专利名称：新型保护性培养物及其在保藏食品中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有乳酸菌的新型保护性培养物，它可用于保藏在冷藏条件下仅保持有限时间的食品和饲料。如果冷藏链中断，或者如果没有坚持低温，这些保护性培养物能够抑制对消费者有害的细菌生长。
某些食品和饲料，例如各种肉制品，必需在低温地方贮藏直到消费者食用或制备，即在低于7-8℃的温度下，以便它们保持可食性。当为这类在冷藏条件下仅保持有限时间的食品或饲料时，即使仔细生产，仍不可能排除对消费者有害的细菌通过污染的原料或者通过初期生产阶段或最终生产阶段的污染进入这些食品或饲料的可能性。
对消费者有害的细菌在本发明中的含义是，可以产生细菌性食品中毒的细菌。一方面，这些细菌包括可能已经在食品或饲料中形成毒素的产毒素细菌。食用带有毒素的食品和饲料之后可能导致毒素感染，例如导致疾病。另一方面，细菌性食品中毒可能是由于可以在食品或饲料中繁殖并由此进入胃肠道的毒素感染菌引起的(G.Seidel和J.Kiesewalter细菌性食品感染和中毒(Bacterial FoodstuffInfections and Intoxications).BerlinAkademie Verlag，1992)。
大多数因细菌引起的食品中毒仅发生在食用的食品或饲料中病原体达到相对高的病菌密度时(J.Krmer食品微生物学(Foodstuff Microbiology).StuttgartUlmer，1987)。如果冷藏链中断或者没有保持所述的冷藏温度的话，食品或饲料中的感染剂量(产生疾病所需的病原体的最小病菌量)通常超标。特别危险的是，在食品或饲料中没有产生消费者能够觉察的任意感觉变化的情况下，产毒素和/或毒素感染菌的感染剂量可能超标。因此理想的试剂是，如果冷藏链中断或者没有保持所述冷藏温度时，该试剂能够抑制产毒素和/或毒素感染菌在食品或饲料中生长。
尽管有大量提议，但是抑制生长，即降低这些危险细菌的生长速度至令消费者满意，迄今为止在现有技术中还没有成功。
尽管通过大量化学添加剂(参见1995年2月20日的EU DirectiveNo.95/2/EEC)或者通过物理处理(使用热量、紫外线、离子化射线等)现在可以防止几乎所有食品中的产毒素和/或毒素感染菌生长。然而，消费者对这些手段的接受正逐渐减弱。其原因在于部分地发现了许多添加剂的过敏潜能。而且，不能排除这些防腐剂在食品或体内代谢产生毒性物质的可能性(H-G.Classen，P.S.Elias和W.P.Hammes食品成分和添加剂和严重污染的毒理学-卫生学评价(Toxicological-hygienic assessment of foodstuff ingredientsand additives and serious contaminations)；Berlin and HamburgVerlag Paul Parey，1987)。
其中一个例子是肉制品的腌制，涉及将亚硝酸盐以亚硝酸腌制盐的形式添加到食品中。这种情况下毒理学上可疑的是该亚硝酸盐的急性毒性没有在食品或者甚至在体内可能形成的致癌亚硝胺的大(H.Druckery，R.Preussmann，S.Ivankovic，D.Schmhl，65种不同的N-亚硝基化合物对BD大鼠的向器官性致癌作用(Organotropiccarcinogenic effects in the case of 65 different N-nitrosocompounds in BD rats).Krebsforschung 69，1967，P.102 ff.)。特别希望省去或者减少亚硝酸盐添加剂。然而，在现有技术中，“毫无疑问，不使用任意腌制盐-并且不添加任意其它防腐剂，这样同样不是完全安全的-将使产品的细菌性变质的危险性增加，并且因此危害消费者的健康”(K.Hofmann动物来源的食品中的硝酸盐及其后果(Nitrate and its consequences in foodstuffs of animalorigin).ADI-Verbraucherdienst 31，1986，P.98)。
越来越需要“天然”和“无添加剂”的食品意味着，只有在冷藏情况下仅保持有限时间的食品或饲料的情况下，通过冷却通常仅防止产毒素和/或毒素感染菌的生长。如果不坚持这种安全手段，即如果将冷藏链中断或者不坚持所需的冷藏温度，用户将遭受食品中毒的危险。
使用生物学方法可以对付这种危险性。某些细菌，包括乳酸菌，通过产生大量代谢产物原则上能够抑制其它细菌生长(S.E.Lindgren和W.J.Dobrogosz，FEMS微生物学综述(FEMSMicrobiology Reviews)87149-173(1990)；H.Asperger，sterreichische Milch-wirtschaft 411-22(1986)Attachment1至4卷)。
