用转化的微藻生物合成外源蛋白质的制作方法

专利名称：：用转化的微藻生物合成外源蛋白质的制作方法1.发明领域本发明涉及用转化的微藻生物合成外源蛋白质。更具体地说，本发明涉及通过用含有所需的外源蛋白质基因的DNA载体转化微藻原生质体，然后大规模培养以便生物合成外源蛋白质的方法。2.现有技术描述大肠杆菌是使用最广泛的异源表达系统，但是该细菌有一些限制i)很难或不能表达某些特定的蛋白质，ii)一些重组蛋白质没有生物活性，iii)一些重组蛋白质对大肠杆菌是有毒的，以及iv)一些重组蛋白质形成不溶型包涵体。用酵母表达系统可能会发生类似的问题。已经用培养的哺乳动物和昆虫细胞解决这些问题，但这些系统由于培养基、装置以及需要进一步纯化过程而变得昂贵。因此，本发明人对小球藻转化进行了研究，用其作为一种新的异源过量表达系统，它可以代替大肠杆菌以解决上述问题。结果，我们发现由于微藻有比动物或植物更简单的代谢途径并可用含有光和二氧化碳的培养缸大规模培养，因此，微藻表达系统比细胞培养或动物或植物表达系统更经济。此外，微藻具有与大肠杆菌不同的翻译后修饰过程，这一事实表明在微藻中表达的外源蛋白质的生物活性应该与天然蛋白质的更类似。在这种情况下，我们计划开发微藻过量表达系统用于生产外源蛋白质。已有人试图转化小球藻，微藻的一种。Jarvis和Brown描述了在Chlorellaellipsoidea的原生质体中瞬时表达萤光素酶(Jarvis，E.E.，andBrown.L.M.1991.TransientexpressionoffireflyluciferaseinprotoplastsofthegreenalgaChlorellaellipsoidea，CurrentGenetics19，317-321)，Dawson等发现通过用从Chlorellavulgaris分离出的硝酸盐还原酶基因转化Chlorellasorokiniana的硝酸盐还原酶缺陷型突变可以使所述突变体获救(Dawson，H.N.，Burlingame，R.，andCannons，A.C.1997.StabletransformationofChlorellaRescueofnitratereductase-deficientmutantswiththenitratereductasegene.CurrentMicrobiology35，356-362)。但是，这些试验仅描述了源自小球藻的蛋白质基因的瞬时表达或表达。因此，本发明人对通过用含源自微藻以外之基因的载体DNA转化微藻的原生质体然后大规模培养从而生物合成外源蛋白质的方法进行了研究。结果，我们发现用所述方法可以达到上述目的。为了达到上述目的，本发明方法的特征在于所述方法包括下列步骤(i)获得微藻的原生质体；(ii)制备含编码所需蛋白质之基因的载体，所述基因源自微藻以外的生物；(iii)将所述载体导入所述原生质体中以得到转化的原生质体，和(iv)培养转化的微藻以生产所需的蛋白质。另外，本发明的方法除上述步骤之外，还可包括在步骤(iii)与(iv)之间用抗生素筛选转化细胞的步骤。通过下列详细描述，本发明的上述和其他目的、特征和应用对于本领域技术人员来说将是显而易见的。图2表示用荧光显微镜观察的在转化的Chlorellaellipsoidea中的GFP表达的照片。图3表示转化载体pCTV的示意图。图4表示在含有或不含有腐草霉素的培养基中培养的转化的和未转化的Chlorellaellipsoidea的生长。图5表示插入到转化的Chlorellaellipsoidea的基因组DNA中的鲆生长激素(下文称fGH)基因和Shble基因的PCR扩增和Southern印迹分析结果。在图5中，A图表示fGH的PCR扩增和Southern印迹分析结果，B图表示Shble的PCR扩增和Southern印迹分析结果；1道表示分子量标记，2道表示转化的Chlorellaellipsoidea，3道表示未转化的Chlorellaellipsoidea，4道表示从pBluescriptSK+消化出的fGH与Shble基因。图6表示在转化的Chlorellaellipsoidea表达的fGH的Western印迹分析的结果。