一株具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明筛选得到了一株具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌（Bacillus?subtilis），现已包藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC?No：M?2013490，保藏日期：2013年10月23日。本发明枯草芽孢杆菌在降解水体中氨氮的应用以及在治理水产养殖水体中的应用。本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌可迅速有效的降低水体中的硝酸盐、亚硝酸盐含量，可以改善由于污染造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分。
【专利说明】一株具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物【技术领域】，具体涉及一株具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌及其应用。
【背景技术】
[0002]目前，由于水产养殖规模的不断的扩大，池塘的自净与调节能力已不能满足清除残饵、鱼虾排泄物等富营养因子的需要，养殖水体中氨氮、硝酸盐、亚硝酸盐、硫化物已经严重超标[1]，池塘水质逐渐恶化，甚至危及到各水产品的卫生安全。过度的使用抗生素药物不仅会使细菌的耐药性增强，也会导致微生物和养殖环境的失调，而且抗生素在生物体内残留，人食用后会对人体产生危害。
[0003]从上世纪80年代初，我国在水产养殖生产中开始使用微生态制剂作为水质改良齐?。主要是光合菌，也取得了较好效果，但存在着生产周期长，保质期短，质量不稳定等缺陷。而从池塘淤泥中分离的枯草芽孢杆菌保质期长，产品质量稳定，安全，无毒副作用，因此更适合在养殖生产中使用。因其生产成本低，可制成各种不同的剂型，所以更易于工业化大规模生产。
[0004]倪纯治等[2]在光合菌对养殖水体生态调控的研究中，提到光合细菌施入养殖池后，由于自身的繁殖，使菌数逐渐增加，8~IOd达到高峰。施用光合细菌后，由于光合细菌的繁殖，养殖池中的有害细菌一弧菌、发光细菌减少了，达到净化水质，优化养殖环境，保持养殖池微生态系的平衡。由于光合细菌菌数高峰出现于施入后的第6~8d,因此投放光合细菌的时间间隔以8d左右为宜。
[0005]仇丽[3]在枯草芽孢杆菌在养殖中应用的研究中，说明了虾池中使用枯草芽孢杆菌后，养殖水体的氨氮的含量，育苗期`下降52.5%，养成期下降50%，亚硝基氮含量，育苗期下降50%，养成期下降32.5%，减少补水60%。活菌制剂比化学药物使用量费用节约191元/亩，同期南美对虾平均规格提高lcm，亩产量增加24.08kg，亩曾纯效益118.26元；俞吉安等
[4]在光合细菌抗氧化作用的研究中，在模拟生物膜脂质、蛋白质成份及富含脂质的脑匀浆两个重要测定系统中，肯定了光合细菌对脂质过氧化的抑制作用。
[0006]枯草芽孢杆菌是一种单细胞，无荚膜，内生芽孢，能运动的革兰氏阳性菌。其分布非常广泛，在土壤、动植物体等处皆可发现。枯草芽孢杆菌能产生许多胞外酶，迅速分解水体中有机物，促进硫化物和亚硝酸盐的氧化，并且具有快速生长繁殖和适应环境的能力[5]。熊伟等Μ在海南斑节虾养殖池中使用枯草芽孢杆菌制剂后，养殖池中有害物质如亚硝酸盐、硫化氢显著减少，COD较对照大幅度下降。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一株具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌。
[0008]本发明还要解决的技术问题是提供上述枯草芽孢杆菌的应用。
[0009]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:[0010]本发明的一株具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌是发明人于2012年8月从江苏省南京市排污口淤泥中分离出来的菌株，经过形态学观察、生理生化实验和PCR鉴定，确认为枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国.武汉.武汉大学，邮编430072，保藏编号:CCTCC No:M2013490，保藏日期:2013年10月23日。
[0011]对本发明的上述具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌进行氨氮浓度的降解分析，其结果表明，枯草芽孢杆菌可迅速有效的降低水体中的硝酸盐、亚硝酸盐含量，可以改善由于污染造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分。
[0012]因此上述具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌可以在降解水体中氨氮中应用。
[0013]上述具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌可以在治理水产养殖水体中应用。
[0014]有益效果:本发明筛选得到的枯草芽孢杆菌可迅速有效的降低水体中的硝酸盐、亚硝酸盐含量，可以改善由于污染造成的水质浑浊问题，水质由浑变清，具有很强的净化水质功能，具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，促进饲料中营养素降解，使水产类动物对饲料的吸收利用更加充分。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1枯草芽孢杆菌。
[0016]图2枯草芽孢杆菌菌落。
[0017]图3PH对OD6tltl值的影响结果。
[0018]图4温度对0D600值的影响结果。
[0019]图5氨氮残留浓度随时间的变化曲线。
【具体实施方式】