使用乳酸菌作为令消费者满意的保护性培养物，即用于抑制产毒素和/或毒素感染菌生长，然而仅仅当所用细菌满足以下严格要求时才有可能1.基本前提是其对健康完全无害，即所用细菌必需具有GRAS状态(GRAS通常被认为是安全的；参见Department of Health andHuman Services，Food and Drug Administration，USA″Substancesgenerally recognized as safe；Proposed Rule″(Docket No.97N-0103)，Federal Register Part III；Vol.62，1997)。
2.所用细菌在冷藏温度下必须不呈现可能对消费者具有负面感觉影响的任何代谢活性(例如变酸、影响颜色等)。
3.而且，在整个冷藏期间，该保护性培养物必须含有足够量的潜在代谢活性细菌，以便该保护性培养物能够抑制温度升高时，甚至贮藏结束时产毒素和/或毒素感染菌生长。潜在代谢活性细菌是当温度有任意升高时具有代谢活性的细菌。
4.所用细菌必须在至少7-8℃或之上的温度下抑制产毒素和/或毒素感染菌的生长。甚至当温度快速升高时，在冷藏链中断的情况下，它们例如必须能够抑制在这些条件下非常快地繁殖的肠杆菌科(Entero-bacteriaceae)(例如沙门氏菌(Salmonella))的细菌生长。而且，所用的该保护性培养物必须能够抑制广谱的不同产毒素和/或毒素感染菌。
至今在现有技术中用于保藏食品的细菌不满足这些要求。
在现有技术中所用的一些细菌的抑制效果是基于形成了称之为细菌素的拮抗蛋白或蛋白复合物，它们是由这些细菌特异性产生的，从而抑制某些其它细菌(Nettles和Barefoot.食品保存杂志(Journal of Food Protection)6338 ff，(1993))。这些细菌素对密切相关的种呈现抗菌活性(Tagg等人细菌学综述(Bacteriological Reviews)40722-756，1976))。因此仅非常有限范围的细菌能够受到现有技术中已知的细菌素的抑制，大部分限制在革兰氏阳性菌(L.de Vuyst和E.J.Vandamme乳酸菌菌素(Bacteriocins of Lactic Acid Bacteria).London，Glasgow，NewYork，Tokyo，Melbourne，Madras；Blackie Academic &Professional，1994)。由于细菌素在食品中经常缺少稳定性，在食品中经常仅以低的合成速度产生，并且由于能够产生抗这些细菌素的菌株，因此使用形成细菌素的培养物也成问题(F.K.Lucke，Deutsche Milchwirtschaft 16729 ff.，1994)。
现有技术中使用的其它细菌在冷藏过程中，即7℃以下，已经呈现代谢活性，因此不能用作本发明意义上的保护性培养物(Tanaka，N.等人，食品保存杂志(Journal of Food Protection)48697 ff.，(1985)；Schmidt，U.Fleischwirtsch.，7524 ff.，(1995)；Collins-Thompson，D.L.等人，食品保存杂志(Journal of Food.Protection)45305 ff.，(1982)；Andersen，L.，Fleischwirtsch.，75705-712(1995))。而且，这些已知细菌，用作保护性培养物已经过检测，仅对少数产毒素和/或毒素感染菌呈现抑制效果，因此不能抑制食品和饲料中的广谱产毒素和/或毒素感染菌。
因此本发明的任务是提供保护性培养物，它能够满足上述标准，并且因此用于食品和饲料中完全安全。本发明的另一任务是提供含有所述保护性培养物的食品。
为了解决该任务，提出了新型保护性培养物，打算将它们用于处理食品和饲料。本发明的保护性培养物含有非致病、产乳酸的细菌(乳酸菌)，如果维持冷藏温度，那么它们具有不呈现代谢活性的出人意料的性能，而如果冷藏链中断或者不保持该冷藏温度，则通过产生代谢产物它们可以抑制大量产毒素和/或毒素感染菌的生长。此外，在整个贮藏过程中乳酸菌在食品或饲料中的数量保持近于恒定，这样，即使在贮藏结束时，抑制有害菌的生长也是可能的。通过使用本发明的保护性培养物，消费者因此能够得以保护，抵抗大量产毒素和/或毒素感染菌，例如沙门氏菌。
因此，本发明涉及保藏食品或饲料用的保护性培养物，所述食品或饲料在冷藏条件下保持有限时间，这些保护性培养物的特征在于它们含有具有以下特性的非致病乳酸菌a)在7-8℃以下的温度下，该乳酸菌未显示可觉察的代谢活性；b)在7-8℃以下的温度下，具有潜在代谢活性的乳酸菌的数量在1-2周内降低100倍以下；和c)在至少7-8℃的温度下，该乳酸菌抑制产毒素和/或毒素感染菌生长。
按照一优选实施方案，该保护性培养物含有以下属的乳酸菌乳球菌属(Lactococcus)、小球菌属(Pediococcus)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、威克斯氏菌属(Weissella)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、肠球菌属(Enterococcus)和/或芽孢乳杆菌属(Sporolactobacillus)或其混合物。按照一特别优选的实施方案，该保护性培养物含有以下属的乳酸菌乳球菌属、小球菌属、乳酸杆菌属、明串珠菌属、肠球菌属或威克斯氏菌属、或其混合物，并且按照一更特别优选的实施方案，含有乳球菌属的乳酸菌。