在图6中，1道表示分子量标记，2道表示用于抗体生产的谷胱甘肽-S-转移酶(下文称，GST)-fGH融合蛋白，3道表示从未转化的Chlorellaellipsoidea中分离的总蛋白质，4道表示从转化的Chlorellaellipsoidea中分离的总蛋白质。图7表示在转化的Chlorellaellipsoidea中表达的fGH量的Western印迹分析结果。在图7中，M道表示分子量标记，1&2道表示10μgGST-fGH融合蛋白，3&4道表示从10ml转化的Chlorellaellipsoidea分离的fGH，5&6道表示10μgGST蛋白质。图8表示在Brachionusplicatilis和Artemianaupilus(两者均是用由fGH转化的Chlorellaellipsoidea饲养的)中积累的fGH的Western印迹分析。在图8中，1-4道分别表示用转化的Chlorellaellipsoidea饲养后30、60、90和120分钟的Brachionusplicatilis，6-8道分别表示用转化的Chlorellaellipsoidea饲养后30、60、90和120分钟的Artemianaupilus。图9表示通过fGH转化的Chlorellaellipsoidea引起的鲆的生长促进作用。在图9中，白框表示由转化的Chlorellaellipsoidea引起的生长促进作用，黑框表示由未转化的Chlorellaellipsoidea引起的生长促进作用，垂直线表示标准偏差，较低的框表示显著差异(p＜0.05)。图10表示用经fGH转化的Chlorellaellipsoidea饲养1小时的Brachionusplicatilis与Artemianaupilus饲养，在饲养30天后鲆苗的生长促进作用。本发明的详细解释在本发明说明书和权利要求中，用术语外源蛋白质表示源自与宿主微藻不同的生物体的任何蛋白质，并包括保留了其原生物学活性的活性片段、变体和类似物。用术语“外源基因”表示编码上述外源蛋白质的任何核酸序列，不论其来源如何(可以是天然或合成的)，并可包括DNA、RNA、cDNA或其因碱基缺失、替代或插入而产生的变体，只要它们仍编码具有其生物学活性的外源蛋白质。对于生产复合蛋白来说，由于Chlorellaellipsoidea的真核特征以及用于大规模培养的低成本使其成为是一种有吸引力的生物。本发明人首次报告了外源蛋白质鲆生长激素(fGH)在Chlorellaellipsoidea中的功能性表达，以及用转化的小球藻饲养鲆而对鱼产生的生长促进作用。用含有在花椰菜花叶病毒35S启动子控制下的fGH基因和在ChlamydomonasRBCS2基因启动子控制下列的腐草霉素抗性Shble基因的载体转化Chlorellaellipsoidea的原生质体。PCR扩增和Southern印迹分析来自转化体的染色体DNA的fGH与Shble基因，证实了导入DNA的稳定整合。Western印迹分析表明在转化的小球藻中表达了fGH蛋白质。在不含腐草霉素的培养基中连续转移7次后检测导入的DNA和表达的fGH。将转化的小球藻细胞首先喂给浮游动物以除去纤维素细胞壁，然后把浮游生物喂给鲆苗。在喂养30天后，与对照鱼相比，这些鱼总长度和宽度增加25％。这些结果表明可以用Chlorellaellipsoidea以低成本生产有价值的蛋白质。在本发明中，来自用GFP基因转化的小球藻的绿色荧光和用Shble基因转化的小球藻的腐草霉素抗性表明了这些蛋白质的功能性表达。通过喂养鲆苗确定重组fGH的生物学活性。因此，在本发明中已证实用鲆生长激素基因转化的微藻可以表达生物活性形式的激素。因此，可以从转化的微藻中生产有价值的蛋白质用于药物和工业。具体地说，可用简单的装置低成本生产微藻，从中分离和纯化表达的蛋白质的方法也很简单，这样就可以显著降低生产蛋白质的成本。此外，本发明描述了成功地利用Shble基因作为Chlorellaellipsoidea转化的选择性标记，首次表明生物活性外源蛋白质在转化的Chlorellaellipsoidea中的稳定基因整合和表达。