专利名称：一种用于筛选人类免疫缺陷性病毒抑制剂的转化子的制作方法
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发明领域本发明涉及用于筛选人类免疫缺陷性病毒(HIV)抑制剂的转化子，具体涉及一种被表达HIV核壳蛋白的质粒和含HIVψ核苷酸序列和β-半乳糖苷酶报道基因的质粒共转化的转化子；本发明还涉及一种采用所述转化子筛选HIV抑制剂的方法。
至今，人们已经开发了抑制HIV复制的一些药物，包括反转录酶抑制剂如3’-叠氮-3’-脱氧胸腺嘧啶(AZT)、双脱氧肌苷(DDI)以及蛋白酶抑制剂等。最近，采用编码HIV蛋白的核酸序列开发DNA疫苗(参见Hinkula J.et al.，Vaccine，15874-878，1997；Calarota et al.，Lancet，3511320-1325，1998)，以及通过去除HIV nef基因来制备活的减毒HIV疫苗(参见Kestler and Jeang，Science，2701219-1222，1995；Chakrabartiet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，939810-9815，1996)等研究都正在进行中。
由于HIV DNA插入到宿主免疫细胞的染色体中，所述药物不能去除HIV的原病毒，或不能有选择性地去除含有原病毒的宿主免疫细胞，因此这就不能排除由于基因突变引起的HIV变体获得抗药性或由于减毒的病毒疫苗的重组而导致的HIV回复突变株又重新获得致病的HIV特性(参见Berkhout et al.，J.Virol.，731138-1145，1999)。更进一步研究发现HIV不仅需要CD4+分子作为其宿主细胞表面受体，而且其结合和获得进入宿主细胞还需要共同受体如T细胞系向性的CXCR4/融合共同受体或巨噬细胞向性的CCR5共同受体等(参见Fenget al.，Science，272872-877，1966)。因此，一种药物治疗方法就是将这些共同受体作为药物的靶以试图抑制病毒结合到宿主细胞上。由于这些共同受体的正常功能是同在炎症反应时发挥作用的趋化因子(或趋化细胞因子)结合，因此预计可能会产生严重的副作用(参见Murphy，D.M.Ann.Rev.Immol.，12593-633，1994)。鉴于上述情况，有必要开发出一种新型HIV抑制剂。这种抑制剂不影响与受体有关的宿主的免疫作用或生理活性。一种此类药物治疗方法就是将病毒装配所需的特异因子作为目标。
当HIV病毒颗粒组装时，其基因组RNA有选择性地被装进病毒粒子中。众所周知，核壳蛋白(NC)区域与病毒包装序列(包壳信号)ψ的特异性相互作用可选择性地允许病毒基因组RNA的包装。序列Psi(ψ)位于基因组RNA 5′端的长末端重复序列(LTR)和编码前体多聚蛋白(基质-衣壳-核壳)的gag基因之间，有4个茎环结构。然而由于缺少一个简易有效的分析系统，能抑制包装所必要的特异性病毒相互作用的化合物或组合物筛选是很困难的。
在这种状况下，有很多理由需要开发一种模型系统，可以象在体内一样检测HIV核壳蛋白和HIVψ序列之间的特异性相互作用，以便于筛选出能防碍HIV包装的抑制剂。
发明概述本发明人致力于开发出一种简易有效的在体内通过检测HIV核壳蛋白和HIVψ序列间的特异性相互作用来筛选HIV包装抑制剂的方法，并为此制备出了被表达HIV核壳蛋白的质粒和含有HIVψ序列和β-半乳糖苷酶报道基因的质粒共转化的转化子，结果发现采用所述转化子并监测其在β-半乳糖苷酶表达水平上的变化能够方便地筛选出来HIV抑制剂。
本发明的主要目的是提供一种转化子，该转化子被一种表达HIV核壳蛋白的质粒和一种含有HIVψ序列和β-半乳糖苷酶报道基因的质粒共转化。
本发明的另一目的是提供一种采用所述转化子筛选HIV包装抑制剂的方法。
图1a是质粒pX1(-ATG)构建方案示意图。
图1b是质粒pNH1构建方案示意图。
图1c是质粒pNH1Psi或pNH1rePsi构建方案示意图。
图2中的曲线显示在共转化子大肠杆菌JM109中的β-半乳糖苷酶表达水平，质粒pNH1分别与表达核壳蛋白的质粒pJC1或表达Gag蛋白的质粒pTrcHisGag或作为对照的质粒pSE380共转化大肠杆菌JM109。
图3a中的曲线显示HIV核壳蛋白或Gag蛋白与HIVψ序列的相互作用对β-半乳糖苷酶表达的影响。大肠杆菌JM109被质粒pNH1MCS分别与pJC1、pTrcHisGag或pSE380共转化并经IPTG诱导后表达β-半乳糖苷酶。
