专利名称：检测HPV的方法及Phi29DNA聚合酶在检测HPV中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于病毒^r测技术领域，尤指一种一企测HPV的方法以及其它 Phi29DNA聚合酶在才企测病毒中的应用。
背景技术：
宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位，世界上每年的新发病例 约为45万，死亡率为50%。 Drs.Rous and Beard最早在1934曾经提出 HPV为致癌物质，此后自1974年ZurHausen提出HPV是宫颈癌的最可 能因素后，国内外学者就HPV感染与子宫颈癌的关系进行了大量的研究， 并荻取了许多实5全室与临床证据。1977年Laverty在电镜中观察到子宫颈 癌活;险组织中存在HPV颗粒，1981年第一次在生殖道分离出了 HPV， 1983-1986年依次从宫颈癌样本中分离出HPV16、 18、 31、 35等型別。1995 年IARC专题讨论会确定HPV感染是子宫颈癌的主要病因。目前研究发 现99.7%的宫颈鳞状细胞癌有人乳头瘤病毒的感染，而高危型人乳头状瘤 病毒的持续感染是宫颈癌发病的重要因素。
人乳头瘤病毒(Human Papillomaviruses, HPV)属乳多空病毒科A亚群 内的一组DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，直径约45nm-55 nm,基因组为共价闭合环状双链DNA分子，含近8000个碱基对(bp)。 HPV基因组含8个开放读码框架；可分为三个基因区，包括两个编码区 和一个非编码调控区。编码区分为E区和L区，E区包4舌E1、 E2、 E4、 E5、 E6、 E7; L区包括L1、 L2,分别编码早期蛋白和晚期蛋白，六个E 蛋白主要负责病毒DNA的复制、转录和细胞转化，两个L蛋白为衣壳蛋 白主要负责病毒颗粒的组装和DNA包装。
当分离林病毒Ll区序列与已知序列近源病毒抹同源性少于90%时， 就可被确定为 一种新的HPV型别，按照HPV亚型与癌症相关性的高低将 HPV分为高危型和低危型。高危型HPV包括HPV-16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 68、 73和82;可能的高危型包括HPV26、 53和66;低危型包4舌HPV6、 11、 40、 42、 43、 44、 54、 61、 70、 72、81和CP6108。 HPV与多种疾病密切相关，低危型HPV能引起良性生殖 器疣；而高危型HPV则可引起宫颈癌、外生殖器癌及高度子宫颈上皮内 瘤等恶性病变。因此，HPV感染的检测和分型对了解女性生殖道肿瘤相 关病情、判断预后、指导治疗、分析HPV流行状况以及基因疫苗的研制 均具有重要价值。
由于HPV具有高度种属特异性，难以在体外常规细胞培养系统中培 养，也不能通过分离病毒来确定型别，目前缺少一种可行的血清学技术检 验手段，因此，HPV的检测只能依赖对其DNA序列的分子水平的检查。
第二代杂交捕获法(hybrid caputure II， HC-II)是经美国FDA认证 的可应用于临床的HPVDNA检测技术，HC-II采用孔平板法，可一次检 测13种高危型HPV病毒(包4舌16、 18、 31、 33、 35、 39、 45、 51、 52、 56、 58、 59、 69)型，具体操作步骤样本DNA双链被释放并分解为核苷 酸单链。DNA单链与RNA探针结合为RNA-DNA杂交体。特异性抗体将 RNA-DNA杂交体固定在微孔壁上。结合有碱性磷酸酶的多个二抗与RNA -DNA杂交体结合，放大信号。碱性磷酸酶使酶底物发光，根据光的强弱 确定碱性磷酸酶的含量，从而确定RNA-DNA杂交体的含量。检测结果的 判断标准是RLU(相对光单位，光信号)/ Cutoff(域值=三个阳性质控指标 的平均值)>1为阳性，<1为阴性。HC-II检测灵敏度高、重复性好且客观 性强，然而缺点是无法明确宫颈病变中感染的HPV型别。
