专利名称：一种儿童运动潜力基因分析检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片检测产品，具体的说，涉及一种有关儿童运动潜力基因分析检测的 试剂盒。
背景技术：
一般运动员的锻炼生涯都要从小开始，所以人们通常会在孩子年幼的时候对其运动能力 进行判断评估。由于儿童的运动能力也是随着年龄的增长不断增长的。所以考察运动能力一 般不用正式的工具，而是看一看孩子在某个方面是否不如其他同龄人。这种常用的判断儿童 运动潜力的方法称为动作测试。主要包括以下几个方面-
平衡能力可以通过平衡木或做平衡动作来考察，也可通过经验来观察，如儿童是否能坐 转椅，是否敢荡千秋，是否敢登高等。测试大肌肉能力可以考察儿童的肌肉的力量，如能否 握住单杠，能否把一个东西投得足够远等。测试小肌肉能力可以通过是否能够接到沙包和球 类来考察，也可以通过能否准确地将球击中一个目标来考察。协调性，则可以通过考察儿童 的跳绳和跳舞的协调性，作出评判，有的孩子动作优雅，有的孩子动作笨拙。
动作测试很难确定准确的年龄常模，主要要与其他同龄人中等水平相比较，而不是与好 的孩子相比。所以，必须了解其他孩子的平均水平，才能做出是否落后的判断。
由于年龄常模的确定受限于现有的研究水平，可能导致测试结果有误。另外目前动作测 试的推广范围有相当的局限性。除了一些体校，和数量不多的非常规随机选拔，很少有孩子 有机会接受此类测试。并且由于选拔程序的复杂性，使更多孩子会由于主观因素失去被正确
评估的机会。
人们希望有一种简便而客观的方法可以进行儿童运动潜力测试，提供给需要测试的人以 更多的机会不延误开始运动生涯的最佳时期。
发明内容
为了可以简便而客观地对儿童运动潜力进行测试，本发明提供一种儿童运动潜力基因分
析检测试剂盒，可以以儿童DNA样本为测试样本，对儿童运动潜力的基因进行检测，从而简 便快捷地测试其运动潜力，而不需要等待廖廖无己的选拔。
该试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。 使用时以被测儿童的DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，使用试剂盒在荧光定量PCR 仪上进行反应，结合反应结果进行诊断。
上述的预混PCR反应液含有SYBR green I，以及与儿童运动潜力相关的ACTN3基因突 变位点的扩增引物；扩增引物为包含突变位点的上游引物和下游引物，序列如下 上游引物F 5-GGAGACCCAGAGCCTGCTAAC-3 21 bp
下游引物RC 3-GCACCGACTAGCTCTCGCT-5 19bp下游引物RT 3-ACACCGACTAGCTCTCGCTC-5 20bp。
上述的儿童运动潜力基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照品有2个，分 别包含如下的序列
SEQ1:
GCAAACTCCAGCTGCAG
SEQ2:
AGCAAACTCCAGCTGCAG
上述的儿童运动潜力基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阴性对照品包含的序列
为
SE()3:
TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT
GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC
TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT
GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC
本发明的使用可以在儿童的任何年龄阶段进行，而不受制于动作测试判断方法对建立年 龄常模的依赖性。只需取其DNA样本，比如口腔样本，更客观方便地进行测试。可以对儿童 运动潜力评估提供更多的机会，便于推广应用。
图l，图2,图3为荧光定量PCR仪上的扩增曲线图。该图的横坐标表示循环数，纵坐标 表示荧光值。横线3表示荧光域值；曲线1表示为引物对F + RC，扩增样本所生成的扩增曲 线；曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为Cl;曲线2为F + RT这对引物扩增样本 所生成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C2。
图1是CC纯合基因型扩增产物；
图2是CT纯合基因型扩增产物；
图3是TT纯合基因型扩增产物。图1 、图2、图3上方的Delta Rn vs Cycle,是指A Rn随循环变化的对数扩增图谱； ARn (DeltaRn)是指在给定的 -组PCR条件下所生成荧光信号的对数值。 具体实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，下面实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采 用方法如萨姆布鲁克和拉塞尔主编的《分子克隆实验指南》第三版，或按照制造厂商所建 议的步骤和条件。
实施例l:
试剂盒的制备。包括(1)探针的准备；(2) DNA抽提试剂；(3)预混反应液；(4)标准 阳性对照；(5)标准阴性对照。 (1)探针的准备；
由通常的核苷酸引物合成仪合成。序列如下