图3b中的曲线显示HIV核壳蛋白或Gag蛋白与HIVψ序列的相互作用对β-半乳糖苷酶表达的影响。大肠杆菌JM109被质粒pNH1Psi(SL1234)分别与pJC1、pTrcHisGag或pSE380共转化并经IPTG诱导后表达β-半乳糖苷酶。
图4中的曲线显示HIV核壳蛋白或Gag蛋白与HIVψ序列的各个部份相互作用对大肠杆菌JM109中β-半乳糖苷酶表达的影响。将每一种含ψ核苷酸序列的质粒pNH1Psi(SL1234)、pNH1Psi(SL234)、pNH1Psi(SL34)、pNH1Psi(SL23)或pNH1Psi(SL12)分别与质粒pJC1、pTrcHisGag或pSE380共转化大肠杆菌JM109。
发明详述本发明的转化子用于筛选HIV包装抑制剂，所述转化子由两种质粒共转化制备，一种质粒pJC1表达HIV核壳蛋白，另一种质粒pNH1Psi(SL1234)含有HIVψ基因和β-半乳糖苷酶报道基因。
用于筛选HIV抑制剂的转化子的制备过程将做更详细的阐述。
通过表达HIV核壳蛋白的质粒pJC1和含有HIVψ基因和β-半乳糖苷酶报道基因的质粒pNH1Psi(SL1234)共转化来制备转化子在质粒pSE280中插入LacZ基因片段构建质粒pX1，从pX1中去除ATG就构建成质粒pX1(-ATG)。然后，用含有卡那霉素抗性基因的AflIII-StuI片段替代质粒pX1(-ATG)中的氨苄青霉素抗性基因就获得质粒pZ1。将含有rrnB T1T2终止子的来自pX1(-ATG)的HindIII-BspHI片段插入到质粒pZ1里就构建成含LacZ基因的质粒pNH1。将来自质粒pLLIII含ψ片段的4个茎环结构插入到上述已构建的质粒pNH1中就构建成质粒pNH1Psi(SL1234)，该质粒含有的LacZ基因位于HIVψ核苷酸序列侧翼，就在起始密码子的前面(参见
图1)。然后将由本发明人构建的表达核壳蛋白的质粒载体pJC1(参照Ji Chang You andCharles S.Mchenry，J.Biol.Chem.，26816519-16527，1993)和上述构建的质粒pNH1Psi(SL1234)共转化进大肠杆菌。即载体pJC1和载体pNH1Psi(SL1234)通过电穿孔共转化进大肠杆菌，然后在含抗生素的培养基中选择抗生素抗性的转化子。转化子命名为E.coli/pNH1Psi(SL1234)，保存在国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM，#361-221Hongie-1-dong，Seodaemun-gu，Seoul，Republic of Korea)，保藏登记号KCCM-10194，保藏日为2000年3月31日。上述转化子具有一个特性由于ψ核苷酸序列与HIV核壳蛋白的相互作用，β-半乳糖苷酶报道基因表达为负调控，因此被转化子能被用于筛选HIV包装的抑制剂。例如，所述转化子的培养物用推定的HIV抑制剂的化合物或组份处理，然后测定培养液中β-半乳糖苷酶表达的变化水平。因而本发明的转化子能用于筛选HIV包装的抑制剂，这些抑制剂能阻断HIV核壳蛋白和HIVψ核苷酸序列的结合。
本发明用下列实施例进一步说明，这些实施例不应认为是对本发明范围的限制。实施例1质粒pNH1(SL1234)的构建含β-半乳糖苷酶报道基因(SEQ ID NO1)的质粒构建。实施例1-1质粒pNH1的构建以内切酶Pst I(德国Boeringer Mannheim)消化质粒pUS935(参见Dellagostin，O.A.et al.，Microbiology，1411785-1792，1995)所得到的LacZ基因片段插入到质粒pSE280(美国Invitrogen)中获得质粒pX1。为防止从位于LacZ片段多克隆位点上游的ATG起始翻译，用NcoI、绿豆外切核酸酶(德国Boehringer Mannheim)和Klenow酶处理，去除上游ATG产生平末端，然后连接成pX1(-ATG)。
图1a是pX1(-ATG)构建方案的示意图。用卡那霉素抗性基因替代质粒pX1(-ATG)中的氨苄青霉素抗性基因，即连接来自pX1(-ATG)含LacZ基因的MscI片段和来自质粒pZerO-2(美国Invitrogen)含Kanr基因的AflIII-StuI片段，制成质粒pZ1。然后，将来自pX1(-ATG)含rrn T1T2终止子的HindIII-BspHI片段插入到质粒pZ1的ScaI位点中制成新质粒pNH1。
