专利名称：与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因及其应用。
背景技术：
世界人口不断增长，预期到2050年结束，世界人口可达到60亿。另一方面，世 界20%的可耕土地严重的盐渍化，严重影响了粮食的产量。粮食作物的供给正受到土 地盐渍化的威胁。理解生物抗盐机制对于利用育种和基因工程的方法改良作物耐盐性 是十分重要的。
甘油是重要的轻化工原料，甘油市场供不应求。随着石油能源和可耕土地不断的 减少，化学法生产甘油遭遇瓶颈，产量亦不断减少。化学合成法生产甘油(丙三醇) 的经济效益不断下降。因此发酵法生产甘油的竞争力不断突出。发酵法具有安全性好， 原料丰富易得，设备要求简单的优点。因此利用改良发酵菌株提高甘油产量具有重要 的经济价值。
盐藻(D,"fe/to)广泛分布于盐湖、海洋、盐土等高盐度的环境中，尤其在高 盐水域中是主要种群。盐藻是最耐盐的真核生物，具有十分惊人的渗透调节能力，能 在低至50mM高至接近饱和的盐浓度的环境下生存，可以一次性耐受3-4倍的渗透压 变化。
盐藻能通过调节细胞内甘油的浓度来维持细胞内外的渗透压平衡以抵抗环境中 的盐胁迫。通常情况下，甘油是盐藻体内唯一的渗透剂。盐藻体内的甘油浓度是随着 细胞外的盐浓度呈正相关变化。当盐藻细胞受到高盐胁迫震荡的瞬间，细胞迅速启动 甘油合成途径合成甘油以维持细胞内外的渗透压的平衡，并在90min内就可以完成调 节。盐藻体内积累大量的甘油，并且在极高的盐浓度(>3.5MNaCl)时，细胞内甘 油的浓度可以高达50%。
盐藻甘油代谢途径调控机制的研究是理解盐藻独特的耐盐能力的关键之一。盐藻 甘油合成主要场所是叶绿体。已知盐藻细胞甘油合成途径是磷酸二羟丙酮(DHAP) 催化生成甘油的途径。两个酶参与催化DHAP向甘油的转化，即DHAP首先通过甘 油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)催化转化为甘油-3-磷酸(G3P)， G3P再通过磷酸甘油磷 酸酶(GPP)的催化转化成为甘油。
在酵母中的研究证实，GPDH是甘油合成过程中的关键酶。盐藻中研究发现盐藻中甘油-3-磷酸脱氢酶(GPDH)同样是控制DHAP转化为甘油的关键酶，并且GPDH 活性是盐藻调控甘油合成途径的靶点。因此克隆分析盐藻中GPDH基因是深入理解 盐藻抗盐机制和高积累甘油能力的关键，同时也会为生物耐盐基因工程和通过发酵法 生产甘油提供重要的基因资源。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因。
本发明的目的之二在于提供该基因的编码蛋白。
本发明的目的之三在于提供包含该基因的重组载体。
本发明的目的之四在于提供包含该基因的转化体。
本发明的目的之五在于提供该基因在提高甘油合成能力中的应用。
本发明的目的之六在于提供该基因在提高耐盐能力中的应用。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案
一种与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因，其特征在于该基因具有下列核 苷酸序列之一
(1) .具有SEQ N0 1—2所示的DNA序列；
(2) .与序列表中序列1-2限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相同 功能蛋白质的DNA序列。
上述的与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的编码蛋白，其特征在于该编 码蛋白具有序列表中序列3-4的氨基酸残基序列或者是将序列3-4的氨基酸残基序 列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列3-4的氨基酸残 基序列相同活性的由序列3-4衍生的蛋白质。 一种含有上述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的重组载体。 一种含有上述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的转化子。 一种上述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因在提高甘油合成能力中的应用。
