专利名称：用于纯化细胞、化学物质和蛋白质结构的多级电磁分离器的制作方法
技术领域：
本发明要求1999年4月9日美国临时申请60/128,627的优先权。
本申请政府项目，NAS9-97027号合同的一部分。
发明领域本发明涉及定量分离细胞、化学物质、蛋白质、配体或其他颗粒的新方法，采用的是多级磁辅助分离技术(“MAGSEP”)。MAGSEP极其适合免疫研究和分析，药物开发、研究和加工，以及其他生物医药应用。可用MAGSEP技术进行与临床、动/植物研究相关的细胞分离。
现有技术描述几乎所有的现有技术都可以归为磁性过滤一类，即将非磁性颗粒与磁性颗粒分离而不论磁性颗粒的磁化程度如何。例如，Miltenyl等在静态试管或流动通道内用强力场梯度将以磁性颗粒(顺磁性、超顺磁性或铁磁性)标记的细胞吸附于试管壁或通道壁，从而将其俘获。非磁性颗粒则沉降或流走，只留下磁性颗粒被俘获，然后由力场中释放得以收集。在美国专利5,053,344中，Zborowsky将一个类似的过程定名为“磁泳”一磁截止。Liberti等在美国专利4,795,698中提出将细的铁磁性磁极条伸入磁性颗粒悬浮液可将且仅将磁性颗粒吸附于磁极上；非磁性颗粒则游走或沉降分离，当力场撤消时，所吸附的颗粒释放进入悬浮液，从而作为纯净细胞被收集。在一种类似于层析的方法中，Ugelstad提出可在珠状铁磁性介质或纤维周围形成高力场梯度，用以俘获磁性颗粒标记的细胞。其他还有一些此类磁性过滤装置，例如美国专利4,795,698和5,053,344。以上所述都是一种相似的、简单的两分法，即将磁性颗粒与非磁性颗粒分开，所用的都是高梯度磁场。
与本发明更接近的现有技术是Power等所述将低梯度力场施加于通道内水平流动的悬浮液根据磁标记的磁化水平，通过磁标记细胞的吸附，将其动态亦即潜在地俘获。然而，该方法仅用于二元分离。Winoto-Morbach等引入了“磁泳迁移率”的概念，意指有一个固有参数使得颗粒可以根据其在力场梯度中的迁移速度而分离。迁移率即速度与驱动力之比。在这一概念的实施方式之一即Zborowsky等的美国专利5,968,820中，对磁泳迁移率进行了测定，美国专利5,974,901则提出大型永磁体磁极的颗粒悬浮液受控层流，颗粒会根据其磁泳迁移率发生偏转。所述偏转可被用作根据颗粒迁移率或磁化程度进行回收的方法。Reddy等(1995)和Zborowsky等(1995)开发出了直接评估不同磁性颗粒类型磁化的分析方法。
与此竞争的其他制备技术包括另一些不同类型的分离方法，例如电泳和离心。电泳分离是让物质通过一个电场，根据细胞对一特定正电荷或负电荷的吸引力而发生分离。目前市场上的许多制造商只制造电泳设备。离心则是靠惯性力来分离细胞或其他物质。较重的物质受力向外移动，而较轻的物质则留在溶液的上层。这一过程的优越性取决于待分离细胞是否能够承受这样的力，是否可以仅根据其大小和/或密度进行分离。该技术对细胞可能特别具有破坏性，因为当离心装置将细胞推向容器壁时，细胞会受到很大的力。
美国专利5,974,901中，Zborowski等的方法是在含有细胞的区域施加一个近乎恒定的力场，例如磁场，从而使细胞在该力场中迁移。通过获取该力场中颗粒(细胞)的一系列显微图像，可以测出其速度，并可以用软件绘制出速度直方图，如果所述力场为磁场，则该图反映颗粒的磁化程度。该方法的用途之一是测定磁泳迁移率即颗粒速度与所施加的场强之比，由此可得出颗粒的其他物理及化学信息。本发明与Zborowski等的区别在于Zborowski等是基于磁性分布的颗粒分析，本发明则提供基于此类特性的颗粒俘获方法，以及根据磁泳迁移率的颗粒收集和分离方法，不限于Zborowski等单纯的分析数据收集。
美国专利5,968,820，Zborowski等的方法中，有一生物细胞混合物，细胞表面固定有一定数量的磁性颗粒，其数量与研究者所研究的受体的数量成正比，细胞因此在其悬浮所处的流动物流中得以分离。所述物流在两个磁极间流动，其中的细胞以一定的速度向磁极偏转，该速度取决于它们的磁泳迁移率，也就是取决于其磁化率，也就是取决于其受体密度。最后，分离后的细胞或颗粒在多个出口被收集成为若干级份，每一级份内的细胞分别具有特定范围内的受体密度。与Zborowski等所述不同，本发明使用的是小室内的静态样品，通过施加磁力使细胞或颗粒以一定的速度流出小室，该速度取决于它们的磁泳迁移率，也就是取决于其磁化率，也就是取决于其受体密度。
美国专利5,053,344，Zborowski等的系统中，在两磁极间有一段空隙，其中，在重力或其他力的驱动下，颗粒悬浮液流过一个有两面平行壁的薄室。该室的位置使得悬浮液液流中的颗粒受到空间梯度磁力的作用。所述空间梯度磁力使得颗粒的俘获根据它们的磁化率在一个平面上形成一定的空间分布，该过程称为“磁性记录(ferrography)”。俘获后，可以根据俘获位置对悬浮液中的颗粒尤其是生物细胞进行检查，但不是根据其磁化率(如果用磁性标记的配体颗粒，则也就是根据受体密度)对悬浮液中的颗粒进行分离。该系统并没有对悬浮液中的颗粒进行分离收集，因此与本发明不同，本发明正是以分离和收集为目标。
改进分离活细胞和蛋白质的技术因为生物技术日益受到重视而变得越来越重要，因为分离常成为许多生物学方法中的限制因素。为了满足上述需要，本发明提供了一种定量分离细胞、颗粒、配体、蛋白质以及其他化学物质的方法，使用的是磁力和/或电磁辅助分离法。