按照另一优选的实施方案，该保护性培养物含有以下种的乳酸菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、鱼乳球菌(Lactococcus piscium)、植物乳球菌(Lactococcus plantarum)和/或棉子糖乳球菌(Lactococcusraffinolactis)或其混合物。
按照一特别优选的实施方案，该保护性培养物含有乳酸乳球菌种的乳酸菌。
按照另一优选的实施方案，该保护性培养物含有以下亚种的乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp.cremoris)和/或乳酸乳球菌乳亚种(Lactococcus lactis subsp.lactis)或其混合物。按照一特别优选的实施方案，该保护性培养物含有乳酸乳球菌乳亚种的乳酸菌。
按照另一优选的实施方案，该保护性培养物含有以下变种的乳酸菌乳酸乳球菌乳亚种二乙酰乳变种(Lactococcus lactis subsp.Lactis Var.diacetylactis)。
按照一特别优选的实施方案，该保护性培养物含有以下菌株的乳酸菌乳酸乳球菌乳亚种1526。该乳酸乳球菌乳亚种1526菌株于1998年9月21日以保藏号DSM 12415保藏在DSMZ德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH)，Mascheroder Weg 1b，D 38124 Brunswick。
按照一特别优选的实施方案，本发明的保护性培养物含有上述不同属、种、亚种和/或菌株的混合物。
按照一优选实施方案，本发明意义内的食品或饲料还包括例如生产食品或饲料所用的动物尸体或原料的准备阶段。
按照一特别优选的实施方案，该食品或饲料为肉和肉制品、鱼和鱼制品、精美色拉和贮存和/或经过预烹制销售的膳食。这些食品或饲料尤其包括下述的食品。
在7-8℃以下的温度下，本发明的保护性培养物的乳酸菌不呈现可觉察的代谢活性。可觉察的代谢活性意思是消费者可以检测的任意代谢活性。尤其是该乳酸菌不呈现生长活性、不呈现变酸活性，它们不产生可能影响食品或饲料颜色的代谢产物。
在7-8℃以下的温度下，能够繁殖的乳酸菌的数量在1-2周时间内优选降低10倍以下，特别优选降低5倍以下。
在至少7-8℃的温度下，本发明的保护性培养物的乳酸菌抑制以下产毒素和/或毒素感染菌的生长，尽管本发明并不限于抑制这些细菌金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、沙门氏菌属(Salmonella)、人致病的大肠杆菌菌株(EIEC、ETEC、EPEC、EHEC)、志贺氏菌属(Shigella)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、空肠弯曲杆菌(Camphylobacter jejuni)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、产气荚膜梭状芽胞杆菌(Clostridiumperfingens)和肉毒梭状芽胞杆菌(Clostridium botulinum)。
按照一特别优选的实施方案，抑制该产毒素和/或毒素感染菌的生长，以便其数量在48小时内增加不超过100倍，优选不超过10倍。
本发明的保护性培养物中的乳酸菌抑制产毒素和/或毒素感染菌的生长，尤其是通过产生以下抗菌活性物质，根据本发明包括乳酸菌可以产生这些物质中一部分或全部以及乳酸菌的抑制潜能也可以其它物质为基础有机酸(乳酸、乙酸、甲酸、苯甲酸)、二乙酰、二氧化碳、导致氧化还原潜能降低的还原物质、过氧化氢、细菌素。
按照一优选实施方案，该乳酸菌通过产生有机酸，优选乳酸，抑制产毒素和/或毒素感染菌的生长。
按照一特别优选的实施方案，在至少7-8℃或以上的温度下，保护性培养物中的乳酸菌呈现可觉察的代谢活性，优选使食品或饲料变酸。
按照一特别优选的实施方案，温度为7℃，低于该温度本发明的保护性培养物中的乳酸菌没有代谢活性以及高于该温度该乳酸菌能抑制产毒素和/或毒素感染菌生长。
本发明的保护性培养物的乳酸菌可以通过以下方法获得1.首先，将乳酸菌分离，该乳酸菌属于上述属、种和/或菌株或其混合物之一。优选从食品和饲料中将它们分离出，然后将该乳酸菌用于其中。这样确保了对食品或饲料的最佳适应性，例如在生长、营养素获取或者乳酸产生方面。
乳酸菌的分离方法在现有技术中为已知(J.Baumgart，W.inHeeschen(Hrsg.)食品卫生手册(Handbook of Food Hygiene).HamburgBehr’s，第1页(1994)，尤其是第4章第216页)。它还描述了可以检测分离的细菌是否真正为乳酸菌的方法。
2.然后在7-8℃以下和之上的温度下检测其生长行为和代谢活性。在7-8℃以下，该细菌应不呈现可觉察的代谢活性，特别是不呈现变酸活性。在至少7-8℃或之上的温度下，该细菌必须呈现可觉察的代谢活性，特别是变酸活性。
还检测能够繁殖的分离乳酸菌的量在7-8℃以下的温度下在1-2周的时间内在一添加这些乳酸菌的食品或饲料中是否降低100倍以下。为此，将特定量的细菌，优选107个细菌/cm2食品或饲料表面，与该食品或饲料一起培养1-2周。然后使用本领域技术人员已知的方法测定细菌数(J.Baumgart，loc.cit.，第5章第74页)。