一种上述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因在提高耐盐能力中的应用。
本发明首次从盐藻(D^aZ/e/k WnW&)中分离到两个甘油合成的关键基因 DvGPDHl和DvGPDH2，并首次通过转化酵母细胞证明了这两个基因的功能及其在 提高生物体耐盐能力和甘油合成方面的应用价值，这两个基因在基因工程改良和工业 生产甘油中具有很好的应用前景。
图1为本发明的甘油-3-磷酸脱氢酶基因DvG尸//7和DvG户D//2的编码蛋白 具有SERB-GPDH双结构域，并且含有保守的叶绿体转移肽。
图2为本发明的甘油-3-磷酸脱氢酶基因iX7尸//7和Z)vG户Z)//2基因同源性 分析。其中A是GPDH同源基因分析图，B是SERB同源基因分析图。
图3为本发明的甘油-3-磷酸脱氢酶基因DvG户/W和DvGPD/K基因在酵母 突变体g/^/z/中的功能分析。其中A的功能分析使用了酵母表达载体pAJ401， B的功能分析使用了酵母表达载体pYES2。
图4为本发明的甘油-3-磷酸脱氢酶基因和DvG户D//2基因在不同 盐胁迫下的表达模式。其中A为盐藻在盐振荡下体内甘油合成的模式，B为稳定 生长在不同盐浓度环境下的盐藻体内DvGP//7和DvGPZ)i/2的表达模式，C为 DvOP//7和Zh;G/lD//2在经盐振荡处理后盐藻体内的表达模式。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方 法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)或酵母遗传法实验指南(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Adams A et al编，Cold Spring Harbor Laboratory, 1998 出版)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。 实施例一DvC^D/O和DvG户DH2全长编码区的克隆与分析
提取盐藻总RNA，反转录cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，通过PCR， 利用引物GPDH15'p禾卩GPDH13'p克隆到DvOPD7W，通过引物GPDH25，p禾口 GPDH23'p克隆到DvOPD//2。为了进一步在酵母中证明这两个基因的功能及应 用(实施例三)，通过引物GPDH15'p和GPDH25'p在基因5'端加入克隆酶点五coi /和真核翻译保守序列Kozak;通过引物GPDH13'p和GPDH23'p在基因3'端加 入克隆酶点^w /。
引物序列如下 (1)GPDH15'p (引入五coRI酶切位点和Kozak序歹U):
5'-AGAATTCAGCATGGTCCTAGGGTCATCACC-3， 粗体为￡coR I识别位点，下 划线所示为Kozak序列(2) GPDH13'p (引入，ol酶切位点)5，-ATCTCGAGCCAGTGCATGCTCTTTAAATGAC-3，粗体为^ w I识别位点；(3) GPDH25，p (引入￡coR I酶切位点和Kozak序歹!j):5 ， - AG AATTC AC AATGGTTCTC AAGGG AGGGAG-3 ，粗体为￡coR I识别位点，下 划线所示为Kozak序列；(4) GPDH23 'p (引入屈o I酶切位点)5，-ATCTCGAGTGTTCAAATTGCTTAAATGCAC-3，粗体为I识别位点；对获得的基因进行分析DvOP//7的cDNA全长2525bp，其中ORF为2088bp， 73nt处是ATG， 2158nt处是终止子TAG。 Vector NTI9丄0软件的分析结果显示 最长读码框编码了一个含695个氨基酸的蛋白，蛋白分子量大小为76.2kDa，等 电点为6.42。DvOP/Z2的cDNA全长2759bp，其中ORF为2106bp， 74nt处是ATG， 2177nt处是终止子TAA，最长读码框编码了一个含701个氨基酸的蛋白，蛋白分 子量大小为77.2kDa，等电点为6.73。在Z)vG尸D//2上游59nt处有一个与预测蛋 白序读码框同框的终止子TGA。通过同源比对分析(图2)显示本实验获得了 Z)vG户D/W全长编码序列。