导流杂交技术(简称HybriMax)是一种结合低密度基因芯片与导流 杂交的新型检测技术，可进行21种HPV型别(6、 11、 16、 18、 31、 33、 35、 39、 42、 43、 44、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 CP8304) 的检测。导流杂交技术原理将探针固定于膜纤维中，使目标分子主动导 流穿过固定有探针的薄膜并与互补探针相结合，形成复合物而被固定下 来。未被结合固定的分子穿过薄膜后被除去。因此，它加速了互补分子之 间的相互作用，将杂交时间从几个小时降低至几分钟，比传统杂交法省时 几百倍。21种型别探针共同固定于一张膜条上，检测结果可以通过肉眼 或专用软件获得，阳性点为清晰可见的蓝紫色圆点，根据膜条HPV型别 分布图，判断阳性点为何种型别，结果直观易判。 一台机器一次可检测 15个标本，方便易行。膜条上另固定有杂交对照点Biotin和内对照点IC， 分别检测杂交过程和PCR反应过程。国外报道HybriMax检测诊断高级别 病变的灵敏度为92.7% ,有资料表明，HybriMax与HC-II对13种高危型
4HPV的检测结果总符合率达90%以上。另有数据表明，对HybriMax检测 出的HPV16型标本中的E6/E7基因序列进行测序，发现检测的准确性达 100%。因此，HybriMax可被认为是较理想的HPV检测分型方法。 但是，上述HC-II法和HybriMax法均存在着漏检的可能性。 Phi29DNA聚合酶是从一种携带有噬菌体phi29 DNA聚合酶基因重 组E.coli菌抹(An五.co// strain that carries the phi29 DNA Polymerase gene from bacteriophage phi29 )中发现的，能够在30°C条件下对DNA进行扩 增的酶。这种酶是人们在扩增大的环状DNA模板如质粒或噬菌体DNA 时发现了这种酶具有滚环扩增DNA的能力，由Blanco等于1984年率先 报道(1984， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 81, 5325-5329 )。最早该酶被用于 扩增环状DNA，称为滚环扩增方法。但是后来发现phi29DNA聚合酶还 可以扩增线性DNA (称为多重置换扩增_ multiple displacement amplification, MDA )。在MDA中，phi29 DNA聚合酶和耐核酸外切酶 活性的随机引物，不需要经过PCR热循环过程，只在3(TC条件下恒温即 可反应。将上述反应中的模板换成人类基因组DNA,发现线性的模板同 样也可被扩增，其扩增的机制是一种链置换反应。首先随机6碱基寡核苷 酸作为引物在多个位点与基因组模板DNA退火，接下来phi 29 DNA聚合 酶在DNA的多个位点同时起始复制，它沿着DNA模板合成DNA,同时 取代模板的互补链。被置换的互补链又成为新的模板来进行扩增，成为一 个级联分支的放大系统。因此最终可以获得大量高相对分子质量的DNA， 因而，这种方法4皮称为多重置换扩增(multiple displacement amplification, MDA)。
由于phi29DNA聚合酶对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩 增100kb的DNA模板而不从模板上解离，平均片段长度大于10kb。而 且phi29DNA聚合酶具有高保真性能，其错配率仅为l.'106~ 1:107,相对 于Taq酶的3:104至少低100倍。因此MDA扩增后的产物序列能保证与 模板高度一致。因此，phi29DNA聚合酶最早和最多被用于基因组和测序 中。
phi29 DNA聚合酶扩增具有以下优点
1 .样本无需纯化可用来进行基因组DNA扩增的样本种类有很多， 包括新鲜或水冻的全血、组织培养细胞、口腔拭子细胞、病灶的炎性白膜 层等。在多重置换扩增反应中，样本不需要经过纯化，可以直接作为起始模板进行全基因组扩增，并能获得高纯度的DNA产物。传统样本的处理 往往要经过费时的步骤，很难实现自动化，限制了高通量的使用。而进行 M D A反应的细胞或全血，只要经过简单的裂解步骤就可进行后续的扩增， DNA抽提及各种纯化步骤都省略了 ，有效避免了处理过程中可能的污染， 而且大大简化了操作，特别适用于临床样品的分析和检测。通过MDA扩 增10 000倍甚至获得更多的DNA，而且比通过传统抽提法得到的样本 DNA纯度还要高。这是因为phi29 DNA聚合酶高效的活性能确保各种不 同的模板有一致的产量。另一方面，如果将0.05L的血液加入到100 IxL 的MDA反应体系中，血液被稀释了 2 000倍， 一些抑制反应的因素如血 液中的血红素或样品添加剂EDTA等，经过这样的稀释后所造成的影响 就几乎可以忽略了 。所以能确保未经纯化后的样本经过MDA扩增后有较 高的纯度，可以直接用于后续的遗传分析研究。