发明概述本发明装置和方法可定量分离细胞、蛋白质或其他颗粒，本发明采用多级磁力和/或电磁辅助分离技术(″MAGSEP″)。MAGSEP技术是一种可用于医药、化学、细胞生物学和生物技术的分离技术。而且，本发明还涉及一种对共同合成分子混合物进行分离并提纯的方法，可由此制备具有不同大小、长度、分子量和结构元素的分组产物。然后对它们进行与抗体、受体或其他结合成员的结合能力分析。上述收集过程可以生成一个配体文库，其中包含所有结合成员的特异性配体，虽然某一序列的构型数可能较多。该技术为细胞生物学家提供了一种用于研究分子识别作用的工具。可以通过对包含已知序列和任意序列的组合文库进行筛选，从中获得结合性强的配体。这样的工具提供了识别和分离激动剂、拮抗剂、酶抑制剂、病毒阻抑剂、抗原和其他药物的方法。
在临床使用单级或多级磁力和/或电磁分离器时，以逐渐减少的顺磁性微珠标记细胞，采用强度逐渐升高的力场，根据它们被标记的程度进行定量分离。受体上结合磁珠越多的细胞越能被弱力场吸引，磁珠越少的细胞则越不能被吸引，参见
图1。这一原理确立了用一速率或平衡过程，根据细胞或其他颗粒磁力进行分离(“分级”)的基础。
电磁辅助方法在此前未能在商业上获得重用的主要原因之一是所用设备的神秘性。其实际上相当简单的物理机制被认为过于复杂。另外还存在着对分离机制的误解。除了不被了解之外，实际物理因素也曾经是阻碍磁场辅助分离应用的因素之一。要求磁珠与待分离物(separand)特异性吸附的大多数磁力辅助分离需要后续装置去除不需要的颗粒。
本发明的多级电磁分离器大大简化了电磁场辅助分离过程，从而克服了上述障碍。所述分离器不需要凝胶、纸张等稳定化基质，也不需要密度梯度。该技术不需要液体强制流动来进行磁力分离。液体的反复转移使流速降至最低，并为分离纯化细胞和蛋白质提供了更温和更适合的环境。本发明的电磁分离技术还能够自动倾析污染性悬浮液。不需要的细胞或颗粒作为过程的副产物被滞留在相反的另一半室中。最终，仪器的终端用户将发现仅需制备一种缓冲液即可提纯并收集自动分离的组分而无需复杂的泵送和真空操作，这带来了效率的提高。
磁力分离技术在其初期的应用之一是新糖基结合体(neoglycoconjugate)研制。许多细胞、酶和外源凝集素都具有特定糖(“外源凝集素”表示“糖结合性蛋白质”)的识别位点。通过将特定糖(寡糖或多糖)与磁珠表面结合，特定细胞、酶或外源凝集素可通过HMGS或MACS分离。这代表了MAGSEP的一种理想用途，因为，不同的糖结合体可以不同的强度与磁珠连接，从而从混合物中分离出来，识别可强磁化微珠上糖结合体A的细胞可与识别可弱磁化微珠上糖结合体B的细胞相分离。而且，通过加入可竞争磁性结合位点的游离糖的溶液，可释放出被磁力俘获的细胞，MAGSEP由此可最后收集到没有微珠结合的细胞。
尽管有了以上最近的革新，仍需要能根据受体密度进行的细胞分离方法。最近，研究实验室在科研中多用受体数量作为依赖性变量。在内分泌学中，小鼠白细胞显示β肾上腺素受体减少；生长调节中，EGF受体的减少受培养物中细胞密度的调节，该密度可用鱼精蛋白调节；在病毒学中，细胞表面上病毒进入细胞所需疱疹病毒糖蛋白D受体数量是有限的；在肿瘤形成过程中，H-ras致癌基因可改变EGF-β受体的数量和类型；在传染病中，galanin受体水平与胰细胞的百日咳毒素抗性相关，已经鉴定到一种白喉毒素受体结合蛋白。在神经学中，受刺激脑细胞培养物中发生阿片样物质κ受体调节；营养学中，当发生蛋白质营养不良时，肥大细胞会损失IgE受体，还发现存在着高密度的血管活性肠肽(VIP)受体。以上只是最新发现的少量举例，这些清楚地表明，针对受体密度改变细胞的研究工具将大受欢迎。
已经有了一些方法通过用免疫微珠配体标记人类循环系统中的细胞，然后用高磁力梯度技术特异性地对其进行牵引。在目前的实践中，这是一种二元分离方法，这种方法可因本发明的连续分离而得到改善。
使用磁力传递药物是磁性颗粒分离技术的又一潜在用途。制成用于传递的磁化颗粒或胶囊后，必需将弱磁化颗粒与磁化率最高的颗粒或胶囊分离。由于要的是强磁化颗粒，所以一个重要的考虑因素是外部磁体与传递部位间的距离，以及不要误送了弱磁化颗粒，这些颗粒若携带有药物，将造成不良副作用。该技术可用于分离AIDS患者的T淋巴细胞特定亚型，或分离治疗糖尿病的胰岛细胞特定亚型。
诊断测试中，除进行预纯化细胞计数外还可进行流式细胞计数，但后者的成本可高达前者的100倍。但本发明方法的低成本具有重大意义发展中国家AIDS护理的困扰在于难以进行诊断检测，因为缺乏进行流动计数的流式计数仪。采用多级电磁分离器的本发明解决了这些问题，并可望为此类全球性健康问题提供解决手段。
理论上，磁辅助分离法不存在容量限制。它可以应诊断所需而很小，也可以应制备(例如细胞移植)所需而很大。后一种情况很重要，因为定量分离所需的高磁性柱(可能高达1m，力场强度高达1-2特斯拉)可用一个转盘内的多级分离室所取代，其中装有中等强度的磁体和电磁体，参见图2。
开发用户友好性、能够根据颗粒表面配体数量分离颗粒的装置看来是改进磁辅助分离装置方面最大的需要。在这方面，磁分离产业已获得了相当的进步，但目前的技术仍仅限于二元分离。一个例子是Baxter Healthcare的Isolex-300磁力细胞分离器，它能通过使用单克隆抗体(MAB)包被的磁珠来选择干/祖细胞。干细胞被选用于再生因化疗或放疗受损的骨髓。本发明的MAGSEP代表了一个技术跃进，因为本发明最终可提供一种根据表面组成的细小差异进行微分分离的可靠方法。
大多数基于配体(例如受体-抗体)的细胞分离方法是非此即彼的二元性的。现在将磁力吸引作为速率过程与逆流分离相结合可以使磁力细胞分离成为一种定量技术，根据每个细胞上结合的配体数量进行分离。根据各种细胞所结合的配体量，该方法可以是定性的，根据同种细胞各自所结合的配体量或高或低，它也可以是定量的。