实施例二 DvGPDHl和DvGPDH2蛋白结构及同源分析利用NCBI (http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/stmcture/cdd/cdd.shtml)保守结构域分析 系统对DvOPZ)//7和DvGPA/K所编码的蛋白进行分析，结果显示两个基因编码的蛋 白具有独特的SERB-GPDH双结构域(图1)。 DvGPDHl和DvGPDH2在C端有大 约400个氨基酸的GPDH结构域，而相比动植物中同源的GPDH蛋白结构，它们在 N端还具有一个额外的长度为300个氨基酸的SERB结构域。利用Vector NTI9.1.0程序对DvGPHl和DvGPDH2进行同源比对分析。分析结 果显示，它们与藻类中的同源基因具有较高的同源性，如和衣藻CrGPDHl同源性 分别是45.7%和45.3%。与动物或高等植物中的同源性则比较低，如酵母ScGpdlp 同源性分别是19.8%和20.8%，并且同源区段位于DvGPHl禾P DvGPDH2的C端。 DvGPHl和DvGPDH2具有保守的类GXGXXG基序(motif)，该基序是GPDH的辅 酶NADH的结合位点(图2A用方框所示)。另外DvGi3//7和i^OPD//2编码的蛋白 和丝氨酸磷酸酯酶(SERB/PSP)具有一定的同源性，如人源磷酸丝氨酸酯酶HsPSP 同源性分别为24.4%和26.6%，并且同源区段位于DvGPHl和DvGPDH2的N端(图 .2B)。 DvGPHl和DvGPDH2具有保守的类DXDX(T/V、基序(motif)，该SJS是SERB催化反应中磷酰基中间体形成的活性位点(图2B用方框所示)。蛋白信号肽预测(h加:〃www.cbs.dtu.dk/services/)揭示了 DvGPDHl在位于氨 基酸约1-47位处和DvGPDH2在位于氨基酸约1-30位处有保守的叶绿体转移肽序列 特征。进一歩的蛋白定位预领U丄http:〃wolfpsort.org/2结果表明DvGPDHl和DvGPDH2 蛋白定位于细胞的叶绿体中。这两个预测结果显示了 DvGPDHl和DvGPDH2是盐藻 的两个叶绿体型的GPDH。实施例三Z)vG^"W7和ZXWW2在酵母突变体中的功能分析(一) 酵母表达载体的构建将实施例一克隆到的DvOPZ)/W和DvOPD/K利用引入的克隆酶点￡coR I和o I分别构建到酵母表达载体pAJ401 (组成型强表达载体)或pYES2 (半乳糖诱导型表 达载体)中。另外我们还分别构建了只含有GPDH结构域区段(分别命名为 DvGPD/HzlW禾B DvaPDH2ZW)的载体克隆，分析该基因缺失SERB区段后的功 能。DvGPDi7/Z\W由引物GPDHl-GPD5'p和GPDH13'p进行扩增；DvGPDH2ZliV 由引物GPDH2-GPD5'p禾卩GPDH23'p进行扩增。利用引物GPDHl-GPD5'p禾口 GPDH2-GPD5'p在目的基因5'端加入克隆酶点￡coi /和真核翻译保守序列Kozak; 引物GPDH13'p和GPDH23'p在目的基因3'端加入克隆酶点lo I。将PCR扩增得到 产物利用酶位点五coRI和^oI分别定向克隆至酵母表达载体pAJ401或pYES2中。引物序列如下(1) GPDHl-GPD5'p (引入￡coR I酶切位点和Kozak序歹U):5，-AGAATTCACAATGGTGAAGCGTTACAAGGT墨3，粗体为五coRI识别位点，下划 线所示为Kozak序列；(2) GPDH2-GPD5，p (引入￡coR I酶切位点和Kozak序歹ij):5, - AG AATTC AC A ATGGGCTAC A AGGTGACC A-3,粗体为￡coR I识别位点，下划 线所示为Kozak序列。GPDH13'p和GPDH23'p的引物见实施例一。(二) 转化酵母使用LiAc热激转化法将含有Z>OP￡)///、 DvGP"//2、 Z)vGi^OWZiiV、的克隆转化到酵母盐敏感突变体a^/j中。(三) 酵母转化子的表型鉴定所用基本培养基为AP，并加入所需fiSM^^M记为尿嘧啶营养缺陷。 载体为pAJ401的转化子表型鉴定培养基添加2%的葡萄糖作为碳源。转入载体为 pYES2的转化子表型鉴定培养基添加2%的棉子糖作为碳源。所用表型展示培养基以不含NaCl的AP培养基为对照生长条件，含700mMNaCl 的AP培养基为抗盐表型分析生长条件。若使用表达载体pYES2则另外加入2%半乳 糖做为诱导剂诱导外源基因的表达。