图1b是质粒pNH1构建方案的示意图。实施例1-2质粒pNH1Psi(SL1234)的构建质粒pLLIII(University of Colorado，Health Sciences Center，CharlesS.McHenry)含有HIV-1的5′端长末端重复序列(LTR)，用内切酶SacI和MseI消化，然后再用Klenow酶处理得到一个含有HIVψ核苷酸序列(命名为“SL1234”，SEQ ID NO2)的片段，“SL1234”有4个茎环结构。
SL1234先用内切酶MaeI消化，再用Klenow片段处理获得SL12(SEQ ID NO3)。将SL1234或两个SL12片段插入到位于质粒pNH1中LacZ基因上游的BstEII位点分别构建成质粒pNH1Psi(SL1234)和质粒pNH1Psi(SL12)。含反方向HIVψ核苷酸序列的质粒pNH1rePsi(SL1234)和质粒pNH1rePsi(SL12)用作对照载体。正向221个碱基对的DNA带和反向152个碱基对的DNA带用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
引物，U2和L3对或U2和L4对分别用于SL23(SEQ ID NO4)或SL234(SEQ ID NO5)的扩增，它们的核苷酸序列如下引物U2(SEQ ID NO6)5′-GGGGGTGACCTTTAAAAGCAAGAGGCGAGGG-3′引物L3(SEQ ID NO7)5′-GGGGGTGACCCTCTCCTTCTAGCCTCCG-3′引物L4(SEQ ID NO8)5′-GGGGGTGACCGACGCTCTCGCACCCGTCTCT-3′为便于将ψ片段容易地插入到质粒pNH1中BstEII位点，BstEII位点(黑体)被插入到每一个引物中，DraI位点(黑体)插入到引物U2中以鉴定方向。点突变(底划线)T变成G被引入到引物L4中以防止从ψ序列起始翻译。PCR在100μl反应混合物中进行10mM Tris-HCl，pH7.5，1.5mM MgCl2，50mM KCl，1mM dNTP，10μM每种引物，1μg质粒pLLIII和2.5单位的Taq聚合酶(德国Boehringer Mannheim)。先94℃预保温5分钟，然后30次循环如下94℃变性1分钟，引物60℃退火2分钟，72℃延伸2分钟。循环结束后增加72℃延伸10分钟。对SL23插入，在每个质粒用内切酶DraI消化后，正向213个碱基对DNA带和反向146个碱基对DNA带用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。对SL234插入，在每个质粒用内切酶DraI消化后，正向234个碱基对DNA带和反向146个碱基对DNA带用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
SL34片段由PCR产物SL234用内切酶RsaI和BstEII消化后得到，经Klenow片段处理后插入到质粒pNH1的BstEII位点构建成质粒pNH1Psi(SL34)和对照质粒pNH1rePsi(SL34)。每个质粒用内切酶BsmAI和XmnI双消化后，正向40个碱基对DNA带和反向56个碱基对DNA带用4％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
为了使用一个阴性对照检查核壳蛋白或Gag蛋白是否和与ψ非同源的核苷酸序列相互作用，通过将75个碱基对无ATG起始密码子的多克隆位点(MCS)片段插入到质粒pNH1内的BstEII位点又构建了质粒pNH1MCS。先用内切酶MaeI消化质粒pSE280，再用Klenow片段处理，得到所述多克隆位点片段。RsaI消化后，229个碱基对的DNA带通过2％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
图1c是质粒pNH1Psi和pNH1rePsi构建方案示意图。实施例2HIV核壳蛋白或HIV Gag蛋白的表达由本发明人构建和公开披露(参见Ji Chang You，and Charles S.McHenry，J.Biol.Chem.，268(22)16519-16527，1993)的核壳蛋白表达质粒pJC1或表达Gag蛋白质粒pTrcHisGag通过电穿孔转化入大肠杆菌JM109(Luria-Bertani，美国Promega)为获得感受态细胞，挑JM109单菌落过夜培养，按1％接种量(1∶100稀释)转移到200ml新鲜的LB培养基(Luria-Bertani，美国Difco)中，培养至OD 0.5-0.7，4000g离心10分钟收集细胞，将细胞沉淀重悬浮于冷的10％(体积比)甘油中，4000g离心10分钟，重复四次洗涤，最终将细胞沉淀重悬浮于1ml冷10％甘油中。