为了该鉴定，可以优选加入精确表征的分离乳酸菌。为此，有一系列可以获得的方法，例如使用带有指示染色剂的微型化“api 50CHL”培养基的生化鉴定(bioMerieux，Marcy-l’Etoile，France)或者分析其16S rDNA序列(B.Pot等人用于乳酸菌的鉴定和分类的现代方法(Modern methods used for identifiation andclassification of lactic acid bacteria)；于L.de Vuyst和E.J.Vandamme乳酸菌细菌素(Bacteriocins of Lactic AcidBacteria).London，Glasgow，New York，Tokyo，Melbourne，MadrasBlackie Academic & Professional 1991；第2.3章第40页)。
3.然后必须测定经过分离的乳酸菌是否能够抑制产毒素和/或毒素感染菌在食品或饲料中的生长。为此，将食品或饲料中的产毒素和/或毒素感染菌与经过分离的乳酸菌一起培养(还参见实施例8)。优选先在7-8℃以下的温度下，然后在至少7-8℃或之上的温度下进行该培养。如果在将产毒素和/或毒素感染菌与经过分离的乳酸菌一起培养的过程中，产毒素和/或毒素感染菌生长比在没有加入经过分离的乳酸菌时产毒素和/或毒素感染菌培养过程中的慢得多，那么抑制了生长。
本发明的另一目的是属于乳酸乳球菌乳亚种1526菌株的乳酸菌(DSM 12415，参见上面)。该菌株具有以下出人意料的性能在7-8℃以下的温度下不呈现可觉察的代谢活性，而在至少7-8℃的温度下可以抑制产毒素和/或毒素感染菌的生长。它还具有以下出人意料的性能该菌株在正在讨论的食品或饲料中的潜在代谢活性乳酸菌的数量在1-2周内降低至100倍以下。
本发明的另一目的是本发明的保护性培养物在保藏食品和饲料中的用途，该食品和饲料在冷藏条件下可以保持有限时间。它涉及通过使该食品或饲料与该保护性培养物接触，用本发明的保护性培养物处理该食品和饲料，以便该保护性培养物能够抑制产毒素和/或毒素感染菌的生长。
按照一优选实施方案，通过将本发明的保护性培养物施加到食品或饲料的表面上，优选通过喷雾或擦入其上，用本发明保护性培养物处理该产品。按照另一实施方案，通过将该保护性培养物混合和/或搅拌到产品中，将这些产品用保护性培养物处理。
按照一优选实施方案，食品或饲料用含有该保护性培养物(可能的话还有适宜载体)的粉末处理。适宜的载体包括例如糖类，优选单糖或二糖。
按照另一优选实施方案，食品或饲料用含有该保护性培养物的液体介质处理。该液体培养基必须以如下方式配制在处理过程中保证培养物的成活。
按照一特别优选的实施方案，该液体介质为例如生理食盐溶液或饮用水的含水介质。
按照一优选实施方案，食品或饲料用104-108个乳酸菌/g或ml或cm2表面的食品或饲料的乳酸菌量，优选105-106个乳酸菌/g或ml或cm2表面的乳酸菌量处理。
优选在处理过程中，将碳源，优选碳水化合物，特别优选葡萄糖、蔗糖或乳糖加入食品或饲料中。
按照一优选实施方案，处理食品或饲料的本发明的保护性培养物是上述属、种、亚种和/或菌株的混合物。
本发明的另一目的是一种食品或饲料，其特征在于它含有本发明的保护性培养物。为此，该食品或饲料用上述实施方案的保护性培养物处理。
按照一优选实施方案，该食品或饲料选自肉或肉制品，特别优选以下-半鲜肉、内脏、家禽和家禽块，通过向其表面施加本发明的保护性培养物进行处理；-动物尸体、其部分、其去骨部分、切片冷藏肉制品如香肠片、煮熟香肠片、片状煮熟或生腌制品，通过涂抹本发明的保护性培养物进行处理；-绞碎肉制品如肉馅(牛排馅、碎牛排、鞑靼牛排、牛肉馅、猪肉馅、碎猪肉)、肉馅制品、烤香肠制品，通过搅拌其中、或者将本发明的保护性培养物涂到其表面进行处理。
按照另一特别优选的实施方案，食品或饲料选自鱼或鱼制品，特别优选选自鲜鱼(鱼片、鱼段)、烟熏鱼如切片制品、或软体动物和甲壳纲动物，在每种情况下经过处理或者向其表面涂抹本发明的保护性培养物。
按照另一特别优选的实施方案，食品为熟食色拉。特别优选的食品选自以肉、鱼、软体动物、甲壳纲动物和蔬菜为基础的色拉或者色拉浆，按照一特别优选的实施方案，熟食色拉是以蛋黄酱、色拉-蛋黄酱或调味蛋黄酱为基础生产的，在每种情况下，熟食色拉通过将本发明的保护性培养物混合/搅拌其中，或者通过将本发明的保护性培养物涂到其表面上进行处理。
按照另一特别优选的实施方案，食品是预烹制即食膳食。本发明意义内的预烹制即食膳食为经贮藏和/已烹制销售的膳食。通过将本发明的保护性培养物混合/搅拌其中，或者通过将本发明的保护性培养物涂到其表面上对这些膳食进行处理。
按照另一特别优选的实施方案，食品选自乳制品系列，特别优选选自鲜奶、酸奶、凝乳和乳酪。
因此本发明第一次提供了保护性培养物，它在至少7-8℃或以上的温度下抑制产毒素和/或毒素感染菌的生长，而在7-8℃以下的温度下不呈现可觉察的代谢活性。本发明的保护性培养物可以直接用于打算为人或动物使用的食品或饲料中，它们在冷藏条件下仅保持有限时间，因此它们不使消费者致病。