首先将酵母转化子在AP培养基中培养至OD6Q()=0.6，以5pL为一个滴度，并以 五倍稀释度为系列稀释滴度，在表型展示培养基上展示酵母转化子抗盐表型。结果如 图3所示1)在pAJ401中的组成型强表达启动子(尸G尺启动子)驱动下，DvGi^7/八 "vG/^D/K、 DvG/^/Z/ZliV、 DvG户Z)/^Zi7V都能提高酵母g/^"细胞的耐盐能力，这 表明全长或缺失型DvG尸D历和ZM 尸D//2基因能够增加酵母细胞内的甘油合成，进 而提高酵母细胞的耐盐能力(图3A)，因此所<^/)//7和/)^ /^//2在通过基因工程 提高酵母等生物体内的甘油合成量及增强这些生物的耐盐能力方面具有很好的应用 价值。2)在pYES2中诱导型启动子(041/启动子)驱动下，DvOPDi/7ZW和 DVGi^//2ZW比它们柏应的全长基因能更大程度地提高酵母细胞的耐盐能力，表明 ZM7尸D历ZW和ZM 尸D/72^V比全长基因具有更强的甘油-3-磷酸脱氢酶的酶活(图 3B)，能够更大程度的增加酵母细胞内的甘油合成，从而更大地提高酵母细胞的耐 盐能力，因此缺失型的"vOPD/WZiV和DvOPDi^z^V在上述的应用领域具有更好 的应用前景。实施例四通过Realtime-PCR方法分析盐藻Z vG尸DH/和"vGP"好2的在不同 盐胁迫下的表达模式(一)引物设计用Primer Premier软件在DvG尸D///和DvOPD/f2的3'UTR区域设计合适的特 异性引物用于Realtime-PCR检测。检测ZM 尸D扭的表达所用引物为DvGPDHlRTF 禾口 DvGPDHlRTR;检领U DvG尸D//2的表达所用引物为DvGPDH2RTF和 DvGPDH2RTR ;持家基因i)vJC777V为内参，所用引物为DvACTINRTF和 DvACTINRTR。引物序列如下(1) DvGPDHlRTF: 5'-GTGGCGTTGCTGATGTGA-3'(2) DvGPDHlRTR: 5'-CTCGCGGAACCTGAGAAT-3，G) DvGPDH2RTF: 5'-CAGCATAAGGCAAGGAGATAG-3，(4) DvGPDH2RTR: 5，-TCTTCACAAACCACCACCC-3，(5) DvACTINRTF: 5'-GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC-3'(6) DvACTINRTR: 5'-CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA-3'(二) 模板的制备我们抽取了长期生长在不同NaCl浓度培养条件下的盐藻细胞总RNA以及经受 0.5M NaCl—1.5M NaCl高盐震荡后不同时间点的盐藻细胞总RNA，将抽提的总RNA 反转录为cDNA。以这些cDNA为模板进行Real-time PCR分析。(三) Real-time PCR法检测DvOPD/W和DvOPZ)//2表达模式Real-time PCR分析使用SYBR Green染料法，DNA Engine Option2 System (MJ Research)分析系统，标准曲线法定量分析。高盐震荡环境下，盐藻通过胞内快速积累甘油来平衡细胞内外渗透势差别(图 4A)。通过Real-time PCR方法分析DvGilD//7和DvGPD/K在不同盐胁迫下在转 录水平调控甘油合成的模式。首先分析了在不同盐浓度(0.5M、 1M、 2M、 3M、 4M、 5MNaCl)稳定生长条件下基因的转录水平(图4B)，发现0.5M至2M NaCl生长 环境下，随着盐浓度的提高和细胞所需甘油量的增加，基因的mRNA表达水平量随 之上升；当环境中NaCl浓度高于3M时，基因的mRNA表达水平受到了产物甘油 的反馈抑制调控，出现了一定程度的下降。我们同时发现在高浓度的NaCl环境下， ZM 尸Dffi比Z)vGPZ)/W对于甘油反馈抑制调控表现的更为不敏感。然后我们又分 析了 0.5M—1.5M盐震荡条件下不同时间段基因表达的变化模式(图4C):DvOPD/^ 禾口DvOPD/^基因的表达短期内("vG尸DT^在lhr， "vG尸D/i2在1.5hr)受到高盐 诱导，中期则受到产物甘油的反馈抑制，后期(72hr后)开始恢复上调。同样我们 发现，DvG户Di^比LM^PD/W对于甘油反馈抑制调控表现的更为不敏感。基因的 表达分析显示DvGPD/f7和DvOPD/K调控了甘油的合成；DvOPD//2具有对甘油 反馈抑制调控不敏感的特征，这种特性对于细胞积累大量的甘油是有利的。