2. 产量稳定基因组DNA经过30。C反应4~6h, MDA扩增达到高 峰后维持在一个稳定水平，使所有反应的DNA产量几乎相等。lOOpL的 反应体系中，无论起始模板量差别多大(100fg 10ng),扩增后的DNA 产量都一致保持在20 30g左右，十分稳定。这种一致的产量在某些方 面是很重要的。因为无需对DNA定量，所以允许使用不同起始浓度或数 量的样品，并且对下游的遗传分析提供可重复的结果。而传统的方法所产 生的基因组DNA,在产量和纯度方面都有显著的不同，在进行基因检测 前必须重新测量和调整浓度。而且相对于其他全基因组扩增如PEP法产 生大小不一的短片段，MDA能扩增出集中均一的长片段产物…。这是因 为来自于噬菌体phi29的DNA聚合酶能与DNA模板结合得非常紧密，每 次能持续扩增约70 000个碱基而不解离，所以能在MDA反应中产生长片 段的DNA产物，平均12kb，最长可达100kb。长片段的产物有利于多 方面的应用，包括限制性片段长度多态分析，设计探针及DNA测序等方 面。
3. 对基因组均匀扩增在许多情况下，全基因组扩增应以最低的位 点扩增误差提供尽可能完全的基因组覆盖率，使产物保持模板的遗传序列 信息。任何一种扩增方法都会导致一定的序列偏差，导致的因素很多如引 物效率、模板的结合力、GC含量、与端粒和着丝粒的远近等。 一种全基 因组扩增方法是否有效，取决于能否以最小的扩增偏差代表整个基因组的 能力。这些基于PCR用于WGA的方法如DOP和PEP，因为在不同位点间存在大范围的偏差，从而限制了这些方法的使用。扩增偏差改变了 DNA 序列组成的信息，使它在诊断性的检测中成为不可靠的模板。有些情况下， 基因组的某些区域完全缺失，导致等位基因丟失和误诊的发生。MDA 能使基因组DNA得到均匀的扩增，从而使各个位点达到较完全的覆盖， 确保后续遗传分析的准确性。
4.操作简单，不依赖PCR反应操作比较简单，原始样本(全血、 血浆、细胞等)无需纯化，经细胞裂解提取DNA后，加入到Eppendof管 的反应液中，包括dNTP、六核苷酸随机引物、phi29DNA聚合酶以及酶 緩沖液，然后置于30。C水浴下蜉育4 6h进行多重置换扩增反应，最后 65匸8min灭活酶的活性。反应结束后即可产生大量长片段均一、完整的 全基因组DNA序列。因为反应在水浴中进行，而不是在热循环仪中，从 而避免了 PCR反应所带来的非特异性扩增产物，反应体系可以根据需要 按比例任意配制。该方法高效、简单，非常适合于临床的遗传分析检测。
2007年，Evans MF在Journal of Clinical Pathology上才艮道了用 phi29DNA聚合酵4企测HPV16(Evans MF et al， Use of multiple displacement amplification to amplify genomic DNA before sequencing of the a and B haemoglobin genes J Clin Pathol 2004;57:637-640),获得成功。至今，尚未 见对其他HPV型别检测的报道，也未见对于其他病毒感染检测中的报道。
发明内容
为了解决现有技术中HPV的检出率过低的问题，本发明提供一种 HPV检测的方法，该方法为先采用Phi29DNA聚合酶对患者样品进行全 基因多重置换扩增，然后采用导流杂交进行检测，从而大大提高HPV的 检出率。
本发明 一方面是提供一种检测样本中人乳头瘤病毒的方法，该方法依 次包括如下步骤
A) 提取样本中的DNA;
B) 将步骤A)提取得到的DNA进行扩增；
C) PCR扩增；以及
D) 病毒检测；
其中，步骤B)中所述的扩增为采用Phi29DNA聚合酶对步骤A)提 取得到的DNA进行全基因多重置换扩增。
7较佳地，步骤D)中的病毒检测可以实用现有技术中已知的病毒检测 方法，如HC-II法和采用导流杂交技术(HybriMax法)，优选HybriMax法。
较佳地，所述全基因多重置换扩增(MDA)是步骤A)提取得到的 DNA在含有随机引物、dNTP和Phi29DNA聚合酶的緩沖液中于3(TC温 育4~6小时。