本发明目的之一是提供一种定量分离细胞、蛋白质或其他颗粒的方法，使用的是多级磁力电磁辅助分离技术(″MAGSEP″)。
本发明的目的还在于提供一种分离共同合成分子混合物的方法，共同合成分子生成了多组不同种产物，各自具有不同的大小、长度、(分子量)以及可用于分析其与抗体、受体或其他配体特异性结合的结构元件，该方法提供了构建配体文库的手段，所述文库可包含所有连接合成员的配体，从而为细胞生物学家提供一种研究分子识别作用的工具。
本发明的目的还在于提供一种由含有已知和任意序列的组合文库识别并分离激动剂、拮抗剂、酶抑制剂、病毒阻抑剂、抗原和其他药物的方法。
本发明的目的还在于提供一种进行动植物细胞和细胞组分磁力分级的方法。
本发明的目的还在于提供一种平板组件，其中可安装至少一块，最好多块磁体，电磁体和/或其组合，并具有一个支撑基底。
本发明的目的还在于设计能提供不同场强(1-1000mT)的电磁硬件和驱动板。
本发明的目的还在于提供一种平板平动指引系统。
本发明的目的还在于使本发明的电磁分离器能适配装入ADSEP容器，用于宇航和远程用途。
本发明的目的还在于与数据管理及处理控制系统相结合。
本发明的目的还在于提供一种极性改变较快的电磁体用于强化混合。
本发明的目的还在于提供一种磁力恒定且具有确定磁通密度的电磁体。
本发明的目的还在于提供一种实施方式，其中，表面带有受体的细胞可通过特定的化学物质配体附着于有待本发明收集的磁性颗粒，所述的细胞表面受体可被抗体结合，所述配体例如与生物素反应的亲和素，与所述抗体化学结合的维生素。
本发明的目的还在于从合成的非均匀磁性颗粒群中选出均匀的磁性颗粒群用于细胞研究。
发明的目的还在于基于弱磁性颗粒迁移率低造成的差异性和选择性来选择高强度、均匀磁性颗粒用于定向药物传递，将磁性微粒用于肠胃外定向药物传递。
本发明的目的还在于采用一种平动磁体为二极、四极或六极永磁体的方式，或磁体为二极、四极或环形电磁体的方式。
本发明的目的还在于采用这样一种方式，其中的平动磁体为一系列固定的任意极性电磁体，它们依次工作，从而将颗粒扫入一个共同的启动区带。
本发明的目的还在于采用计算机和用户软件实现对平动磁体、吸持磁体(holding magnet)和转盘传递系统的控制。
本发明的目的还在于采用这样一种方式，其中，俘获室和吸持磁体成直线排列，或排成其他几何相对关系，例如环绕。
本发明的目的还在于采用这样一种方式，其中，一个以上样品室与各自的平动磁体构成俘获室阵列。
本发明的目的还在于采用这样一种方式，其中，本发明被用于分离磁性标记的生物细胞。
本发明的目的还在于采用这样一种方式，其中，本发明被用于选择均匀的磁性微粒以用于细胞分离及其他生物化学分离过程。
本发明的目的还在于采用这样一种方式，其中，本发明被用于选择均匀的磁性微粒亚群，用于定向药物传递。
本发明的目的还在于采用这样一种方式，其中，本发明被用于所有需要根据磁泳迁移率亦即体积磁化率差异将磁性颗粒分级(分离)的过程。
本发明的目的还在于采用这样一种方式，其中没有采用平动磁体。
后文描述有助于更充分地理解本发明的上述及其他目的。
附图简述根据以下描述，结合附图，可对本发明有更好的理解。附图中，同一编号代表同一零部件。
图1是通过特异性抗体结合于细胞受体上的磁珠；图2显示一种多级电磁分离器与假想的磁力层析柱的比较；图3显示一种单级磁力分离过程，其中与磁珠结合的细胞顺着场强梯度被引向磁极；图4是一种用于样品俘获的电磁分离器的剖视图，显示了平动磁体和吸持磁体，以及相关装置；图5是实验室用电磁体分离装置的透视图，显示了平板组件，电磁体组件，吸持磁体，和底座；图6是一个平动电磁体实施方式，显示了不锈钢的铁芯和绕线；图7显示用于图6实施方式的平板组件；图8是图6实施方式中平板组件进样口的透视图；图9是用于图4实施方式的小室，还显示了俘获室和样品室，以及吸持电磁体、固定用磁体、和平动电磁体；
图10是平板和小室的剖视图，显示样品室的进样过程；
图11是平板和小室的剖视图，显示小室相对于上平板转动的位置；
图12是平板和小室的剖视图，显示样品室内颗粒排列的启动，即平动磁体通电引起颗粒向板界面的移动；
图13是平板和小室的剖视图，显示平动电磁体的位置和颗粒的俘获；
图14是平板和小室的剖视图，显示上平板转动从而俘获部分颗粒；
图15是平动磁体场强图；
图16所示为图4实施方式的吸持磁体组件；
图17所示为磁性微球体与非磁性微球体的分离；
图18显示平板组件的透视图，该组件与平动电磁站相接；
图19是令收集板转动的MAGSEP的引导系统的透视图；图20是一种盒式处理装置模件设计的透视图；图21是一个MAGSEP盒的透视图，它具有与航空业准用的“ADSEP”盒相同的组件，但容量不同；图22是一种实施方式，其中的平动磁体组件采用了多个四极磁体，它们层叠式排列，依次通电；图23是一种实施方式，其中的平动磁体组件由活动四极磁体构成；图24是一种实施方式，其中采用四极或六极平动磁体。
优选实施方式的描述本发明是一种电磁分离器10，采用电磁辅助分离法定量分离细胞、蛋白质、配体、化学物质、抗原和其他颗粒物质。本发明的多级电磁体(“MAGSEP”)10能够进行基于磁化率和磁泳迁移率的多级分离。电磁分离器10的优选形式之一是一种多级逆流装置，其中，底物或细胞用逐渐减少的顺磁性磁珠标记，并用逐渐增强的力场强度根据标记程度进行定量分离。所述电磁分离器10通过自动进行级份收集而提高了产物回收率，并可实现微分分离，而此前只可能进行二元分离。该分离器可用于各种水性悬浮液，并可灵活适用于商业性用途和空间实验室。本发明可实现根据细胞表面抗原含量来分离大量免疫细胞、血细胞及其他分化细胞。而且，它还能够根据磁化率和/或磁泳迁移率对样品中的各组分进行更高水平或纯度的细分。而且，可以通过改变场强均匀俘获磁化的细胞或其他底物。