本发明通过定向克隆将这两个基因构建到酵母通用表达载体pAJ401及pYES2 中，转化酵母突变体g;^7A该突变体不能合成足量的甘油作为胞内渗透调节物，导 致它不能在高盐环境中生长。将得到的酵母转化子在含700 mMNaCl培养基上分析 其耐盐能力，结果显示酵母细胞的耐盐能力得到明显提高(图3)。该实验验证了 Z)VGP//7和DvG尸Z)/K的功能，并证明这两个基因能够提高酵母等生物合成甘油的能 力及耐盐的能力，同时也证明这两个基因在通过基因工程提高生物的甘油合成产量以及耐盐能力方面具有应用价值。本发明还通过分析两个基因所编码蛋白质的保守结构 域，发现他们具有SERB-GPDH双结构域(图1);并进一步通过功能域缺失对两个 基因进行改造，即移除SERB结构域区段后，获得的两个基因的衍生物能更大的提高 酵母体内的甘油合成量及对外界盐胁迫的耐受能力，这表明这两个基因衍生物的蛋白产物具有更强的酶活，因此也具有更好的应用前景。本发明还测量了盐藻在盐振荡条件下甘油积累的模式，并利用real-time PCR技 术分析盐藻中Di;G尸/^和DvGPDi/2在不同盐胁迫下的转录模式，揭示这两个基因 在盐藻快速大量合成甘油抵抗高盐胁迫过程中的基因表达调控模式(图4)，为通过 提高这两个基因的转录提高生物体内的甘油合成及提高生物体的耐盐能力提供了理 论依据。<110> 上海大学<120>与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因及其应用<160> 16<210> 1<211> 2525<212> DNA<213> 盐藻属(Z)w""//e//a v/rWs)〈400〉 1161 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 薩 1141GCAAGACCAA GCATGATCCT AGGGTCATCA CCCACACTCC CTCACGCATC GCACCCTGCCAGCAGTGTCA CCCGCGTCCT TCAGCCCCTG CGAGCTGCGT CCCTGGAGCA GGGAGTCACGATGAACCTGC CTGATACAAT GGCCGAGCGT CTTGCCATCA TGAACTGCTC CCCAGAAGACCTGGTGAGTG CCCTGCGCAC CAGGGGCAAA GAGGTGTTTT TGACGGGTGG TTTCAGGGAACACGATGTGG111201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2皿 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521GGCATCTGCA AGCAGCTGGC AGCAGCTCGC GTGGTCAAAC GGGACGCCAA GGCCATCAGCCGTGAAGAGC TTTCGGAGGC TGTGGTGGCG TACTCCAGCC GCGATGCCGG CATCCTCTGGGCTGATGTGA TCGCGTCTAG CTATGGCGGC CGCAACAGGC GTGTGTCAGA GGCGTGGTGCCTTGATTGAG CCATGGAGAAGTCTCTCCAG ACATGATTCT CAGGTTCCGC GAGGCAGTTT CAATGAAGTC ATTAAAGTAGTGCCCAGAGG AGAGCTGTAT GCACAGGTTC TGTATGATTA GTGGCTTTCG TCCAGCAGCT GCAGCACTGG GTTTCATCAT TGCATGTGGG GCCTGGTGGT GAGGCTCAGA TGAACTACCAAAAAA<210〉 2<211> 2759<212> DNA<213> 盐藻属(Dw朋/Ze〃a w'nD<400> 2421 CTTCGATGTG GACCGCACTG TGACCACGGA CGCTTCCGTG GGCCTGCTGG CCAAGTTCAT661 AGCACTGAAG GCACGCGGCG TGGAGGTGTT CCTGATCTCC GGTGGCTTCA GGGAGATGGC1021 GGCAGACTGG TTCATTCGCT CATACGACGA GCTCATGAAG AGCCTGAAGC GCTACAAGGT1081 GACCATGGTG GGCTCTGGCG