[0020]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0021]实施例1:
[0022]I菌种来源
[0023]从池塘淤泥中取适量污水带回实验室进行分离鉴定。
[0024]2实验器材和试剂
[0025]2.1实验材料
[0026]肉汤琼脂培养基:牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂18g，蒸馏水1000mL。121°C条件下灭菌15min，4°C保存备用。
[0027]菌种活化培养基:牛肉膏蛋白胨液体培养基:牛肉膏3.0g，蛋白胨l0.0g，NaCl
5.0g, H2O 1000mL, pH7.2-7.4值，分装于150mL三角瓶中，每瓶IOOmL, 121 °C条件下灭菌15min，4°C保存备用。
[0028]氨氮培养基(模拟水体):葡萄糖5.0g, (MM)2SO4 0.25g，NaCl 1.0g, K2HPO4 0.5g，MgSO4.7H20 0.25g，H2O 1000mL, pH值7.0，其中氨氮含量约为50mg/L,再取5mL稀释分装于50mL养管中，121 °C条件下灭菌15min，4°C保存备用。
[0029]LB液体培养基:胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母提取物5g/L，pH=7，121°C灭菌20min，LB固体培养基为在LB液体培养基之中加入18g/L的琼脂。
[0030]2.2实验器材
[0031]培养皿、显微镜、试管、涂布棒、载玻片、接种环、接种针、试管架、三角瓶、烧杯、灭菌锅、培养箱、可见分光光度计:10~30mm比色皿。
[0032]3实验方法
[0033]3.1细菌的分离
[0034]将带回来的污水取几滴用平板划线分离法涂布于肉汤琼脂平板上，并将培养基倒置于37°C恒温箱培养18~24h。选取生长良好的菌落反复接种,经数次培养筛选,挑选在培养基上呈单个、灰白色、不规则、菌落边缘不整齐、表面粗糙的干燥型菌落镜检、观察并进行纯化培养。
[0035]3.2形态学检查
[0036]挑取单个菌落涂片，利用革兰染色法，用油镜进行观察。
[0037]3.3生理生化实验
[0038]对分离的细菌进行常规的生理生化实验。
[0039]葡萄糖发酵产酸、木糖发酵产酸、阿拉伯糖发酵产酸、甘露醇发酵产酸、乳糖发酵产酸、利用柠檬酸盐、淀粉水解、分解酪素、氧化酶、硝酸盐还原、接触酶。
[0040]3.4 PCR 鉴定[7]
[0041]引物的设计与合成:根据GenBank中已发表的枯草芽孢杆菌16S rRNA基因序列应用Primer Premier5.0软件自行设计合成了 I对能扩增I 154bp基因片段的引物,序列为P15' -CACTGGGACTGAGACACGG-3' ，P25' -GGCGGCTGGTCCTAAAA-3'。
[0042]枯草芽孢杆菌基因组DNA的提取:挑取枯草芽孢杆菌单菌落接种到5mL营养肉汤中，37°C震荡培养过夜。
[0043]PCR体系与反应条件:以提取的枯草芽孢杆菌全基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增。反应体系(25 μ L):DNA模板2 μ L，10XPCR Buffer2.5 μ L，上、下游引物(25 μ mol/L)各 0.5 μ L，dNTP2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.25 μ L, ddH2017.25 μ L。优化的 PCR 反应条件-MV 5min ；94°C Imin ；57°C Imin ；72°C Imin ;共 30 个循环；72°C IOmin.PCR 结束后，取5yL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，观察结果。
[0044]3.5降解功能分析
[0045]菌株的活化:用接种环挑取枯草芽孢杆菌菌株接种到活化培养基中，35 °C，120rpm，摇床培养18_20h后，4°C保存备用。
[0046]活菌计数(倾注平板法):用生理盐水逐级稀释，选取最后2个适宜的稀释梯度进行平板倾注，每个梯度设3个平行，培养24h后进行活菌记数。
[0047] 菌株的接种M:将活化的枯草芽孢杆菌按104_105CFU/mL的活菌量加至氨氮培养基中，35°C，120rpm，每隔12h加一次，从第一次加开始计时，加11次，共120h。
[0048]测定方法:每次抽样后用水杨酸分光光度法检测氨氮。
[0049]4结果与分析[0050]4.1分离鉴定
[0051]4.11形态学检查
[0052]单个细胞0.7~0.8X2~3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6~0.9 X 1.0~1.5微米，椭圆到柱状，常成对或呈链状排列，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱襞。需氧菌。如图1和图2所不。
[0053]4.12生化鉴定结果
[0054]表1生化鉴定结果分析
[0055]
【权利要求】
1.一株具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌，其分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，现已包藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC No:M 2013490，保藏日期:2013年10月23日。
2.权利要求1所述的具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌在降解水体中氨氮的应用。
3.权利要求1所述的具有氨氮降解能力的枯草芽孢杆菌在治理水产养殖水体中的应用 。
【文档编号】C02F3/34GK103695353SQ201310714343
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】张志成, 沈志远, 戴鼎震 申请人:金陵科技学院