取20μl的感受态细胞与1-100ng的DNA混合，转移到0.2cm光径的电穿孔杯中，在大肠杆菌脉冲发生器(美国加州Bio-Lab，Heracules)使用2.5kV电休克转化。转化子在含有100μg氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，按1％接种量在新鲜LB培养基中继续传代培养。当进入对数生长期初期时，加入1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(德国Roche Diagnostics)诱导3小时。转化子的液体培养液每小时取样一次，10000g离心1分钟。将细胞沉淀物重悬浮于20μl的装胶缓冲液(50mM Tris-HCl，pH6.8，100mM DTT，2％ SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)中，100℃保温5分钟以破碎细胞壁。10000g离心30分钟，每一个上清液置于15％SDS-PAGE中并于120V电泳2小时。凝胶在染色液(0.25％考马斯亮兰，45％甲醇和10％冰醋酸)中染色20分钟，然后在脱色液(30％甲醇和10％醋酸)中脱色2小时。尽管如无IPTG诱导，HIV核壳蛋白(分子量7KD)带不显示，但在7KD位置上的蛋白带会随IPTG诱导时间的延长变深。同样，HIV Gag蛋白条带(分子量55KD)在IPTG诱导后会出现在55KD左右的位置上。实施例3共转化以及β-半乳糖苷酶表达的测定为了测定HIVψ核苷酸序列和核壳蛋白或Gag蛋白相互作用对β-半乳糖苷酶表达水平的影响，质粒pJC1和每一种pNH1Psi质粒或质粒pTrcHisGag和每一种pNH1Psi质粒通过电穿孔分别共转化入大肠杆菌JM109。为了排除质粒拷贝数影响的可能性和确认lac阻遏物的表达，作为对照质粒的pSE380(美国Invitrogen)与每一种pNH1Psi质粒共转化JM109。每一个共转化子在含100μg/ml氨苄青霉素和40μg/ml卡那霉素的LB琼脂糖平板上挑出。
为了测定共转化子中β-半乳糖苷酶表达，对每一个转化子进行3次以上的β-半乳糖苷酶液体分析。每一个共转化子在LB培养基中培养过夜，培养液按10％接种量(1∶10稀释)接种到5ml新鲜LB培养基中。当进入对数生长期初期时，取出1ml培养液置于冰上，加入1mMIPTG诱导β-半乳糖苷酶，继续培养3小时，让核壳蛋白、Gag蛋白和β-半乳糖苷酶表达，每小时取样1ml培养液放置于冰上。细胞密度用酶联免疫吸附分析读数机(美国ELISA reader，Dynatech)在600nm处测定。对于测定β-半乳糖苷酶活性，每一个共转化子的培养液取50μl与450μl Z缓冲液(60mM Na2HPO4·7H2O，40mM NaH2PO4·H2O，10mM KCl，1mM MgSO4·7H2O，50mM β-巯基乙醇)混合。然后加入20μl氯仿和10μl 0.1％SDS，震荡30秒，28℃温育5分钟，以破碎细胞壁。加入100μl邻硝基苯-β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)(4mg/ml美国Sigma)至细胞裂解液中，混合物室温放置直至生成黄色。当黄色充分生成后，加入200μl 1M Na2CO3终止反应，混合物10000g离心30分钟澄清，上清液在420nm和550nm处测定光密度(OD)值。β-半乳糖苷酶的活性定量用下列公式计算β-半乳糖苷酶的活性单位＝1000×(OD420-1.75×OD550)/(t×OD600)其中，t表示反应时间(分钟)；1.75是一个常数。
为了确定核壳蛋白或Gag蛋白是否影响无ψ序列的质粒中β-半乳糖苷酶的表达，大肠杆菌JM109分别被前体质粒一含LacZ基因、无ψ序列的质粒pNH1和表达核壳的质粒pJC1；质粒pNH1和表达Gag蛋白的质粒pTrcHisGag；或质粒pNH1和对照质粒pSE380共转化，β-半乳糖苷酶的活性测定方法同上。图2中的曲线显示了被质粒pNH1分别与表达核壳蛋白的质粒pJC1、表达Gag蛋白的质粒pTrcHisGag、或对照质粒pSE380共转化后JM109中的β-半乳糖苷酶表达水平。如图2所示，用IPTG经3小时诱导β-半乳糖苷酶后，表达核壳蛋白或Gag蛋白的共转化子的β-半乳糖苷酶表达水平与不表达这些其他蛋白(pSE380)的共转化子的β-半乳糖苷酶的表达水平没有区别，因此表明在共转化子中核壳蛋白或Gag蛋白对共转化子中β-半乳糖苷酶的表达无影响。