用于本发明的微藻没有特别地限制，但所述技术可用于其他藻类包括来自海洋和活水的小球藻属，例如Chlorellaellipsoidea、Chlorellasorokiniana和Chlorellavulgaris，衣藻属(Chlamydomonas)、团藻属(Volvox)、Cheatoceros、普哈特属(Phaeodactylum)、骨条藻属(Skeletonema)、舟形藻属(Navicula)、Caloneise、菱形藻属(Nitzschia)、海链藻属(Thalassiosira)、双眉藻属(Amphora)、Nannochloris、Nannochloropsis、Tetraselmis、杜氏藻属(Dunaliella)、Spirulina、微孢藻属(Microcystis)、Oscillatoria、Tricodesminus、Isochryosis、Pavlova、Dinophyceae等。用于本发明的外源基因是鲆生长激素基因。但是也可以通过本发明过量表达源自细菌、真菌、病毒、动物、植物或鱼的其他基因。另外，载体生产、克隆、通过载体转化宿主、转化体的筛选和培养，以及培养后回收所需蛋白质的方法是本领域技术人员熟知的。提供下列实施例说明本发明，它们不应被看成对本发明范围的限制。[实施例1]Chlorellaellipsoidea培养和原生质体形成Chlorellaepillsoidea得自Pukyong国立大学的韩国海洋微藻培养物中心(菌株号KMCCC-20)。将细胞以l×l06细胞/ml的起始浓度接种在分别含50μg/ml氯霉素和链霉素的新鲜f/2培养基(Guillard，R.R.L.，andRyther，J.H.1962.Studiesonmarineplanktonicdiatoms.I.CyclotellananaHustedtandDetonulaconfervacea(Cleve)Gran.Can.J.Microbiol.3，229-239)中，然后在25℃，在3000lux荧光灯下以18∶6小时的光照期培养。在接种后8-9天，当细胞计数达到1-2×108细胞/ml时收集细胞用于原生质体形成。将细胞(50ml)以1500xg离心5分钟，用25mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)洗涤一次，然后悬浮在含0.6M山梨糖醇、0.6M甘露醇、4％(w/v)纤维素酶(Calbiochem，USA)、2％(w/v)解析酶(macerase)(Calbiochem)和50单位果胶酶(SigmaChemicals，USA)的5ml磷酸缓冲液中。将细胞悬浮液在25℃黑暗中保温16小时，同时温和振荡。用两种方法确定Chlorellaellipsoidea的原生质体形成。在渗透-稳定性试验中，在蒸馏水中的酶处理的细胞数在8小时内从1.7×106细胞/ml减少到1.0×105细胞/ml，而未处理的小球藻的数量没有变化。该结果通过卡尔科弗卢尔荧光增白剂染色(Maeda，H.，andIshida，N.1967.Specificityofbindingofhexapyranosylpolysaccharideswithfluorescentbrightner.J.Biochem.62，276-278)得到证实。用荧光显微镜观察时，80％以上的酶处理的细胞是红色，而未处理的细胞是蓝色(见图1)；这些结果表明完全除去了与卡尔科弗卢尔荧光增白剂结合的细胞壁的纤维素组分。[实施例2]pMinGFP的制备和GFP的表达作为开发小球藻转化系统的第一步，从植物转化载体Bin19(Bevan，M.1984.BinaryAgrobacteriumvectorsforplanttransformation.NucleicAcidsRes.12，8711-8712)构建小的5kb双载体。被称为pMIN的新载体含有大肠杆菌和农杆菌属的oriV复制原点、卡那霉素抗性的nptII基因、用于DNA复制的trfA基因以及用于整合的右和左边界T-DNA元件。随后克隆含指导绿荧光蛋白质(GFP)表达的花椰菜花叶病毒35S启动子的DNA片段，产生用于高等植物和藻类转化的载体pMinGFP。通过聚乙烯处理用pMinGFP转化小球藻原生质体，然后测定GFP的表达。在不对转化进行选择的条件下在f/2培养基中培养7天后，少量小球藻细胞有GFP荧光，而未转化的小球藻细胞没有(见图2)。