所述样本为动物组织、植物组织或体液中取到DNA的样本。 所述样本较佳地为组织含有病毒血浆、血清中取到DNA的样本。 所述样本更佳地为宫颈刷取样，主要包括宫颈上皮细胞。 本发明的另 一方面是提供Phi29DNA聚合酶在检测病毒中的应用，尤 其是检测人乳头瘤病毒HPV, HPV6、 11、 16、 18、 31、 33、 35、 39、 42、 43、 44、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68、 CP8304以及混合型另寸， 优选HPV16型、HPV16混合型别、HPV31、 HPV53、 HPV58、 HPV18、 HPV52、 HPV6及其他混合型别。
本发明的有益效果本发明的检测方法采用Phi29DNA聚合酶预先处 理临床病毒感染样本，然后再用PCR进行扩增，可以显著地提高HPV的 检出率，提高临床诊断正确率；而且使用Phi29DNA聚合酶进行MDA扩 增，样本无需纯化，对基因组扩增均匀，扩增产量稳定，操作简单，不依 赖PCR反应，无非特异性扩增产物。本发明的检测方法同样适用于其他 类型的病毒感染的临床样本检测。因此，具有极强的临床使用价值。
本发明的方法种MDA扩增与Evans MF进行HPV扩增的报道有着明 显差异(见表l)。
表1本发明与Evans MF报道的差异之处
作用点本发明报道Evans MF才艮道
样本量223例2例
样本加Phi29前DNA灭活95。C加热3分钟碱变性
Phi29处理温度30 。C未描述
中止Phi29处理方法65。C10分钟65°C3分钟
引物扩增HPV的区域和长度El区(450bp) E6/E7区(860bp)
引物扩增HPV的区域和长度2无LCR区(1034bp)
对于临床样本分型导流杂交法无
图l是使用Phi29和不使用Phi29预处理的导流杂交法检测临床HPV 感染的阳性率比较图，其中，空白柱表示不用Phi29预处理的导流杂交法 才企测临床HPV感染的阳性率，斜紋柱表示用Phi29预处理的导流杂交法 检测临床HPV感染的阳性率；
图2是使用Phi29酶预处理后导流杂交检测临床样本HPV感染的漏 检型别的分析。
具体实施方式
实施例1 材料与方法
材料223例经凯普HPV导流杂交仪检测结果为阴性的妇科门诊病 人样本，样本来自上海市以下几个医院上海市第六人民医院、上海市第 九人民医院、上海市普陀区妇幼保健院、黄浦区妇幼保健院、国宾医疗中 心、武警医院，均为门诊病人；Phi29酶购自英国NEB公司(M0269，New England Biolabs );凯普导流杂交仪购自中国凯普生物科技有限公司。
病人样本DNA的抽提采用凯普提供的试剂盒(Hybribio，HPV基因 分型检测试剂盒)操作。
全基因组多重置换扩增(MDA):按照NEB说明书操作，具体步骤 如下取反应緩冲液l[iL、随机引物2.5pL、样品3pL、灭菌双蒸水0.2iiL 混匀，95。C加热3分钟灭活DNA，水上15分钟，接着加入BSA2pL、 dNTP0.75ixL、 Phi29DNA聚合酶0.5|iL,混匀，30。C温育过夜，65。C10分 钟终止反应，以下称其产物为MDA基因组DNA;
PCR扩增用凯普PCR试剂对MDA基因组DNA进行扩增，按照凯 普说明书进行，反应緩冲液23.25pL、 Taq酶0.75、 MDA基因组DNA1 , 混匀，PCR扩增条件为95。C9分钟后，95。C20秒，55。C30秒，72°C30 秒，重复40个循环，最后72。C5分钟；
导流杂交法检测采用凯普提供的试剂盒进行操作(Hybribio，HPV 基因分型检测试剂盒)。
结果
1.导流杂交阴性样本用Phi29酶预处理可以提高阳性检出率。在223 例未经Phi29酶处理而经凯普导流杂交仪检测HPV感染均为阴性的所有样本中，经过Phi29酶处理后，再使用凯普导流杂交仪检测HPV感染情 况，发现其中有28例检出为HPV感染阳性，检出率为12.56% (表2)。 表2 常规导流杂交检测阴性样本经Phi29预处理后再检测的结果
经Phi29预处理后再导流杂交检测
阴性 阳性
总例数223例例凄t 比例 例^L 比例 19587.44% 28 12.56%