CATGGGCATG CACTGCAGTC CGCATGGTGG GACAGAGCAC1321 GGCGTGCAAG GACGCTGACC TGCTCATCTT CTGCGCCCCC CACCAGTTCA TGCACGGCAT1621 GCTGTTCCAG CGCCCCTACT TTGCCATCAA CCTGCTGGCA GATGTGCCTG GCGCTGAGAT1801 1861 1921 簡 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701AAGGAACGAG GGCGATGAGG TCGTGACCTT CGAGACCCTT GAGAGGGACA TGCTGTCCGGTGGTTGATGC CAGACCTCGA TTGCGCACTG AGCTGTATTT CTAGCAGAAC TGCTGTTCAACAATTTGAAC AGCCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAA<210> 3<211> 695<212> PRT<213> 盐藻属(Dw朋/Ze〃a<400> 361 SNPRFSSSSN SSTSSSSSVT RVLQPLRAAS LEQGVTAPLP PRPQGPTDTV LELWQAADAV 121 VFDVDSTITR DDTLDSLGKF MGLKDEVLRH EAMDGTMNLP DTMAERLAIM NCSPEDIQQF 181 LLEHPPKERL VPGVEELVSA LRTRGKEVFL TGGFREVVLP IAEHLGIPAK NVFANSMSWE 241 LDDKGQPVRL KEFDMTHPAT HSQGKPQALA RIRRQYPYNN VVMIGDGISD LEAVNTTGGA361 ASRSPASSFV KDVTMWVHEE KHSGRNLTEY INEHHDNPIY LPGVSLGENV VA刚NLIDAA421 RDADLLIFCA PHQFMHGICK QLAAARVVKR DAKAISLTKG MRVRAEGPQL ISQMISRILG 481 IDCSVLMGAN IAADIGREEL SEAVVAYSSR DAGILWQQLF QRPYFAINLL PDVPGAEISG 541 601661 LDFPLFTTIH RIIHGEVSPD MILRFREAVS MKSLK*<210> 4<211> 701<212> PRT<213 > 盐藻属 (Z)w"a//e〃(3 w>)〈400〉 41 MLLKGGSVNP LPCAPQRPRA AAAQPRAACR AVGRPQAPLL GARKQLLSSP CFAKEQSPLL 61 RSGQQHARGD ALVAHAAEVG QRPTIPAGDS WANHPPPPTT PSEQVLDLWQ QADAVCFDVD 121 181241301 FICFGGVMER PAVASQADWF IRSYDELMKS LKRYKVTMVG SGAWACTAVR MVGQSTAEAS 361 421481 CSVLMGANIA GDIAREELSE AVIAYANRES GLLWQQLFQR PYFAINLLAD VPGAEMCGTL 541 KNIVAVGAGM GDGLGCGSNS KASILRQGLS EMRKFCKFIS PTVRDDTFFE SCGVADLIAS 601 SYGGRNRKVA EEWARR脂EG DEVVTFETLE RDMLSGQKLQ GVLTSDEVQE ILHARGWELE 661 FPLFTTINRI IHGEVPVNML LRYREACKMP GSKKKRQASP A*<210> 5<211> 30<212> DNA<213> 盐藻属 (Dw"a//e〃a<400〉 5AGAATTCAGCATGGTCCTAGGGTCATCACC<210> 6 <211> 31 <212> DNA<213> 盐藻属(D朋(2/z'e〃a<400> 6ATCTCGAGCCAGTGCATGCTCTTTAAATGAC<210> 7 <211> 30 <212> DNA<213> 盐藻属(Z),afe〃wW血) <400> 7AGAATTCACAATGGTGAAGCGTTACAAGGT<210> 8 <211> 30 <212> DNA<213> 盐藻属(D,a/Ze〃(3 v/".cfo)〈400> 