下面使用附图、表格和实施例解释本发明。
图1乳酸乳球菌乳亚种1526在真空包装的香肠片中在冷藏(6℃)3周，之后模拟中断冷藏链(48h/22℃)的过程中的行为。左手y-轴代表乳酸乳球菌乳亚种1526的菌密度(1og KbE/cm2)，同时右手y-轴代表试验过程中香肠中的pH值。试验时间用x-轴表示。香肠片经真空包装，外包装膜由OPP/SIOx/PE制成。样品经照射时，以1300 lux照射样品，真空包装的样品与荧光管之间的距离为40cm。
图2在模拟中断该冷藏链(22℃/48h)的过程中乳酸乳球菌乳亚种1526对沙门氏菌集合体的抑制。y-轴代表菌密度，而x-轴代表实验时间。
图3在不适宜冷藏(10℃)和接着模拟中断该冷藏链(22℃)的过程中乳酸乳球菌乳亚种1526对沙门氏菌集合体的抑制。y-轴表示该细菌的菌密度，x-轴表示试验时间。
图4在模拟中断该冷藏链(22℃/48h)的过程中乳酸乳球菌乳亚种1526对金黄色酿脓葡萄球菌金黄色酿脓亚种的抑制。根据保护性培养物的接种密度和葡萄糖的加入量显示抑制活性。y-轴代表这些葡萄球菌的菌密度，x-轴代表试验时间。
图5在模拟中断该冷藏链(22℃/48h)的过程中乳酸乳球菌乳亚种1526对蜡样芽胞杆菌的抑制。根据保护性培养物的接种密度和葡萄糖的加入量显示抑制活性。y-轴代表这些蜡样芽胞杆菌的菌密度，x-轴代表试验时间。
图6在模拟中断该冷藏链(22℃/48h)的过程中乳酸乳球菌乳亚种1526对产气荚膜梭状芽胞杆菌的抑制。根据保护性培养物的接种密度和葡萄糖的加入量显示抑制活性。y-轴代表这些梭状芽胞杆菌的菌密度，x-轴代表试验时间。
实施例当为除真空包装的产品外可考虑的松散包装的样品时，这些细菌只是从试验样品内部无菌地分离的部分分离的。
将约5-10g重的试验片放置于90ml无菌林格溶液(Unipath GmbH，D-46467 Wesel，BR 52)中，根据其性质用-Ultra-Turrax(T 25，JANKE & KUNKEL公司/Staufen)在13500 RPM下粉碎2分钟或者在Stomacher(LabBlender 400，SEWARD-MEDICAL/London)中粉碎10分钟并将其悬浮。各在9ml无菌林格溶液中用由此得到的悬浮液制备连续的稀释物系列，由稀释级10-4-10-8，各将100μl展开到Chalmers(改进的)和MRS培养基(培养基参见表2)上。在30℃下在厌氧罐中进行培养(Unipath，HP 11)，其中使用AnaeroGen(Unipath，.AN 35)产生厌氧气氛。
3-4天之后对于每个产品从培养基中最多取出5个菌落，以肉眼形态学为基础区别。当为Chalmers培养基时，特别要考虑以高晕圈直径表征的那些菌落(脱色、澄清)。这样可以判断强酸形成的信号。将取出的培养物悬浮在5ml的MRS肉汤培养基中并在30℃下厌氧培养48小时。培养2天之后，如果出现明显浑浊，将稀释涂片施加到Chalmers和MRS。相应培养(4天/30℃/厌氧)之后，取出单一菌落并将由此产生的纯培养物再在MRS肉汤培养基中培养。以冷冻制品将这些分离物放置在菌株收集物中。为了生产一制品，将新培养的纯培养物展开到一MRS培养基上并根据已经所述的条件进行培养。4-5天之后，用1.5ml酪蛋白胨-黄豆粉胨溶液USP(Unipath，CM 129)将该细菌包被冲洗掉并将其引入6ml无菌脱脂奶粉溶液(Unipath，L 31)中。混合之后，将这些细菌悬浮液放置在培养管中并在-20℃下深度冷冻贮藏。实施例2以一般特性将分离的乳酸菌菌株分类以革兰氏反应、过氧化氢酶和氧化-发酵试验为基础，根据在相应培养基(MRS，Chalmers，Rogosa)上的生长行为，还以其显微和肉眼的形态学评价为基础，将菌株收集物中包含的分离物粗分类。革兰氏阳性反应、过氧化氢酶阴性试验、发酵碳水化合物裂解和在改进的Chalmers培养基上的菌落形态学(通过酸形成晕圈)被认为这些分离物可能属于乳酸菌种群的一般特性(Baumgart，J.等人，loc.cit.，第4.8章第245页)。另一方面，在OF试验中由葡萄糖形成气体、显微镜成像和在Rogosa培养基上的生长行为已经提供了其属于某一属的指示(Baumgart，J.等人，loc.cit.，第4.8章第245页)。革兰氏反应在新培养的培养物(表面菌落)上进行革兰氏染色。将ColorGram2试验试剂盒用于该染色(bioMerieux/Marcy-l’Etoile，France)。为了检验每种情况的染色行为，将革兰氏阳性(枯草杆菌)和革兰氏阴性(大肠杆菌)培养物同时处理。过氧化氢酶试验将待测定的分离物表面菌落用接种针取出并用3％过氧化氢溶液(Bactident Catalase，Merck，11351)涂布到一载玻片上。通过形成气体显示存在过氧化氢酶。氧化-发酵试验按照Hugh，R.和Leifson，E.，J.Bact.，6624 ff.(1953)的OF试验检测该细菌分离物是否利用葡萄糖发酵形成酸和可能的气体。使用无碳水化合物的OF-基培养基(Merck，10282)作为试验培养基，在高压灭菌之后向其中加入10％经过无菌过滤的葡萄糖溶液(将100ml加入到1升培养基中)。在每种情况下将用接种针取出的纯培养物用刺穿法接种到2只填充该培养基的小管中。接种之后将2只小管之一覆盖手指宽度的无菌石蜡油，从而将氧隔离。在37℃下培养2-4天之后，当发酵利用了葡萄糖时，在2只管中使用溴代麝香草酚蓝指示剂都可以观察到颜色变化。此外，在评价过程中，注意可能地气体形成(在培养基柱中的气泡和/或缝隙)和可能地移动性(培养基整个群集)。分离物的生化鉴定使用微型化的染色系列(Buten Reihe)api 50 CHL bioMerieux，Marcy-l’Etoile，France培养基进行分类为乳酸菌的分离物的生化鉴定。在该api 50 CHL系统中，使用49种碳水化合物检测代谢。所得生化图谱用为此目的可以获得的APILAB Plus软件解释。