2、 使用Phi29酶处理后临床样本的HPV阳性检出率选择用凯普导 流杂交仪检测827例门诊样本，其中HPV阳性样本为245例，因此，用 导流杂交仪的HPV感染的阳性检出率为29.625%。但是如结果1所述， 如果用Phi29酶预处理再用导流杂交检测法，即有12.56%的阴性样本中 可以检出HPV感染。为了分析导流杂交法可能出现的临床漏检程度，本 发明进一步分析了导流杂交的临床样本4全测漏4全率。如结果l,随机挑出 223例经凯普检测为阴性的样本用Phi29DNA聚合酶预处理后再进行导流 杂交检测，有28例才企测为HPV感染阳性，所占比例为12.56 % ，对于凯 普检测来说，漏检率即为(1 - 29.625% ) x 12.56% ，即8.84% ,因此， 使用Phi29DNA聚合酶预处理之后，使导流杂交的阳性率提高了 8.84%， 即从29.625%提高到了 38.46% (如图1所示)。
3、 漏检型别的分析目前发现在用凯普导流杂交仪的漏检的标本中， 多数为HPV16型，其他分别为HPV31、 53、 58、 18、 52、 6以及混合感 染型(12个单独HPV16型感染、6个HPV16和其他型别混合、2个HPV31、 2个HPV53、 1个HPV58、 1个HPV18、 1个HPV52、 1个HPV6、 2个其 他型别mix)。所占漏检百分率为单独HPV16: 42.86%; HPV16混合 型21.43%; HPV31: 7.14%; HPV53: 7.14%;其他HPV型別21.43 %。而分析在漏检的28例样本中，感染型别主要为HPV16型。其中单独 16型感染占42.86% ， 16型混合其他型别占21.43% , 31型占7.14%, 53 型占7.14%，其他占21.43% (如图2所示)。
10
权利要求
1.一种检测样本中人乳头瘤病毒的方法，该方法依次包括如下步骤A)提取样本中的DNA；B)将步骤A)提取得到的DNA进行扩增；C)PCR扩增；以及D)病毒检测；其特征在于步骤B)中所述的扩增为采用Phi29DNA聚合酶对步骤A)提取得到的DNA进行全基因多重置换扩增。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤D)中的病毒检测采 用导流杂交技术进行检测。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述全基因多重置 换扩增是步骤A)提取得到的DNA在含有随机引物、dNTP和Phi29DNA 聚合酶的緩沖液中于10-50。C温育4 6小时
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述样本为动物组 织、植物组织或体液中取到DNA的样本。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述样本为组织含有病 毒血浆、血清中取到DNA的样本。
6. 如权利要求4所述的方法，其特征在于所述样本为宫颈刷取样， 主要包括宫颈上皮细胞。
7. Phi29DNA聚合酶在检测病毒中的应用，其特征在于该病毒为人乳 头瘤病毒HPV或其它病毒HPV的检测。
8. 如权利要求5所述的应用，其特征在于，该病毒为HPV6、 11、 16、 18、 31、 33、 35、 39、 42、 43、 44、 45、 51、 52、 53、 56、 58、 59、 66、 68 、 CP8304以及混合型别。
全文摘要
本发明公开了一种检测样本中人乳头瘤病毒的方法，该方法依次包括如下步骤A)提取样本中的DNA；B)将步骤A)提取得到的DNA进行扩增；C)PCR扩增；以及D)病毒检测；其中，步骤B)中所述的扩增为采用Phi29DNA聚合酶对步骤A)提取得到的DNA进行全基因多重置换扩增。本发明还公开了Phi29DNA聚合酶在检测人乳头瘤病毒中的应用。采用本发明的检测方法时，可以显著地提高HPV的检出率；而且使用Phi29DNA聚合酶进行MDA扩增，样本无需纯化，对基因组扩增均匀，扩增产量稳定，操作简单，不依赖PCR反应，无非特异性扩增产物。
文档编号C12Q1/70GK101619364SQ20081004000
公开日2010年1月6日 申请日期2008年7月4日 优先权日2008年7月4日
发明者昕 何, 姜惠明, 艳 张, 李宁丽, 沈佰华, 利 王, 管爱民, 蔡佩明, 勇 陈, 顾关林, 马式薇, 黄立东 申请人:上海市免疫学研究所;上海多纳美企业发展有限公司