8AGAATTCACAATGGTTCTCAAGGGAGGGAG<210> 9<211> 30<212> DNA<213> 盐藻属(Dw朋"e〃a Wr/tfo)〈400〉 9ATCTCGAGTGTTCAAATTGCTTAAATGCAC<210> 10 <211> 29 <212> DNA<213> 盐藻属(Z)w"a/Ze〃a 〈400〉 10AGAATTCACAATGGGCTACAAGGTGACCA<210> 11<211> 18<212> DNA<213> 盐藻属(Dw"a/z.e〃a Wr/cfo )〈400〉 11GTGGCGTTGCTGATGTGA<210> 12<211> 18<212> DNA<213> 盐藻属 W"'cfo)〈400〉 12CTCGCGGAACCTGAGAAT<210> 13<211> 21<212> DNA<213> 盐藻属(Dw"a/z'e〃a wW血)<400〉 13CAGCATAAGGCAAGGAGATAG<210> 14 <211> 19 <212> DNA<213> 盐藻属(D皿a/!W/a〈400〉 14TCTTCACAAACCACCACCC<210> 15 <211> 21 <212> DNA<213> 盐藻属(Z)w"a//e〃<3 v/"'tfo)〈400〉 15GCCACTGCTTTAGCTGTTTGC<210> 16 <211> 22 <212> DNA<213> 盐藻属(Dw"""e〃a WrzD 〈400〉 16CCTCATGCTCCCAGATGTTCTA
权利要求
1.一种与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一(1).具有SEQ NO 1-2所示的DNA序列；(2).与序列表中序列1-2限定的核酸序列具有95％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
2. —种根据权利要求1所述的与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的编码 蛋白，其特征在于该编码蛋白具有序列表中序列3-4的氨基酸残基序列或者是 将序列3-4的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 且具有与序列3-4的氨基酸残基序列相同活性的由序列3-4衍生的蛋白质。
3. —种含有根据权利要求1所述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的重组载体。
4. 一种含有根据权利要求1所述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因的转化子。
5. —种根据权利要求1所述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因在提高甘油合成能力中的 应用。
6. —种根据权利要求1所述的甘油-3-磷酸脱氢酶基因在提高耐盐能力中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种与甘油合成有关的甘油-3-磷酸脱氢酶基因DvGPH1和DvGPDH2的cDNA序列及所编码蛋白质的氨基酸序列。本发明涉及DvGPH1或DvGPDH2基因的表达载体转入酵母gpd1Δ细胞中，该酵母细胞在含盐的培养基上表现出耐盐表型，从而证明了这两个基因能够增加酵母细胞内的甘油合成并提高酵母细胞的耐盐能力，同时也证明了这两个基因在通过基因工程手段提高酵母等生物体内的甘油合成量及增强这些生物的耐盐能力方面具有很好的应用价值。本发明通过缺失DvGPH1或DvGPDH2基因的部分序列，进一步提高了这两个基因产物的甘油-3-磷酸脱氢酶活性和催化合成甘油的能力以及相应酵母转化子的耐盐能力，因此这两个缺失型的基因衍生物在上述应用领域具有更好的应用前景。此外，本发明证明了DvGPH1和DvGPDH2基因在盐藻体内的表达受盐胁迫的诱导，表明这两个基因是盐藻合成甘油的关键酶，为将这两个基因应用于上述领域进一步提供了理论依据。
文档编号C12N1/19GK101319221SQ20081004001
公开日2008年12月10日 申请日期2008年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者何云霞, 孟祥宗, 宋仁涛, 男 张, 许政暟 申请人:上海大学