上游引物F 5-GGAGACCCAGAGCCTGCTAAC-3 21 bp
下游引物RC 3-GCACCGACTAGCTCTCGCT-5 19bp 下游引物RT 3-ACACCGACTAGCTCTCGCTC-5 20bp。
使用前按每0D引物稀释为100umoL/L (即100pmol/ul)浓度的加水量，开启瓶盖溶解 之前最好在3000-4000转/分钟的转速下离心l分钟，防止开盖时引物散失。使用前，将浓 溶液稀释成工作液10 pmol/ml后进行实验。
(2)DNA抽提试剂:
试剂名称成分体积浓度
缓冲液GASDS100ml0. 5Mmol/L
缓冲液GB,H100ml50mmol/L
缓冲液GD碳酸钠-丙酮100mlIMmol/L
缓冲液GW无水乙醇100ml原液
洗脱液Tris盐50ml10Mmol/L
(3)预混PCR反应液
预混反应液包括2种，每种内含一对上下游扩增引物，各对应一个基因型。按lml配 比量计算，共同的成分配制为lOOuM的dNTP ， 20ul; 500U/ul Taq DNA Polymerase 20ul; 2X Quant One St印SYBR 1300ul; 10uM的上游引物50ul; 10uM的下游引物50ul; RNase-free ddH20 860ul。
管l的l对引物为
上游引物F 5-GGAGACCCAGAGCCTGCTAAC-3 21 bp
下游引物RC 3- GCA CCG ACT AGC TCT CGC T-519bp管2的1对引物为 上游引物F 5-GGAGACCCAGAGCCTGCTAAC-3 21bp 下游引物RT 3陽ACACCGACTAGCTCTCGCTC-5 20bp。
(4)标准阳性对照
标准阳性模板是含有ACTN3基因中含突变核苷酸片段构成的Pucl8-T重组质粒，该重 组质料转化大肠杆菌D H 5 a增殖后用碱裂解法提取，经D N A纯化试剂盒纯化，用分光光 度计测A 2 6 0定量并稀释到103 Copy/ul， 一 2 0 'C保存。贮存存为109 Copy/ul，使用浓 度为105 Copy/ul。
标准阳性模板提供2种，每种浓度为105 C叩y/ul。序列如下 SEQ1:
GC AAACTCCAGCTGCAG: SEQ2:
AGC AAACTCCAGCTGCAG 。
(5)标准阴性对照
标准阴性模板是含有拟南芥基因片断1 8 0个核苷酸构成的Pucl8-T重组质粒。该重组 质料转化大肠杆菌DH5 a增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度 计测A 2 6 0定量并稀释到10s C叩y/ul， 一 2 0 'C保存。贮存存为109 C叩y/ul，使用浓度 为105 Copy/ul。序列如下
SEQ3:
TTCGTTATTGAATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGCTAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCACGTCAGTCTG ATCCCATTAT GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC。
实施例2:试剂盒的使用
(1)样本的制备
取样方式使用棉签在面颊内擦拭10次。
注意为了保证样本不被食物或者饮料污染，取样前30分钟内请勿进食和饮水。
a)处理材料将在面颊内擦拭过的棉签转置于2ml离心管中，用剪刀将棉签部分从其杆 上剪下，加入400 n 1缓冲液GA。b) 加入20 u 1蛋白酶K溶液，涡旋10秒混匀，56'C放置60分钟，其间每15分钟涡 旋混匀数次。
c) 加入400 iil缓冲液GB，充分颠倒混匀，7(TC放置10分钟，此时溶液应变清亮，简 短离心以去除管盖内壁的液滴。
d) 加200wl无水乙醇，充分颠倒混匀，简短离心以去除管盖内壁的液滴。
e) 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CR中(吸附柱CR放入收集管中)， 12，000 rpm ( 13， 400Xg)离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管 中。
f) 向吸附柱CR中加入500 iil缓冲液GD， 12,000 rpm ( 13， 400Xg)离心30秒，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管中。
g) 向吸附柱CR中加入700 ixl漂洗液PW， 12,000 rpm (~13， 400Xg)离心30秒，倒掉 收集管中的废液，将吸附柱CR放回收集管。
h) 向吸附柱CR中加入500 ul漂洗液PW， 12,000 rpm ，~13, 400Xg)离心30秒，倒掉 收集管中的废液。
i) 将吸附柱CR放回收集管中，12,000 rpm (~13, 400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸 附柱CR室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗。
j)将吸附柱CR转入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加20-50 lil洗脱缓 冲液TB，室温放置2-5分钟，12,000 rpm (~13， 400Xg)离心2分钟。重复一次。