在MRS肉汤培养基中将待鉴定的分离物从冷冻培养物中培养出，离心，然后放置在林格溶液中。使用McFarland Standard 2.0(bioMèrieux，70900)调节试验所需的接种物。试验条的微量管用100μl细菌悬液接种，覆盖无菌石蜡油并在潮湿室中在30℃下培养，在24小时和48小时之后，评价微量管，当因发酵引起溴代甲酚紫指示剂变化时判断为阳性。
相应试验时间之后，以肉汤培养基浑浊为基础或者以沉淀为基础确定细菌的繁殖。而且，测定培养液的pH值，从而测定分离物的变酸活性。在6℃下没有显示生长/变酸的培养物判断为阳性。另一方面，在15℃下必须清楚地出现繁殖，并且培养液的pH值必须在5.0以下。
显微镜形态学随培养条件不同有很大变化。就一种制品中可能出现的两种形式，该描述从“球菌样”到“短杆状”变化。这些细菌主要以链状出现，有时成对。当按照冷冻培养法培养时该培养物显示出优良的活力。在30℃下24小时之后在肉汤培养基(MRS肉汤)中达到超过109 KbE/ml的菌密度。
使用来自bioMerieux的api 50CH快速试验的生化鉴定表明具有98.4％相同性的“乳酸乳球菌乳亚种”作为首先选择的门类。由在Brunswick的德国微生物和细胞培养物保藏有限公司(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH inBrunswick)进行的DNA测序分析证实了生化相同性。用具有最大可变性范围测序的16S rDNA序列相似性研究表明与乳酸乳球菌乳亚种99.8％的相同性。葡萄糖发酵的最终产物为具有L(+)-构型的乳酸。此外，由葡萄糖、果糖、甘露糖和乳糖以及核糖、海藻糖和蔗糖也可以形成乳酸酯。
从均质样品中取出1ml并吸移到9ml林格溶液中。样品的稀释倍数是以所希望的细菌数为基础的。从单一稀释阶段，或者取出100μl用于表面培养，或者取出1ml用于倾注培养，并按照相关方法展开到相应培养基上，或者与仍然为液体的培养基混合。用于各组细菌的培养基和相应培养条件列于实施例6和7中。
为了测定每种的细菌数，使用至少2个样品，每个经过两级稀释。由每个试验沉淀物所确定的细菌数，通过算术平均确定菌密度。及时错开重复试验，将不同的样品添加物用于该项试验。如果相同试验沉淀物获得的菌密度的差超过log 1([log KbE试验1-log Kb试验2]＞1)，那么必须重复该试验。
所用培养基、用作卫生学危险性细菌的试验细菌的细菌数测定的方法学和培养条件示于表1。
表1
1)使用来自沙门氏菌病全国索引中心的以下沙门氏菌肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)(Se 125/94 Lysotype 8/7，Se203/94 Lysotype 8/7，Se 315/94 Lysotype 4/6)、巴拿马沙门氏菌(Salmonella panama)(SZ 1107/93，SZ 1249/93，SZ 2365/93)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)(SZ 218/94，Sz 235/94，SZ 284/94)实施例7乳酸菌菌株的培养在开始试验时将实施例1-3中归类为阳性的乳酸菌菌株在30℃下各10ml MRS肉汤培养基(Unipath，CM 359)中培养24小时。在6℃下冷藏最多10天之后，从该培养肉汤中取出100μl细菌悬液并加入到10ml MRS培养液中重新培养。第二次培养(30℃/24h)之后，以8,000 RPM持续10 min将菌块离心出(Biofuge 28 RS，HERAEUS SEPATECH公司/Osterode)。然后倒出上清液并用等量的无菌林格溶液将沉淀物悬浮。在相同条件下将细胞悬液再次离心，除去上清液并且再次加入等量的无菌林格溶液。由此提纯的培养物在冷藏条件(6℃，最多7天)下贮藏直到使用，并在测定菌密度之后加入到香肠样品中。
为了测定菌密度和/或检测细菌，使用经过改进的Chalmers培养基。将相应稀释物添加到倾注培养基上，并在30℃下培养3-5天。
表2
1)根据Chalmers改进的培养基为了测定乳酸菌的菌落数，使用按照Chalmers的选择性培养基，其改进的组成根据Vanos V.和Cox L.Food Microbiol.3233 ff.(1986)乳糖 20.0g葡萄糖 20.0g大豆-胨 3.0g肉膏 3.0g碳酸钙 20.0g琼脂 15.0g.