磁泳作用力定义为-μm=VmBdBdZ]]>其中的B是俘获磁体的力场强度，Vm是颗粒在力场中的速度。该速度是力场和颗粒及溶剂特性的函数Vm=2a2ΔxBdBaημ0dZ]]>所以，MAGSEP装置中的各级分别选择磁泳迁移率不同的颗粒。各级内的颗粒则具有不同的迁移率分布。低力场强度将选择迁移率高的颗粒，较高的力场强度则选择迁移率较低的颗粒。所以，各级根据俘获磁体的力场强度和颗粒停留时间具有各自的磁泳迁移率截留值。
方程(2)中，a是颗粒半径，Δx是颗粒与介质的磁化率差异，η是粘度，μ0是自由空间的磁导率。
运用力场的细胞分离方法多被用作二元分离方法，分离
图1所示基于特异性表面配体而结合和没有结合磁性微球体的细胞。如图所示，抗原结合于细胞受体位点，生物素与抗体结合。磁珠与亲和素结合，后者则与生物素结合。由于表面具有抗体结合性受体的生物细胞可通过配体(例如与生物素反应的亲和素)与磁性颗粒结合，所以可将配体与抗体化学结合。
图5显示的是一种多级电磁分离器与一假象磁性层析柱比较。如前所述，MAGSEP装置采用步进转动分布和容器系统，可选择、分离并储存不同磁泳迁移率的颗粒。各级中的颗粒将具有不同的迁移率分布。低场强将选择迁移率高的颗粒，高场强则选择迁移率小的颗粒。所以，各级根据俘获磁体的力场强度和颗粒停留时间具有各自的磁泳迁移率截留值。图2显示，移动快的细胞其磁泳迁移率较大。于是，细胞根据其表面上的配体得以分离。
将磁力吸引作为一种速率过程与逆流分离相结合，细胞的磁力分离就可以成为根据每个细胞所结合配体的数量进行分离的定量技术。若根据每种细胞所结合的配体量，该方法是定性的，若根据同种细胞不同个体上配体结合量的或多或少，则是定量的。
图3显示一种单级分离过程，其中，与磁珠结合的细胞顺着场强梯度被引向磁极。图中显示了一个磁源，它可以是永磁体或电磁体，位于容器或小室的上方，在其中产生一个力场梯度，磁力牵引顺磁性颗粒根据各自的磁泳迁移率而移动。本发明的电磁分离装置10可以进行非常清楚的分离，其中，颗粒疏松地排列成层，磁性最强的颗粒位于小室的顶部，磁化率略低的悬浮于中部，没有或几乎没有磁化的则悬浮于小室的底部。
例如，所有与磁化珠结合的待分离物(例如细胞或蛋白质)可以从均匀的悬浮液中被引向多级分离器的一个半室，而非磁性待分离物则仍然均衡地分配于上室和下室之间。让非磁性颗粒静置沉降一段时间。移动上室至新鲜溶液上方，使之与分离后的细胞充分混合。在低重力条件下，可以不用沉降获得以上结果，而采用稀释法除去上室中的非磁性颗粒。
优选实施方式通过在同一平板组件中使用多个样品室来实现多级分离。在分离过程中，平动电磁体和吸持电磁体的场强是可变的。
图4是本发明多级电磁分离器10的透视图。MAGSEP单元10的上平板26与下平板24以协调转动方式接合，下平板24由多个支撑腿22支承，上平板26中至少有1个(最好多个)上收集室27，它们与下平板24和其中的下样品室38液体相通，室38内由脂、蜡或其他润滑剂和/或密封剂形成一密封层。该图还显示了一个平动电磁体40，平动系统42，吸持磁体44(在本实施例中，它是一块永磁体)带冷却风扇的吸持电磁体46，平板转动系统48，和平板定位微钮50。
图5所示是一个商品化的装置，其中，上平板26由聚碳酸酯等聚合物制成，安装在轴承33上，由夹紧螺栓29紧固。支撑腿22换成了侧板23，形成一个底座。下平板24是不锈钢制成的。吸持磁体步进马达带动平板26转动。吸持电磁体46悬于管27上方。电磁体35位于底座内。底座安装在机箱37上，机箱上有电源开关39，110VAC插座41，流通口43，指示灯45和冷却风扇47。
更具体地说，该实验室装置包括一台计算机和软件，由电子组件箱和处理单元构成。电子组件有数个接口，包括110VAC电源、电源开关，RS 232接口和状态指示灯。该处理单元接受来自110AC连接件的电源。电源由电源开关开启。控制所述处理单元的PC通过RS232信号连接件工作。电源、平动电磁体、吸持磁体和平板转动的状态以GUI显示。
单个处理单元由上平板和下平板，平板转动系统，电磁体，电磁体平动系统和吸持磁体组件构成。各板通过一个锥形滚柱轴承栓接在一起，使得各板能够相对转动。板之间贴合界面形成一个密封层将液体隔开。在处理过程中，下室可以与多达15个上室对齐。两相步进马达通过驱动转动系统使上平板转动，所述转动系统与位于上平板下表面的内部齿轮啮合。平动电磁体安装于平动系统上，使得电磁体可沿下室垂直平动。向电磁体传递定量电流，形成与下室相交的力场。平动电磁体的场强可以设定为0至1400高斯(在磁极表面测得)或其他选定范围。电磁体平动系统带动电磁体沿下室上下移动。平动速度可以设定为5μm/s至2000μm/s或其他选定范围。吸持磁体组件由安装在连接步进马达的机械臂上的永磁体构成。步进马达带动装有吸持磁体的机械臂转动，使得吸持磁体位于接受处理的小室的上方。
如图6所示，一种优选的平动电磁体40有一个C-1018不锈钢铁芯42，绕以818匝26号铜线，形成一个在两端之间具有空气隙44的碟形。它接收来自电子组件的0至2.16Amps的电流。力场强度可设定为0-1500高斯(在磁极表面测得)。电磁体系统使电磁体沿下室28上下移动。平动速度可设定为120-250＿。
如图4所示，吸持磁体组件44由固定在连接步进马达31的机械臂19上的永磁体构成。步进马达带动装有吸持磁体44的机械臂19转动，使得吸持磁体44位于接受处理的上室27上方。
