPR抗体为小鼠抗人ASGPR 单抗、兔抗人ASGPR单抗或大鼠抗人ASGPR单抗。
17. 权利要求16所述的分离方法，其特征在于，所述步骤(h)中ASGPR单抗的反应浓度为 0.l-5 y g/ml。
18. 权利要求17所述的肝癌细胞的分离方法，其特征在于，所述步骤(h)中ASGPR单抗的反 应浓度为2-4u g/ml。
19. 权利要求1-10、 12-14、 16-18任一权利要求所述的分离方法所分离的肝癌细胞。
20. —种肝癌细胞的鉴定方法，其特征在于，包括下述步骤(a) 采集样品；(b) 从样品中分离单个核细胞；(c) 以与去唾液酸糖蛋白受体特异结合的物质A与单个核细胞中的肝癌细胞结合，所述物质 A与磁珠间接连接，形成复合物B;(d) 磁性分离步骤(c)中的复合物B;(e) 检测鉴定肝癌细胞是否存在。
21. 权利要求20所述的鉴定方法，其特征在于，所述物质A选自ASGPR的配体或抗体。
22. 权利要求20所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(b)中采取的分离方法为密度梯度 细胞分离法。
23. 权利要求20所述的鉴定方法，其特征在于，所述样品选自骨髓、血液或其他体液。
24. 权利要求23所述的鉴定方法，其特征在于，所述其他体液为淋巴液、胸水或腹水。
25. 权利要求21所述的鉴定方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR的配体，所述ASGPR的 配体为可与ASGPR的糖识别区(CRD)特异结合的蛋白、糖、多肽或核酸。
26. 权利要求25所述的鉴定方法，其特征在于，所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为以 半乳糖残基或N-乙酰半乳糖胺残基为端基的糖蛋白。
27. 权利要求26所述的鉴定方法，其特征在于，所述可与ASGPR的CRD特异结合的蛋白为去 唾液酸胎球蛋白。
28. 权利要求21所述的鉴定方法，其特征在于，所述物质A为ASGPR胞外区的抗体。
29. 权利要求28所述的鉴定方法，其特征在于，所述ASGPR胞外区的抗体为单克隆抗体。
30. 权利要求20-27任一权利要求所述的肝癌细胞的鉴定方法，其特征在于，所述物质A为 ASGPR的配体，所述步骤(c)的具体步骤为(f) 先以ASGPR的配体-生物素与单个核细胞中的肝癌细胞结合形成复合物l;(g) 再以C-磁珠与复合物1结合，形成复合物B1; 所述C为与生物素特异结合的物质。
31. 权利要求30所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(f)中ASGPR的配体为去唾液酸胎 球蛋白；C为链霉亲和素或生物素抗体。
32. 权利要求31所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(f)中去唾液酸胎球蛋白的反应浓 度为0. 1-0. 8mg/ml。
33. 权利要求32所述的肝癌细胞的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(f)中去唾液酸胎球蛋 白的反应浓度为0. 4-0. 8mg/ml 。
34. 权利要求20-24任一权利要求所述的肝癌细胞的鉴定方法，其特征在于，所述物质A为 ASGPR抗体，所述步骤(c)的具体步骤为(h) 先以ASGPR抗体与肝癌细胞结合形成复合物3; (I)再以二抗-磁珠与复合物3结合，形成复合物B3。
35. 权利要求34所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(h)中ASGPR抗体为小鼠抗人ASGPR 单抗、兔抗人ASGPR单抗或大鼠抗人ASGPR单抗。
36. 权利要求35所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(h)中ASGPR单抗的反应浓度为 0.卜5u g/ml。
37. 权利要求36所述的肝癌细胞的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(h)中ASGPR单抗的反 应浓度为2-4y g/ml。
38. 权利要求20所述的肝癌细胞的鉴定方法，其特征在于，所述步骤(e)中采用免疫细胞化 学法或者流式细胞仪检测鉴定。
全文摘要
本发明提供了一种播散肝癌细胞的分离和鉴定方法，所述方法基于肝癌细胞膜上的去唾液酸糖蛋白受体，利用去唾液酸糖蛋白受体的配体或者抗体与肝癌细胞结合，然后用磁珠间接标记所述肝癌细胞进行阳性分离富集，再用免疫细胞化学方法或流式细胞仪等方法鉴定、检测，可判断标本中是否存在肝癌细胞。该方法可用于肝癌的诊断、转移复发预测及疗效监测等。本发明方法可以检测播散肝癌细胞，其敏感性高、特异性好，且操作简便。
文档编号C12N5/08GK101302495SQ20081004019
公开日2008年11月12日 申请日期2008年7月3日 优先权日2008年7月3日
发明者康晓燕, 文 徐, 殷正丰 申请人:中国人民解放军第二军医大学