中性红 0.5ml(1％)蒸馏水 加至1.0L高压灭菌(121.1℃/15min)之后，将1ml无菌过滤的多粘菌素-B-硫酸酯(Unipath)加入冷却到约45℃的培养基中。
2)通过用10％乳酸溶液(UNIPATH SR21)变酸至pH为4.0，使得培养基的选择性提高。
在切实可行的条件下进行这些试验。为了模拟涂敷感染，在涂敷到切割表面上之后，用刮刀将带有致病菌的悬液展开。通过切片机的香肠的污染，如文献中所述(Schmidt，U.和Gardill，E.，肉类研究联邦研究所年度报告(Annual Report of the Federal ResearchInstitute for Meat Research)，S.C.25(1986))使得分布非常不均匀。对此刀片在切的过程中已将大部分细菌蹭掉，特别是边缘地方，对因此限定的相对大的区域(＞1cm2)有时可得出在其中没有试验菌出现的结果。
然后使用压缩空气通过喷嘴喷涂保护性培养物。通过喷雾细菌悬浮液使得细菌均匀分布到该表面上。只有保护性培养物均匀分布才能够在整个表面上得到最佳抑制效果。为了防止一些致病菌粘附到包装膜上并因此不能测出，在每种情况下将另一香肠片放在污染过的香肠的上面。接着将样品真空包装并在相应温度下贮藏。由于表面对这些微生物试验特别重要，因此在以下试验中菌密度按面积给出[KbE/cm2]。
图1显示了在真空包装的香肠片中乳酸乳球菌乳亚种1526在6℃下冷藏3周，之后模拟中断该冷藏链(48h/22℃)的过程中的行为。A)沙门氏菌集合体的抑制如果不保持所需的低温，那么沙门氏菌属繁殖非常快。因此这些乳酸菌分离物的筛选主要针对其对沙门氏菌属的拮抗效果。通过在不同葡萄糖浓度、不同的乳酸菌培养物的接种密度下确定乳酸乳球菌乳亚种1526对沙门氏菌集合体(由9种野生菌株组成，参见表1)的抑制作用，在真空包装的香肠片中测定抑制对碳源浓度和保护性培养物的播种密度的依赖性。
这些未腌制的香肠样品用总共4.4×104沙门氏菌经“涂敷感染”，测定接种密度显示覆盖率为70％，相应的实际沙门氏菌密度为700KbE/cm2。然后以106KbE/cm2的密度喷上乳酸乳球菌乳亚种1526。将0.7mg/cm2的葡萄糖量喷在保护性培养物悬液的表面上。大约获得106KbE/cm2的所需乳酸菌密度(1.1×106KbE/cm2)。将喷过的片用另一片覆盖并真空包装。然后将这些样品贮藏在6℃下的冷恒温箱中。14天之后将其温度升高到22℃，模拟中断该冷藏链。
在6℃下冷藏过程中，沙门氏菌和保护性培养物的菌密度及其pH值仅有轻微变化(图2)。温度升高到22℃之后，如所预料的，没有保护性培养物的样品中的沙门氏菌的数量上升。与此相反，有保护性培养物的样品明显变酸。在24小时之后，测定表面pH值已经为4.72。由此很清楚地抑制了沙门氏菌。在首先的24小时中，细胞数仅略微增加，从170增加至900 KbE/cm2。再过24小时之后，仍然可以检测到平均值270 KbE/cm2。因此该细菌数水平低于接种密度700 KbE/cm2(参见图2)。
在22℃的温度下进行至今所述的试验，从而模拟中断该冷藏链。然而，如果所需冷藏温度超过7℃，那么也可能存在微生物卫生危险性。因此在10℃的温度下进一步进行研究。在这些试验中，沙门氏菌的所需接种密度合计为103/cm2；实际发现的密度为1.36×103KbE/cm2。以103KbE/cm2的菌密度接种该乳酸菌(图3)。此外，使用0.7mg/cm2葡萄糖。