使用方法MAGSEP 10的作用是分离悬浮于液体中的可磁化物质。如图4所示的一种应用方式可描述如下让上平板26和下平板24处于进样位置(步进半步)，将液体样品加入上室27和下室28。上室27转动到下室28正上方的位置，两管对齐。平动电磁体40通电到设定的电流值，从下室28的底部平动到平板24与26的界面。平动电磁体40断电，吸持电磁体46通电到设定值，特定迁移率范围内的颗粒于是被引入上收集室27的顶部。最后，吸持电磁体46断电，仅由吸持永磁体44将收集到的样品颗粒保持在管27的顶部，同时，上平板26转动，从而俘获样品中的集得颗粒。可以对多达15个俘获室27重复以上过程或加以改变后重复。
图7是平板组件的剖视图，其中，下平板24和上平板26的协动接合，样品室28与上方的收集室27与机械臂19上的吸持磁体孔44对齐。
图8更具体地显示了上平板26内的进样口，该进样口与上收集室27液体相通。分离前后都由平板组件承载样品。一种优选的平板组件由聚碳酸酯上平板，不锈钢下平板和一个聚碳酸酯样品室28构成。上平板与下平板用一个夹紧螺栓接合，上平板可转动。上平板至少有一个(最好多个)被称为收集室27的小室，如图所示是15个。样品室28固定于下平板24的开孔内。这使得收集室27可以在样品室28上方转动，从而允许样品室28内的颗粒转移到收集室27内。然后，收集室27可以从样品室上方转开，从而俘走收集室内的颗粒。夹紧螺栓的压力使得上平板与下平板压合密封。
图9-14显示了用本发明进行的颗粒分级分离过程。
如图9所示，显示了俘获室28，样品室38，吸持电磁体46，吸持永磁体44和平动电磁体40的位置。
图10显示向样品室28内加入细胞等选择性结合了磁性颗粒的物质。如
图11所示，上平板26相对于下平板24和样品室28转动到一个整步位置。如
图12所示，平动电磁体40通电，并向两板的界面移动，该图显示样品室28内颗粒排列的启动阶段。必需指出的是，进样顺序可以是提升电磁体40，上平板26进半步，然后带动带有磁体的上收集室27到位，或者带动所述管的上室27和磁体40到位，然后抬升样品室28。
图13显示平动电磁体的最终位置以及颗粒的俘获，其中，平动电磁体40停止移动并断电，吸持电磁体46通电，其力场与永磁体44的偶合。最后，如
图14所示，上平板26转动从而带走作为处理样品的颗粒中的选定级份。
图15是例如图4所示平动电磁体40的场强图。
如
图16所示，用俘获或吸持电磁体46或程控电磁体牵引样品越过板的界面进入上室27的顶部。
用永磁体44保持俘获的样品停留于俘获室27的顶部，防治它落入板的界面而夹在板24与26之间。可以通过改变永磁体44的大小和材质来改变其力场强度。
图17显示一个通过多级磁泳过程将磁性微粒与非磁性微粒分离的实验结果。实验从含90％1-2_____磁性微球体(animosphere，Polysciences Inc.，)和10％6.0μm非磁性球体(IDC)的混合物开始。这些颗粒可以悬浮在各种液体中；然而，通常使用的是水、聚乙二醇或乙醇。给6个室配备磁极面场强为10-375mT的磁体。以2.54cm为梯度建立场强梯度，换算成mT/m。在各室的停留时间为15分钟，平均移动距离为3mm。根据以上数据估算7个室各自的磁泳迁移率，得该图所示的结果。
如图所示，80.1％的磁性颗粒俘获在6号室中，对应于0.6mm/N-S的迁移率，只有2.8％的非磁性颗粒被俘获。磁性球体的“纯度”达90-99.6％。
图18是一个平动电磁体台的外部平板组件的剖视图，所示平板组件100包括平动电磁体台102(最好每个样品板104有3个)，它与样品板104接合，样品板104以可转动方式与多个室106液体相通，这些室形成并排列于收集板108的外缘，板108与吸持磁体(电磁体)146协作接合。
图19是MAGSEP用于转动收集板的引导系统的剖视图，其中，盘盖110装在平板组件100上，100与蜗轮112接合，112的斜角接触齿轮114与轴承座116连接。所述组件可转动地安装于基座组件119上，该基座有轴承座圈凸缘(relief)118，和位置探测器120，其中，基座119形成盘122，它与精密蜗杆126的轴124机械连接，蜗杆126与活动连轴节128相连，后者由步进马达130驱动。该引导(indexing)系统位于由外壳134和外壳盖136形成的筒体或盒体132内，它们如图20所示那样包住平板组件，图20是一种盒式处理装置模件设计的透视图。
如图21所示，MAGSEP盒可用于设计包括更多相同或不同所述盒单元的处理模件。
图22-24显示了另一种实施方式，即采用层叠式磁体系统，其中，一系列二极、四极或环性磁体，一般为3、4个，沿MAGSEP两板装置的上部柱形室层叠。它们从最底下的开始顺次通电，用以向上加速(即颗粒物理学上所用的磁感应加速器)颗粒，直到它们达到Earnshaw定理所规定的不稳定点，此时，关闭第一力场，启动第二力场，通过磁泳(1995年Zborowski等的美国专利)继续向上的俘获过程，使颗粒不会粘附于器壁。
图22是一种层叠的、依次通电的多个四极磁体的平动磁体组件，还包括一个样品室，分离电磁体，收集室和吸持电磁体。
图23是一种活动四极磁体组件，包括一个分离电磁体，样品室，收集室和吸持电磁体。
图24是一种四极或六极平动电磁体。
其他应用本发明还可以用作“磁层析”的工具。俘获可以是“等度”俘获，即各级的磁场强度相等，或者是“梯度”俘获，即磁体的场强随级数升高而增强。在后一种情况的一种典型应用中，第一级没有磁体也没有上室，其作用是在转移开始前将细胞混合物搅拌均匀。第二级没有磁体，用于从一个小体积的上室向细胞悬浮液中加入磁性颗粒，让它们混合并反应。第三级的上室内有一块很弱的磁体，其体积与下室相近，它只吸引磁化程度最高的细胞，即磁性配体的受体最多的细胞。第四级上室内的磁体强于第三级，吸引磁化程度较弱的细胞，以此类推，倒数第二级是最强的磁体，在此将俘获受体最少的细胞。最后一级也没有磁体，其中将是转移后最终留下的所有完全没有磁化的细胞。在重力条件下，如果转移时间足够长，未被俘获的细胞将因重力沉降而进入位置较低的室。如果没有重力，则未被俘获的细胞将在每次转移时留在上室和下室中；然而，每次转移的不断混合可带走各室中未被俘获的细胞。