[实施例3]克隆fGH基因用LambdaZAP-IIcDNA合成试剂盒(Stratagene，USA)，从日本鲆脑垂体分离的总mRNA构建鲆cDNA文库。扩增文库的滴度为3×109pfu/ml，用1ul样品用于PCR扩增。将用fGH-AN(5′CGGGATCCCAGCCAATCACAGA-3′)和fGH-AC(5′CGGGCTACAGAATTC-3′)引物扩增的DNA片段克隆到pGEM-T载体(Promega，USA)中用于序列确定。将BamHI/NdeI片段亚克隆到pGEX-3X载体(AmershamPharmaciaBiotech，USA)中用于谷胱甘肽-S-转移酶-fGH(GST-fGH)融合蛋白的表达；用该融合蛋白进行多克隆抗体的生产。[实施例4]制备pMinfGH已经从数种鱼中克隆了生长激素并在转基因鱼中观察了其生长增强作用。用来自日本鲆，Paralichthysolivaceus(韩国的主要水产养殖鱼)的生长激素基因(fGH)转化小球藻。通过PCR扩增鲆脑垂体cDNA文库克隆fGH基因，使用fGH-N引物(5′-CGGGATCCGGTCAGTCCCTTATGCAGCCAATCACA-3′)和fGH-C引物(5′-AAAAGCTCGAGCTCTTGGCGGAG-3′)(Watahiki，M.，Yamamoto，M.，Yamakawa，M.，Tanaka，M.&Nakashima，K.1989.ConservedanduniquesaminoacidresiduesinthedomainsofthegrowthhormonefloundergrowthhormonededucedfromthecDNAsequencehastheminimalsizeinthegrowthhormoneprolactingenefamily.J.Biol.Chem.264，312-316)。用560bpPCR产物代替pMinGFP载体中的GFP基因产生载体pMinfGH。[实施例5]制备pCTV我们使用Shble基因，该基因源自Streptoalloteichushindustamus，编码通过与抗生素结合然后抑制其DNA裂解活性而赋予他利霉素、博莱霉素、腐草霉素和zeomycin抗性的小蛋白质(13.7kDa)。为了确定腐草霉素是否抑制Chlorellaellipsoidea，将藻类在含不同浓度腐草霉素的f/2培养基中培养。在含0.1或0.5μg/ml腐草霉素的培养基中发生生长降低，藻类在含1μg/ml以上腐草霉素的培养基中不生长。因此，赋予腐草霉素抗性的Shble基因适用于筛选转化的小球藻。从质粒pSP109(Lumbreras，V，Stevens，D.R.，&Purton，S.1998.EfficientforeigngeneexpressioninChlamydomonasreinhardtiimediatedbyanendogenousintron.PlantJ.14，441-447)，用ble-N引物(5′-AAACTCGAGGGCGCGCCAGAAGGAGC3′)和ble-C引物(5′-AAACTCGAGAATTCGAGGTCGGTACC-3′)扩增Shble编码区和上游ChlamydomonasreinhardtiiRBCS2启动子。将880bpPCR产物用XhoI消化，然后亚克隆到pMinfGH中以构建小球藻转化载体pCTV(见图3)。[实施例6]用pCTV载体转化Chlorellaellipsoidea将小球藻原生质体(1×108)以400xg离心5分钟，重悬在5ml含0.6M山梨糖醇/甘露糖醇的f/2培养基中，以400xg离心5分钟，然后重悬在1ml含0.05MCaCl2的0.6M山梨糖醇/甘露糖醇溶液中。然后将在0.4ml中1×108原生质体放在新鲜微离心管中，加入5μgpCTV载体和25μg牛胸腺DNA(SigmaChemicals)。在室温保温15分钟后，加入200μlPNC，然后在室温温和混合30分钟。然后加入用0.6M山梨糖醇/甘露糖醇、1％酵母提取物和1％葡萄糖补充的0.6mlf/2培养基，然后在黑暗中将细胞在25℃保温12小时进行细胞壁再生。