为了证实HIV核壳蛋白和HIVψ序列或Gag蛋白和HIVψ序列间相互作用的特异性，对不同共转化子的β-半乳糖苷酶表达水平进行了测定。这些共转化子分别含有质粒pSE380、pJC1或pTrcHisGag中的一种以及质粒pNH1MCS(多克隆位点MCS为一个与HIVψ的非同源序列)或pNH1Psi(SL1234，HIVψ核苷酸序列)中的一种。图3a显示HIV核壳蛋白或Gag蛋白与ψ非同源性序列间的相互作用对共转化的JM109经IPTG诱导后β-半乳糖苷酶表达的影响。所述JM109由质粒pNH1MCS分别和pJC1、pTrcHisGag或pSE380共转化。图3b显示HIV核壳蛋白或Gag蛋白与ψ同源性序列间的特异性相互作用对共转化的JM109经IPTG诱导后β-半乳糖苷酶表达的影响。所述JM109由质粒pNH1Psi(SL1234)分别和pJC1、pTrcHisGag或pSE380共转化。如图3a所示，含有ψ非同源性序列和表达核壳蛋白或Gag蛋白的质粒的共转化子的β-半乳糖苷酶的表达水平与含有质粒pNH1MCS和对照质粒pSE380的共转化子的β-半乳糖苷酶的表达水平没有不同。同时如图3b所示，当与质粒pNH1Psi(SL1234)同时转化时，表达Gag蛋白的共转化子中的β-半乳糖苷酶水平与含对照载体pSE380共转化子中的β-半乳糖苷酶水平比较下降15％，此外表达核壳蛋白的共转化子的β-半乳糖苷酶水平较对照共转化子减少90％以上。
因此，可以证实由于存在HIVψ核苷酸序列，共转化子中的β-半乳糖苷酶表达水平被HIV核壳蛋白降低了，而且这种下降是由HIV核壳蛋白和HIVψ核苷酸序列间的特异性相互作用引起的。
为了鉴别ψ核苷酸序列的哪一部分是负责和核壳蛋白的特异性相互作用的，用含有ψ核苷酸序列茎环结构各个部分的每一种质粒与表达核壳蛋白或Gag蛋白的载体分别共转化入大肠杆菌JM109，然后测定每一个共转化子的β-半乳糖苷酶活性。图4表示HIV核壳蛋白或Gag蛋白与ψ序列部分间的特异性相互作用对大肠杆菌JM109共转化子中的β-半乳糖苷酶表达的影响。大肠杆菌JM109由pJC1、pTrcHisGag或pSE380分别和每一种含有ψ核苷酸序列的各种不同的茎环结构部分质粒pNH1Psi(SL1234)、pNH1Psi(SL234)、pNH1Psi(SL34)、pNH1Psi(SL23)或pNH1Psi(SL12)共转化。在图4中，水平轴代表pJC1、pTrcHisGag或pSE380和含ψ结构的质粒共转化的共转化子(栏1对照质粒pNH1；栏2含非同源性序列的质粒pNH1MCS；栏3pNH1Psi(SL1234)；栏4pNH1Psi(SL234)；栏5pNH1Psi(SL34)；栏6pNH1Psi(SL23)；栏7pNH1Psi(SL12))，纵轴代表β-半乳糖苷酶的活性。结果由斯氏试验进行了统计学上的分析，“*”代表P＜0.05。如图4所示，当细胞中存在ψ序列时HIV核壳蛋白能比HIV Gag蛋白更有效地降低LacZ基因的表达。当含有全长ψ核苷酸序列的质粒pNH1Psi(SL1234)和pJC1共转化入大肠杆菌JM109时，LacZ基因表达降低最明显，其它序列的降低程度按SL34、SL234、SL23、SL12顺序依次递减。对于ψ序列和核壳蛋白间的特异性相互作用导致LacZ基因的表达的减少，SL4序列似乎比其他茎环结构更重要。
因此，这些结果表明ψ序列中的全部4个茎环结构对β-半乳糖苷酶表达的显著降低都是必须的，其中SL4序列对ψ序列和核壳蛋白的结合又是最重要的部分。为避免从SL4区域起始翻译而制备的点突变质粒pNH1Psi(SL234)和pNH1Psi(SL34)中LacZ基因表达减少的程度和没有点突变的质粒pNH1Psi(SL1234)的相似。因此转化子命名为E.coli/pNH1Psi(SL1234)，显示通过ψ序列和核壳蛋白的特异性相互作用，β-半乳糖苷酶表达的下降最大。E.coli/pNH1Psi(SL1234)存放在国际保藏单位韩国微生物保藏中心(KCCM，#361-221 Hongje-1-dong，Seodaemun-gu，Seoul，Republic of Korea)，保藏登记号KCCM-10194，保藏日为2000年3月31日。上述实施例结果总结在下表1中。
表1依赖报道载体种类的β-半乳糖苷酶表达水平
结果由于ψ核苷酸序列和HIV核壳蛋白间的特异性相互作用，转化子具有了降低β-半乳糖苷酶报道基因表达的特征。因此，通过推定的HIV抑制剂的化合物或组合物处理大肠杆菌JM109(KCCM-10194)培养液以及测定β-半乳糖苷酶表达变化的程度，本发明的转化子能用来筛选HIV包装抑制剂，这些抑制剂能阻断HIV核壳蛋白结合到HIVψ序列上。