另一个例子是，将DYNABEADS M-280与2μm非磁化微球体混合。在分离前后进行微分计数(库尔特颗粒计数器或血细胞计数仪)，用于测定纯化因数和分离度。为了测定分离方法对实际细胞的效率，用梯度力场强度(随级数升高而增强)分离带有不同数量磁珠的细胞。处理的底物是氨基顺磁性颗粒(例如Polyscience#19524)标记的醛固定的人红细胞，红细胞预先经两次不同水平的神经氨酸苷酶处理，将原表面负电荷降低30％，60％和0％(对照)。所得的三组红细胞与氨基顺磁性微球静电结合，在多级电磁分离器10中分离成三个组分。
以上的详细描述是为了便于清楚地理解本发明，不应将其视为不必要的限定，因为，根据以上所述，符合本发明宗旨和范围的修改对本领域技术人员来说是显而易见的。
磁泳作用力定义为-μm=VmBdBdZ]]>其中的B是俘获磁体的力场强度，Vm是颗粒在力场中的速度。该速度是力场和颗粒及溶剂特性的函数Vm=2a2ΔxBdBaημ0dZ]]>所以，MAGSEP装置中的各级分别选择磁泳迁移率不同的颗粒。各级内的颗粒则具有不同的迁移率分布。低力场强度将选择迁移率高的颗粒，较高的力场强度则选择迁移率较低的颗粒。所以，各级根据俘获磁体的力场强度和颗粒停留时间具有各自的磁泳迁移率截留值。
图7显示用于图5实施方式的平板组件；图8是图5实施方式中平板组件进样口的透视图；图9是用于图4实施方式的小室，还显示了俘获室和样品室，以及吸持电磁体、固定用磁体、和平动电磁体；
图10是平板和小室的剖视图，显示样品室的进样过程；
图11是平板和小室的剖视图，显示小室相对于上平板转动的位置；
图12是平板和小室的剖视图，显示样品室内颗粒排列的启动，即平动磁体通电引起颗粒向板界面的移动；
图13是平板和小室的剖视图，显示平动电磁体的位置和颗粒的俘获；
图14是平板和小室的剖视图，显示上平板转动从而俘获部分颗粒；
图15是平动磁体场强图；
图16所示为图4实施方式的吸持磁体组件；
图17所示为磁性微球体与非磁性微球体的分离；
图18显示平板组件的透视图，该组件与平动电磁站相接；
图19是令收集板转动的MAGSEP的引导系统的透视图；图20是一种盒式处理装置模件设计的透视图；图21是一个MAGSEP盒的透视图，它具有与航空业准用的“ADSEP”盒相同的组件，但容量不同；图22是一种实施方式，其中的平动磁体组件采用了多个四极磁体，它们层叠式排列，依次通电；图23是一种实施方式，其中的平动磁体组件由活动四极磁体构成；图24是一种实施方式，其中采用四极或六极平动磁体。
优选实施方式的描述本发明是一种电磁分离器10，采用电磁辅助分离法定量分离细胞、蛋白质、配体、化学物质、抗原和其他颗粒物质。本发明的多级电磁体(“MAGSEP”)10能够进行基于磁化率和磁泳迁移率的多级分离。电磁分离器10的优选形式之一是一种多级逆流装置，其中，底物或细胞用逐渐减少的顺磁性磁珠标记，并用逐渐增强的力场强度根据标记程度进行定量分离。所述电磁分离器10通过自动进行级份收集而提高了产物回收率，并可实现微分分离，而此前只可能进行二元分离。该分离器可用于各种水性悬浮液，并可灵活适用于商业性用途和空间实验室。本发明可实现根据细胞表面抗原含量来分离大量免疫细胞、血细胞及其他分化细胞。而且，它还能够根据磁化率和/或磁泳迁移率对样品中的各组分进行更高水平或纯度的细分。而且，可以通过改变场强均匀俘获磁化的细胞或其他底物。
磁泳作用力定义为其中的B是俘获磁体的力场强度，Vm是颗粒在力场中的速度。该速度是力场和颗粒及溶剂特性的函数所以，MAGSEP装置中的各级分别选择磁泳迁移率不同的颗粒。各级内的颗粒则具有不同的迁移率分布。低力场强度将选择迁移率高的颗粒，较高的力场强度则选择迁移率较低的颗粒。所以，各级根据俘获磁体的力场强度和颗粒停留时间具有各自的磁泳迁移率截留值。
方程(2)中，a是颗粒半径，Δx是颗粒与介质的磁化率差异，η是粘度，μ0是自由空间的磁导率。
运用力场的细胞分离方法多被用作二元分离方法，分离
图1所示基于特异性表面配体而结合和没有结合磁性微球体的细胞。如图所示，抗原结合于细胞受体位点，生物素与抗体结合。磁珠与亲和素结合，后者则与生物素结合。由于表面具有抗体结合性受体的生物细胞可通过配体(例如与生物素反应的亲和素)与磁性颗粒结合，所以可将配体与抗体化学结合。
图2显示的是一种多级电磁分离器与一假象磁性层析柱比较。如前所述，MAGSEP装置采用步进转动分布和容器系统，可选择、分离并储存不同磁泳迁移率的颗粒。各级中的颗粒将具有不同的迁移率分布。低场强将选择迁移率高的颗粒，高场强则选择迁移率小的颗粒。所以，各级根据俘获磁体的力场强度和颗粒停留时间具有各自的磁泳迁移率截留值。图2显示，移动快的细胞其磁泳迁移率较大。于是，细胞根据其表面上的配体得以分离。
将磁力吸引作为一种速率过程与逆流分离相结合，细胞的磁力分离就可以成为根据每个细胞所结合配体的数量进行分离的定量技术。若根据每种细胞所结合的配体量，该方法是定性的，若根据同种细胞不同个体上配体结合量的或多或少，则是定量的。