图3显示了保护性培养物的变酸活性以及有和没有加入保护性培养物的样品中沙门氏菌的生长行为。没有保护性培养物的沙门氏菌菌群能够快速繁殖。在有保护性培养物的样品中，乳酸乳球菌乳亚种1526在第7天已经达到最大细菌数5.9×107KbE/cm2；进一步该测定时细胞数略有降低。在第一周，pH值明显降低。在第7天，在表面上测定的平均值为5.02，14天之后值达到4.76。在有保护性培养物的情况下，贮藏在10℃下时沙门氏菌仅能微弱繁殖。在第14天，测定沙门氏菌的数量仅为6.1×103KbE/cm2。贮藏14天之后，将温度升高到22℃。然而，由于乳酸菌的优势，沙门氏菌不再能繁殖。B)金黄色酿脓葡萄球菌的抑制按照A)中用沙门氏菌的试验中所述的方法进行乳酸乳球菌乳亚种1526对金黄色酿脓葡萄球菌的对抗效果的研究试验。试验结果示于图4。图4清楚地显示了，如果中断冷藏，乳酸乳球菌乳亚种1526能够大大地降低金黄色酿脓葡萄球菌的生长。C)蜡样芽胞杆菌的抑制按照A)中用沙门氏菌的试验中所述的方法进行乳酸乳球菌乳亚种1526对蜡样芽胞杆菌的对抗效果的研究试验。试验结果示于图5。图5清楚地显示了，如果中断冷藏，乳酸乳球菌乳亚种1526能够完全防止蜡样芽胞杆菌的生长。D)产气荚膜梭状芽胞杆菌的抑制按照A)中用沙门氏菌的试验中所述的方法进行乳酸乳球菌乳亚种1526对产气荚膜梭状芽胞杆菌的对抗效果的研究试验。此外向该保护性培养物中加入0.5％葡糖酸-δ-内酯(W/V)。试验结果示于图6。它清楚地显示了，在有葡糖酸-δ-内酯的情况下，如果中断冷藏，乳酸乳球菌乳亚种1526能够抑制产气荚膜梭状芽胞杆菌的生长。
权利要求
1.保藏在冷藏条件下可保持有限时间的食品或饲料用的保护性培养物，其特征是，它们含有具有以下特性的非致病乳酸菌a)在7-8℃以下的温度下，该乳酸菌未显示可觉察的代谢活性；b)在7-8℃以下的温度下，具有潜在代谢活性的乳酸菌的数量在1-2周内降低100倍以下；和c)在至少7-8℃的温度下，该乳酸菌抑制产毒素和/或毒素感染菌生长。
2.如权利要求1的保护性培养物，其特征在于该乳酸菌属于以下属的乳酸菌小球菌属、乳酸杆菌属、明串珠菌属、威克斯氏菌属、肠球菌属和/或乳球菌属。
3.如权利要求2的保护性培养物，其特征在于该乳酸菌属于乳球菌属。
4.如权利要求3的保护性培养物，其特征在于该乳酸菌属于以下种的乳酸菌乳酸乳球菌、格氏乳球菌、鱼乳球菌、植物乳球菌和/或棉子糖乳球菌。
5.如权利要求4的保护性培养物，其特征在于该乳酸菌属于乳酸乳球菌种。
6.如权利要求5的保护性培养物，其特征在于该乳酸菌属于以下亚种的乳酸菌乳酸乳球菌乳脂亚种和/或乳酸乳球菌乳亚种。
7.如权利要求6的保护性培养物，其特征在于该乳酸菌属于乳酸乳球菌乳亚种。
8.如权利要求7的保护性培养物，其特征在于该乳酸菌属于乳酸乳球菌乳亚种1526菌株(DSM 12415)。
9.如权利要求1-8的保护性培养物，其特征在于在至少7-8℃或以上的温度下该乳酸菌通过产生有机酸抑制产毒素和/或毒素感染菌的生长。
10.如权利要求1-9的保护性培养物，特征在于在至少7-8℃或以上的温度下该乳酸菌呈现可觉察的代谢活性。
11.如权利要求1-10的保护性培养物，其特征在于该温度为7℃。
12.乳酸菌，其特征在于该乳酸菌属于乳酸乳球菌乳亚种1526菌株(DSM 12415)。菌株(DSM 12415)。
13.如权利要求1-11的保护性培养物的用途，用于保藏在冷藏条件下可保持有限时间的食品和饲料。
14.食品或饲料，其特征在于它含有如权利要求1-11的保护性培养物。
15.如权利要求14的食品，其特征在于该食品选自肉或肉制品、鱼或鱼制品、精美色拉和预烹制膳食。
全文摘要
本发明涉及含有产乳酸的细菌的新型保护性培养物,它用于保藏甚至在冷藏条件下仅保持有限时间的食品或动物饲料。如果冷藏链中断,或者如果超过所述冷藏温度,这些保护性培养物能够抑制对消费者有害的细菌生长。本发明还涉及含有本发明保护性培养物的食品或动物饲料。
文档编号A23B4/08GK1355673SQ00808747
公开日2002年6月26日 申请日期2000年4月5日 优先权日1999年4月9日
发明者D·埃尔泽 申请人:丹尼斯科有限公司