如上清晰地阐述和证实了，本发明提供了一种微生物，该微生物是被表达HIV核壳蛋白的基因和含有HIVψ基因和β-半乳糖苷酶报道基因的质粒载体共转化的；本发明还提供了一种使用所述转化子来筛选HIV抑制剂的方法。本发明的方法包括了所述转化子的培养、采用推定的HIV抑制剂化合物或组合物处理转化子以及培养基中β-半乳糖苷酶表达变化程度的测定等步骤，能实际应用于筛选HIV包装抑制剂，这些抑制剂能阻断HIV核壳与HIVψ基因序列间的相互作用。
序列表<110>柳志昌(YOU，Ji-Chang)<120>一种用于筛选人类免疫缺陷性病毒抑制剂的转化子(A Transformant for Screening of Inhibitors for Human Immunodeficiency Virus)<130>P0019-JCY<160>8<170>KOPATIN 1.5<210>1<211>3279<212>DNA<213>人工序列<220><223>β-半乳糖苷酶基因<400>1atgggacgtc gacctgaggt aattataacc cgggccctat atatggatcc aattgcaatg 60atcatcatga cagatctgcg cgcgatcgat atcagcgctt taaatttgcg catgctagct 120atagttctag aggtaccggt tgttaacgtt agccggctac gtatactccg gaatattaat 180aggcctagga tgcatatggc ggccgcctgc aggtcgactc tagaggatcc cgtcgtttta 240caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta atcgccttgc agcacatccc 300cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg atcgcccttc ccaacagttg 360cgcagcctga atggcgaatg gcgctttgcc tggtttccgg caccagaagc ggtgccggaa 420agctggctgg agtgcgatct tcctgaggcc gatactgtcg tcgtcccctc aaactggcag 480atgcacggtt acgatgcgcc catctacacc aacgtaacct atcccattac ggtcaatccg 540ccgtttgttc ccacggagaa tccgacgggt tgttactcgc tcacatttaa tgttgatgaa 600agctggctac aggaaggcca gacgcgaatt atttttgatg gcgttaactc ggcgtttcat 660ctgtggtgca acgggcgctg ggtcggttac ggccaggaca gtcgtttgcc gtctgaattt 720gacctgagcg catttttacg cgccggagaa aaccgcctcg cggtgatggt gctgcgttgg 780agtgacggca gttatctgga agatcaggat atgtggcgga tgagcggcat tttccgtgac 840gtctcgttgc tgcataaacc gactacacaa atcagcgatt tccatgttgc cactcgcttt 900aatgatgatt tcagccgcgc tgtactggag gctgaagttc agatgtgcgg cgagttgcgt 960gactacctac gggtaacagt ttctttatgg cagggtgaaa cgcaggtcgc cagcggcacc 1020gcgcctttcg gcggtgaaat tatcgatgag cgtggtggtt atgccgatcg cgtcacacta 1080cgtctgaacg tcgaaaaccc gaaactgtgg agcgccgaaa tcccgaatct ctatcgtgcg 1140gtggttgaac tgcacaccgc cgacggcacg ctgattgaag cagaagcctg cgatgtcggt 1200ttccgcgagg tgcggattga aaatggtctg ctgctgctga acggcaagcc gttgctgatt 