图3显示一种单级分离过程，其中，与磁珠结合的细胞顺着场强梯度被引向磁极。图中显示了一个磁源，它可以是永磁体或电磁体，位于容器或小室的上方，在其中产生一个力场梯度，磁力牵引顺磁性颗粒根据各自的磁泳迁移率而移动。本发明的电磁分离装置10可以进行非常清楚的分离，其中，颗粒疏松地排列成层，磁性最强的颗粒位于小室的顶部，磁化率略低的悬浮于中部，没有或几乎没有磁化的则悬浮于小室的底部。
例如，所有与磁化珠结合的待分离物(例如细胞或蛋白质)可以从均匀的悬浮液中被引向多级分离器的一个半室，而非磁性待分离物则仍然均衡地分配于上室和下室之间。让非磁性颗粒静置沉降一段时间。移动上室至新鲜溶液上方，使之与分离后的细胞充分混合。在低重力条件下，可以不用沉降获得以上结果，而采用稀释法除去室中的非磁性颗粒。
优选实施方式通过在同一平板组件中使用多个样品室来实现多级分离。在分离过程中，平动电磁体和吸持电磁体的场强是可变的。
图4是本发明多级电磁分离器10的透视图。MAGSEP单元10的上平板26与下平板24以协调转动方式接合，下平板24由多个支撑腿22支承，上平板26中至少有1个(最好多个)上收集室27，它们与下平板24和其中的下样品室38液体相通，室38内由脂、蜡或其他润滑剂和/或密封剂形成一密封层。该图还显示了一个平动电磁体40，平动系统42，吸持磁体44(在本实施例中，它是一块永磁体)带冷却风扇的吸持电磁体46，平板转动系统48，和平板定位微钮50。
图5所示是一个商品化的装置，其中，上平板26由聚碳酸酯等聚合物制成，安装在轴承33上，由夹紧螺栓29紧固。支撑腿22换成了侧板23，形成一个底座。下平板24是不锈钢制成的。吸持磁体步进马达带动平板26转动。吸持电磁体46悬于管27上方。电磁体35位于底座内。底座安装在机箱37上，机箱上有电源开关39，110VAC插座41，流通口43，指示灯45和冷却风扇47。
更具体地说，该实验室装置包括一台计算机和软件，由电子组件箱和处理单元构成。电子组件有数个接口，包括110VAC电源、电源开关，RS 232接口和状态指示灯。该处理单元接受来自110AC连接件的电源。电源由电源开关开启。控制所述处理单元的PC通过RS232信号连接件工作。电源、平动电磁体、吸持磁体和平板转动的状态通过个人计算机以图形用户界面显示。
单个处理单元由上平板和下平板，平板转动系统，电磁体，电磁体平动系统和吸持磁体组件构成。各板通过一个锥形滚柱轴承栓接在一起，使得各板能够相对转动。板之间贴合界面形成一个密封层将液体隔开。在处理过程中，下室可以与多达15个上室对齐。两相步进马达通过驱动转动系统使上平板转动，所述转动系统与位于上平板下表面的内部齿轮啮合。平动电磁体安装于平动系统上，使得电磁体可沿下室垂直平动。向电磁体传递定量电流，形成与下室相交的力场。平动电磁体的场强可以设定为0至1400高斯(在磁极表面测得)或其他选定范围。电磁体平动系统带动电磁体沿下室上下移动。平动速度可以设定为5μm/s至2000μm/s或其他选定范围。吸持磁体组件由安装在连接步进马达的机械臂上的永磁体构成。步进马达带动装有吸持磁体的机械臂转动，使得吸持磁体位于接受处理的小室的上方。
如图6所示，一种优选的平动电磁体40有一个C-1018不锈钢铁芯42，绕以818匝26号铜线，形成一个在两端之间具有空气隙44的碟形。它接收来自电子组件的0至2.16Amps的电流。力场强度可设定为0-1500高斯(在磁极表面测得)。电磁体平动系统使电磁体沿下室28上下移动。平动速度可设定为120-250μm/s。
如图4所示，吸持磁体组件44由固定在连接步进马达31的机械臂19上的永磁体构成。步进马达带动装有吸持磁体44的机械臂19转动，使得吸持磁体44位于接受处理的上室27上方。
使用方法MAGSEP 10的作用是分离悬浮于液体中的可磁化物质。如图4所示的一种应用方式可描述如下让上平板26和下平板24处于进样位置(步进半步)，将液体样品加入上室27和下室28。上室27转动到下室28正上方的位置，两管对齐。平动电磁体40通电到设定的电流值，从下室28的底部平动到平板24与26的界面。平动电磁体40断电，吸持电磁体46通电到设定值，特定迁移率范围内的颗粒于是被引入上收集室27的顶部。最后，吸持电磁体46断电，仅由吸持永磁体44将收集到的样品颗粒保持在管27的顶部，同时，上平板26转动，从而俘获样品中的集得颗粒。可以对多达15个俘获室27重复以上过程或加以改变后重复。
图7是平板组件的剖视图，其中，下平板24和上平板26的协动接合，样品室28与上方的收集室27与机械臂19上的吸持磁体孔44对齐。
图8更具体地显示了上平板26内的进样口，该进样口与上收集室27液体相通。分离前后都由平板组件承载样品。一种优选的平板组件由聚碳酸酯上平板，不锈钢下平板和一个聚碳酸酯样品室28构成。上平板与下平板用中心的一个夹紧螺栓接合，所述夹紧螺栓即上平板相对于下平板转动的旋转轴。上平板至少有一个(最好多个)被称为收集室27的小室，如图所示是15个。样品室28固定于下平板24的开孔内。这使得收集室27可以在样品室28上方转动，从而允许样品室28内的颗粒转移到收集室27内。然后，收集室27可以从样品室上方转开，从而俘走收集室内的颗粒。夹紧螺栓的压力使得上平板与下平板压合密封。
图9-14显示了用本发明进行的颗粒分级分离过程。
如图9所示，显示了俘获室28，样品室38，吸持电磁体46，吸持永磁体44和平动电磁体40的位置。
图10显示向样品室28内加入细胞等选择性结合了磁性颗粒的物质。如
图11所示，上平板26相对于下平板24和样品室28转动到一个整步位置，最终使得样品室与收集室对齐。如
图12所示，平动电磁体40通电，并向两板的界面移动，该图显示样品室28内颗粒排列的启动阶段。必需指出的是，进样顺序可以是提升电磁体40，上平板26进半步，然后带动带有磁体的上收集室27到位，或者带动所述管的上室27和磁体40到位，然后抬升样品室28。