将细胞转移到含腐草霉素(1μg/ml)的新鲜f/2培养基中，然后按上述培养。到第5天产生可检测的生长，到第15天细胞生长达到稳定期。相反，在未转化的原生质体中没有可检测的生长(见图4)。转化小球藻细胞的慢生长与用pMinGFP进行的初步转化试验一致，其中仅少量百分比(2％)的细胞现出绿荧光。当将稳定期的转化小球藻细胞转移到新鲜f/2培养或含腐草霉素的f/2培养基中时，没有产生可检测的生长差异。此外，在两个培养基中的生长率与未转化小球藻在不含腐草霉素的f/2培养基中的生长相似(见图4)。这些结果表明导入的DNA对小球藻生长没有影响，另外转化的细胞也没有任何形态学变化。[实施例7]导入DNA的稳定整合导入的DNA稳定整合到染色体DNA中是用小球藻作为表达系统的先决条件。用PCR和Southern分析确定导入的DNA是否整合到了小球藻染色体DNA中。(A).DNA分离从3ml培养物中沉淀约3×108个转化细胞，重悬在500μlCTAB缓冲液[250ml溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)5g、1MTris(pH8.0)25ml、NaCl20.45g、EDTA1.68g、β-巯基乙醇(2％)]中，在65℃保温1小时，然后用等体积苯酚/氯仿提取。提取数次以3,000xg离心5分钟后回收的水相，用乙醇沉淀染色体DNA，再沉淀，然后重悬在30μlTE缓冲液中。(B).PCR与Southern印迹分析分别用fGH-N/fGH-C和ble-N/ble-C引物对扩增从染色体DNA分离的fGH基因和Shble基因。将200ng染色体DNA和各100pmole引物加到50μl反应物中，然后经30个循环的如下过程94℃变性1分钟，分别在54或57℃对fGH和Shble基因退火30秒，在72℃延伸1分钟，然后再在72℃延伸5分钟。用DIG-DNA标记试剂盒(BoehringerMannheim，Germany)合成用于Southern印迹分析的探针。仅用从转化的小球藻分离的DNA生产预期大小的PCR产物。用fGH或Shble基因特异性探针通过Southern分析鉴定DNA片段(见图5)。在连续7次转移到不含腐草霉素的培养基中后，通过PCR扩增来自从小球藻分离的染色体DNA的上述两基因来确定整合DNA的稳定性。[实施例8]fGH在转化的Chlorellaellipsoidea中的表达按下文所述通过Western分析检测fGH表达。通过以17,000xg离心5分钟从含108-109个细胞的3ml培养物中回收转化的Chlorellaellipsoidea。将细胞在液氮中匀浆，重悬于20μl样品负载缓冲液[1mMEDTA、250mMTris-Cl(pH6.8)、4％SDS、2％β-巯基乙醇、0.2％溴酚蓝(bromophenylblue)、50％甘油]，然后煮沸10分钟。将样品以12,000xg离心10分钟，然后将上清液在15％SDS-PAGE上电泳。另外通过SDS-PAGE分离从未转化的小球藻中制备的蛋白提取物。通过标准方法完成Western印迹分析。将通过SDS-PAGE从转化的和未转化的小球藻中分离的蛋白质提取物转移到硝酸纤维素膜上。抗fGH的多克隆抗体的最终稀释度为1∶3,000，用碱性磷酸酶—结合的抗小鼠IgG作为二级抗体。在转化的小球藻中存在20kDafGH，但在未转化的细胞中则没有(见图6)。对一个成功表达系统的要求是以高水平生产外源蛋白质。通过酶联免疫吸附(ELISA)和Western印迹，用纯化的GST、GST-fGH融合蛋白以及来自转化的小球藻的提取物，利用抗GST-fGH融合蛋白的多克隆抗体确定在转化小球藻中表达的fGH的量(见图7)。从1×108个稳定期细胞(在1毫升培养物中总蛋白为400μg)中得到约400ngfGH。该产率等于400μgfGH/升培养的小球藻，估计小球藻的最终细胞计数为1×108细胞/ml。考虑到藻类培养基的低成本，可以用该系统生产真核细胞蛋白质，特别是在药物学上重要的蛋白质。[实施例8]生物学活性检测尽管由于小球藻细胞壁中高含量的纤维素而不能将小球藻直接喂给鱼和甲壳纲动物幼虫，但已用小球藻大量培养含纤维素酶的浮游动物。还知道鱼可通过饮液作用摄取饲料中的蛋白质，有报告认为通过口服重组哺乳动物和鱼生长激素可促进鱼的生长。