1260cgaggcgtta accgtcacga gcatcatcct ctgcatggtc aggtcatgga tgagcagacg 1320atggtgcagg atatcctgct gatgaagcag aacaacttta acgccgtgcg ctgttcgcat 1380tatccgaacc atccgctgtg gtacacgctg tgcgaccgct acggcctgta tgtggtggat 1440gaagccaata ttgaaaccca cggcatggtg ccaatgaatc gtctgaccga tgatccgcgc 1500tggctaccgg cgatgagcga acgcgtaacg cgaatggtgc agcgcgatcg taatcacccg 1560agtgtgatca tctggtcgct ggggaatgaa tcaggccacg gcgctaatca cgacgcgctg 1620tatcgctgga tcaaatctgt cgatccttcc cgcccggtgc agtatgaagg cggcggagcc 1680gacaccacgg ccaccgatat tatttgcccg atgtacgcgc gcgtggatga agaccagccc 1740ttcccggctg tgccgaaatg gtccatcaaa aaatggcttt cgctacctgg agagacgcgc 1800ccgctgatcc tttgcgaata cgcccacgcg atgggtaaca gtcttggcgg tttcgctaaa 1860tactggcagg cgtttcgtca gtatccccgt ttacagggcg gcttcgtctg ggactgggtg 1920gatcagtcgc tgattaaata tgatgaaaac ggcaacccgt ggtcggctta cggcggtgat 1980tttggcgata cgccgaacga tcgccagttc tgtatgaacg gtctggtctt tgccgaccgc 2040acgccgcatc cagcgctgac ggaagcaaaa caccagcagc agtttttcca gttccgttta 2100tccgggcaaa ccatcgaagt gaccagcgaa tacctgttcc gtcatagcga taacgagctc 2160ctgcactgga tggtggcgct ggatggtaag ccgctggcaa gcggtgaagt gcctctggat 2220gtcgctccac aaggtaaaca gttgattgaa ctgcctgaac taccgcagcc ggagagcgcc 2280gggcaactct ggctcacagt acgcgtagtg caaccgaacg cgaccgcatg gtcagaagcc 2340gggcacatca gcgcctggca gcagtggcgt ctggcggaaa acctcagtgt gacgctcccc 2400gccgcgtccc acgccatccc gcatctgacc accagcgaaa tggatttttg catcgagctg 2460ggtaataagc gttggcaatt taaccgccag tcaggctttc tttcacagat gtggattggc 2520gataaaaaac aactgctgac gccgctgcgc gatcagttca cccgtgcacc gctggataac 2580gacattggcg taagtgaagc gacccgcatt gaccctaacg cctgggtcga acgctggaag 2640gcggcgggcc attaccaggc cgaagcagcg ttgttgcagt gcacggcaga tacacttgct 2700gatgcggtgc tgattacgac cgctcacgcg tggcagcatc aggggaaaac cttatttatc 2760agccggaaaa cctaccggat tgatggtagt ggtcaaatgg cgattaccgt tgatgttgaa 2820gtggcgagcg atacaccgca tccggcgcgg attggcctga actgccagct ggcgcaggta 2880gcagagcggg taaactggct cggattaggg ccgcaagaaa actatcccga ccgccttact 2940gccgcctgtt