图13显示平动电磁体的最终位置以及颗粒的俘获，其中，平动电磁体40停止移动并断电，吸持电磁体46通电，其力场与永磁体44的偶合。最后，如
图14所示，上平板26转动从而带走作为处理样品的颗粒中的选定级份。
图15是例如图4所示平动电磁体40的场强图。
如
图16所示，用俘获或吸持电磁体46或程控电磁体牵引样品越过板的界面进入上室27的顶部。
用永磁体44保持俘获的样品停留于俘获室27的顶部，防治它落入板的界面而夹在板24与26之间。可以通过改变永磁体44的大小和材质来改变其力场强度。
图17显示一个通过多级磁泳过程将磁性微粒与非磁性微粒分离的实验结果。实验从含90％1-2μm磁性微球体(animosphere，Polysciences Inc.，)和10％6.0μm非磁性球体(Interfacial Dynamics，Corp.)的混合物开始。这些颗粒可以悬浮在各种液体中；然而，通常使用的是水、聚乙二醇或乙醇。给6个室配备磁极面场强为10-375mT的磁体。以2.54cm为梯度建立场强梯度，换算成mT/m。在各室的停留时间为15分钟，平均移动距离为3mm。根据以上数据估算7个室各自的磁泳迁移率，得该图所示的结果。
如图所示，80.1％的磁性颗粒俘获在6号室中，对应于0.6mm/N-S的迁移率，只有2.8％的非磁性颗粒被俘获。磁性球体的“纯度”达90-99.6％。
图18是一个平动电磁体台的外部平板组件的剖视图，所示平板组件100包括平动电磁体台102(最好每个样品板104有3个)，它与样品板104接合，样品板104以可转动方式与多个室106液体相通，这些室形成并排列于收集板108的外缘，板108与吸持磁体(电磁体)146协作接合。
图19是MAGSEP用于转动收集板的引导系统的剖视图，其中，盘盖110装在平板组件100上，100与蜗轮112接合，112的斜角接触齿轮114与轴承座116连接。所述组件可转动地安装于基座组件119上，该基座有轴承座圈凸缘(relief)118，和位置探测器120，其中，基座119形成盘122，它与精密蜗杆126的轴124机械连接，蜗杆126与活动连轴节128相连，后者由步进马达130驱动。该引导(indexing)系统位于由外壳134和外壳盖136形成的筒体或盒体132内，它们如图20所示那样包住平板组件，图20是一种盒式处理装置模件设计的透视图。
如图21所示，MAGSEP盒可用于设计包括更多相同或不同所述盒单元的处理模件。
图22显示了另一种实施方式，即采用层叠式磁体系统，其中，一系列二极、四极或环性磁体，一般为3、4个，沿MAGSEP两板装置的上部柱形室层叠。它们从最底下的开始顺次通电，用以向上加速(即颗粒物理学上所用的磁感应加速器)颗粒，直到它们达到Earnshaw定理所规定的不稳定点，此时，关闭第一力场，启动第二力场，通过磁泳(1995年Zborowski等的美国专利5,053,344)继续向上的俘获过程，使颗粒不会粘附于器壁。
图2是一种层叠的、依次通电的多个四极磁体的平动磁体组件，还包括一个样品室，分离电磁体，收集室和吸持电磁体。
图23是一种活动四极磁体组件，包括一个分离电磁体，样品室，收集室和吸持电磁体。
图24是一种四极或六极平动电磁体。
其他应用本发明还可以用作“磁层析”的工具。俘获可以是“等度”俘获，即各级的磁场强度相等，或者是“梯度”俘获，即磁体的场强随级数升高而增强。在后一种情况的一种典型应用中，第一级没有磁体也没有上室，其作用是在转移开始前将细胞混合物搅拌均匀。第二级没有磁体，用于从一个小体积的上室向细胞悬浮液中加入磁性颗粒，让它们混合并反应。第三级的上室内有一块很弱的磁体，其体积与下室相近，它只吸引磁化程度最高的细胞，即磁性配体的受体最多的细胞。第四级上室内的磁体强于第三级，吸引磁化程度较弱的细胞，以此类推，倒数第二级是最强的磁体，在此将俘获受体最少的细胞。最后一级也没有磁体，其中将是转移后最终留下的所有完全没有磁化的细胞。在重力条件下，如果转移时间足够长，未被俘获的细胞将因重力沉降而进入位置较低的室。如果没有重力，则未被俘获的细胞将在每次转移时留在上室和下室中；然而，每次转移的不断混合可带走各室中未被俘获的细胞。
以上的详细描述是为了便于清楚地理解本发明，不应将其视为不必要的限定，因为，根据以上所述，符合本发明宗旨和范围的修改对本领域技术人员来说是显而易见的。
权利要求
1.一种定量分离细胞、蛋白质或其他颗粒的新方法，它包括使用多级电磁辅助分离技术，该技术包括使用一系列二极、四极或环形磁体，它们沿MAGSEP两板装置上部圆柱形室堆叠，从最底层开始依次启动，用于向上加速颗粒，直至它们达到Earnshaw定理所规定的不稳定点，此时，关闭第一力场而启动第二力场，通过磁泳继续向上的俘获过程，颗粒不会粘附于器壁。
全文摘要
本发明涉及一种定量分离细胞、蛋白质或其他颗粒的新方法，涉及多级电磁辅助分离技术，用到一系列二极、四极或环形磁体(40，44)，沿MAGSEP(10)双盘装置上部圆柱形室堆叠，先启动第一力场，向上加速(即粒子物理学中所用的磁感应加速器)粒子，直至它们达到Evamshaw定理所规定的不稳定点，此时，关闭第一力场，启动第二力场，继续通过磁泳向上的俘获过程，期间，粒子不会粘附于器壁。
文档编号C12N5/02GK1399718SQ00808434
公开日2003年2月26日 申请日期2000年4月10日 优先权日1999年4月9日
发明者J·维林格, P·W·托德, K·巴顿, S·邓恩, M·S·多瑟 申请人:宇宙硬件最佳技术股份有限公司