因此，将4天龄的鲆幼苗分成1000条一组，各装在含200升海水的300升容器中。用轮虫(Brachionusplicatilis)和盐水虾(Artemianauplius)积累生长激素并除去小球藻细胞壁的纤维素。在孵化后将浮游动物饿1天，然后给其提供3×108细胞/ml转化的和未转化的小球藻1小时。Western分析证实在藻类中的fGH在饲养后1小时积累在浮游动物体内；1小时后fGH降解，饲养2小时后消失(见图8)。用轮虫每天喂养鲆幼苗一次，共10天，然后用轮虫和盐水虾的混合物喂养5天，然后用盐水虾喂养15天。轮虫和盐水虾的最终计数分别为10和5个/ml。用转化的和未转化的小球藻营养过1小时的浮游动物将4天龄鲆苗培养30天。饲养10天后测量鱼幼虫的长度，饲养30天后测量幼鱼的长度和宽度。测定从各含1000条鱼的3个同样的箱中随机选出的50条鱼。如图9所示，在10天后鱼的长度有显著差异，在30天后长度和宽度均增加25％(见图10)。尽管上文详细描述了本发明的优选实施方案，应清楚地理解对于本领域技术人员而言显而易见的是，本文教导的基本创造性概念的许多变体和/或改变仍在所附权利要求中表明的本发明的精神和范围内。权利要求1.在微藻中生物合成所需外源蛋白质的方法，所述方法包括下列步骤(i)获得微藻的原生质体；(ii)制备含编码所需外源蛋白质之基因的载体，所述基因源自微藻以外的生物；(iii)将所述载体导入原生质体以得到转化的原生质体；和(iv)培养转化的微藻以生产所需的蛋白质。2.根据权利要求1的方法，该方法还包括在培养步骤后从所述微藻回收所述蛋白质的步骤。3.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括在步骤(iii)与步骤(iv)之间用抗生素筛选转化细胞的步骤。4.根据权利要求1的方法，其中所述方法还包括在步骤(iii)与步骤(iv)之间使转化的原生质体再生细胞壁的步骤。5.根据权利要求3的方法，其中所述载体含有Shble基因作为转化体的选择性标记，且其中抗生素选自腐草霉素、他利霉素、博莱霉素和zeomycin。6.根据权利要求1的方法，其中所述载体含有选自花椰菜花叶病毒35S启动子和衣藻RBCS2基因启动子的启动子。7.根据权利要求1的方法，其中所述微藻是来自海洋和活水的小球藻属，衣藻属、团藻属、Cheatoceros、普哈特属、骨条藻属、舟形藻属、Caloneise、菱形藻属、海链藻属、双眉藻属、Nannochloris、Nannochloropsis、Tetraselmis、杜氏藻属、Spirulina、微孢藻属、Oscillatoria、Tricodesminus、Isochryosis、Pavlova或Dinophyceae中的一种。8.根据权利要求1的方法，其中所述所需的外源蛋白质源自细菌、真菌、病毒、动物、植物或鱼。9.根据权利要求8的方法，其中所述所需的外源蛋白质是鲆生长激素。10.用于在微藻中生物合成所需的外源蛋白质的重组DNA载体，所述载体含有编码所需外源蛋白质的基因和作为转化体选择性标记的Shble基因。11.用于生物合成所需外源蛋白质的转化的微藻，其中该微藻的基因组与所述所需外源基因和Shble基因是整合在一起的。12.根据权利要求11的转化的微藻，其中所述微藻可表达所需的外源蛋白质和Shble蛋白。13.一种所需外源蛋白质，其是在权利要求11或12所述的转化的微藻中通过所需外源基因的表达而生产的。14.一种饲养动物的方法，其采用权利要求11的微藻或权利要求13的蛋白质饲养动物。全文摘要本发明涉及用转化的微藻生物合成所需外源蛋白质的一种经济的方法,即本发明涉及用转化的微藻作为生物反应器的方法,其中通过用含所需外源蛋白质基因的DNA载体转化微藻例如Chorellaellipsoidea的原生质体,然后大规模培养可以经济地生物合成外源蛋白质。具体地说,用腐草霉素抗性的Shble基因作为本发明的选择性标记。文档编号C12N1/13GK1354792SQ00808116公开日2002年6月19日申请日期2000年3月17日优先权日1999年5月28日发明者崔泰辰,金永泰,金大铉申请人:爱尔基因泰克株式会社