ttgaccgctg ggatctgcca ttgtcagaca tgtatacccc gtacgtcttc 3000ccgagcgaaa acggtctgcg ctgcgggacg cgcgaattga attatggccc acaccagtgg 3060cgcggcgact tccagttcaa catcagccgc tacagtcaac agcaactgat ggaaaccagc 3120catcgccatc tgctgcacgc ggaagaaggc acatggctga atatcgacgg tttccatatg 3180gggattggtg gcgacgactc ctggagcccg tcagtatcgg cggaattcca gctgagcgcc 3240ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt caaaaataa3279<210>2<211>131<212>DNA<213>1型HIV病毒<400>2ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacagca agaggcgagg ggcggcgact 60ggtgagtacg ccaatttttg actagcggag gctagaagga gagagagatg ggtgcgagag120cgtcggtatt a 131<210>3<211>84<212>DNA<213>1型HIV病毒<400>3ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacagca agaggcgagg ggcggcgact60ggtgagtacg ccaatttttg acta 84<210>4<211>67<212>DNA<213>1型HIV病毒<400>4agcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaatt tttgactagc ggaggctaga60aggagag 67<210>5<211>88<212>DNA<213>1型HIV病毒<400>5agcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaatt tttgactagc ggaggctaga60aggagagaga gacgggtgcg agagcgtc 88<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增1型HIV病毒的SL23和SL234序列的引物<400>6gggggtgacc tttaaaagca agaggcgagg g 31<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增1型HIV病毒的SL23序列的引物<400>7gggggtgacc ctctccttct agcctccg 28<210>8<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于扩增1型HIV病毒的SL234序列的引物<400>8gggggtgacc gacgctctcg cacccgtctc t 3权利要求
1.大肠杆菌JM109(KCCM-10194)，其是被一种表达HIV核壳蛋白的载体pJC1和另一种含有HIVψ基因、SL1234(SEQ ID NO2)以及β-半乳糖苷酶报道基因(SEQ ID NO1)的载体pNH1Psi(SL1234)共转化的。
2.一种筛选HIV包装抑制剂的方法，包括如下步骤(1)权利要求1所述的大肠杆菌JM109(KCCM-10194)的培养；(2)用推定的HIV抑制剂化合物或组合物处理所述大肠杆菌；以及(3)测定培养液中β-半乳糖苷酶表达的变化程度。
全文摘要
本发明涉及一种微生物,该微生物被一个表达HIV核壳蛋白的基因和一个含有HIVψ基因和β－半乳糖苷酶报道基因的质粒载体共转化;本发明还涉及一种使用所述转化子来筛选HIV抑制剂的方法。本发明的方法包括培养所述的转化子、采用推定的HIV抑制剂化合物或组合物处理转化子以及测定培养液中β－半乳糖苷酶表达变化程度等步骤,该方法能实际应用于筛选HIV包装抑制剂,这些抑制剂会阻断HIV核壳与HIVψ基因序列间的相互作用。
文档编号C12N1/19GK1354790SQ00808632
公开日2002年6月19日 申请日期2000年10月18日 优先权日2000年4月8日
发明者南赫俊, 金相宪 申请人:柳志昌