(2) 实验过程
a) 按样品数n (样品数=待测样本数+阴性对照1个+阳性对照1个)取预混PCR反应液每 管23ul分装于反应管中。
b) 将上述处理好的待测样本和阴性、阳性对照(务必振荡混匀数秒)各取2ul分别加入 反应管中，混匀，低速离心数秒，立即进行PCR扩增反应。
c) PCR条件 95 。C 10"
95。C 》5';0cycle
6o°c r
(3) 结果分析与判断
a)定量检测SNP的判断标准 当lACtl《1，判断为杂合型；当lACtl》5 ，判断为纯合型。
如图，图1中横线3表示荧光域值；曲线1表示为引物对F + RC，扩增样本所生成的扩 增曲线；曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为Cl;曲线2为F + RT这对引物扩增
样本所生成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C2;
在图1中，|ACt|》5，表示该样本为ACTN3基因CC纯合型样本。图2中横线3表示荧光域值；曲线2表示为引物对F + RT，扩增样本所生成的扩增曲线； 曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为C2;曲线1为F + RC这对引物扩增样本所生 成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为Cl;
在图2中，|ACt|《l，表示该样本为ACTN3基因CT杂合型样本。
图3中横线3表示荧光域值；曲线1表示为引物对F + RC，扩增样本所生成的扩增曲线； 曲线与荧光域值线的交叉点表示Ct循环数值为Cl;曲线2为F + RT这对引物扩增样本所生 成的扩增曲线，其达到域值的循环数Ct值为C2;
在图3中，|ACt|》5，表示该样本为ACTN3基因TT纯合型样本。 b)结果分析
人辅机动蛋白_『3(actn3)只表达于2型纤维蛋白，缺乏不会导致疾病或损伤。因为actn2 可以表达在所有的骨骼肌纤维中，所以认为在actn3缺乏的个体actn2能补偿actn3的部分 功能。大约有18%的人缺乏actn3。 actn3基因C突变为T以后导致编码的第577氨基酸基 因型CGA (精氨酸，R)突变为TGA (终止密码子，X)，从而使基因编码的蛋白提前终止，导致 合成的蛋白不完全。
577RR等位基因型(即CC型)的人更擅长于快速跑步，力量运动和需要忍耐力的运动。 577XR或者XX等位基因型(即CT型或TT型)的人则不擅长。
图1样本的测试结果为577RR等位基因型(即CC型)。
图2和图3的结果分别表示基因型为577XR或者XX等位基因型(即CT型或TT型)。 尽管后天训练对运动员的成绩影响非常大，但运动员要取得足以在奥运会上夺金牌的顶 级运动成绩，特异基因不可缺少，特别是对于需要爆发力的选手来说，ACTN3是绝对的"金 牌基因"。并不是说没有携带ACTN3基因的运动员成绩就不能提商，而是说如果缺少ACTN3基 因，运动员会发现在爆发力项目中如果接受的训练质量相同，他们可以接近最好的运动成绩， 但始终不能达到最好。序列表
<110>上海裕隆生物科技有限公司 〈120〉一种儿童运动潜力基因分析检测试剂盒 〈160〉 6
〈210〉 1 〈211〉 21 <212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈220>
<223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童运动潜力基因分析检测 试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物F。 〈400> 1
ggagacccag agcctgctaa c 21
〈210〉 2 〈211〉 19 <212〉 DNA 〈213>人工序列 〈220〉
〈223〉根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童运动潜力基因分析检测 试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物RC 。
〈400〉 2
tcgctctcga tcagccacg 19
〈210> 3 〈211〉 20 <212〉腿 <213>人工序列 〈220〉
<223>根据核酸碱基配对原理和基因芯片杂交条件设计，以用作儿童运动潜力基因分析检测 试剂盒中相关核酸序列的DNA引物，命名为上游引物RT 。
〈400〉 3ctcgctctcg atcagccaca 20
〈210〉 4 〈211〉 192 <212>画 <213>人属(Homo) <400〉 4
tccttggatg cccaggatgg cgcctcgctc tcgatcagcc tcgggcaacg ttgccttgaa 60 ctgttcgtgt gctgttagca ggctctgggt ctcctccaca gagtgcacga gccacacatc 120 ctgcaggtcc tcaatagccc catccagcca gttattgaag ggggctgccc gccgagcaaa 180 ctccagctgc ag 192
<210〉 5 〈211〉 193 <212〉 DNA 〈213〉人属(Homo)
〈400〉 5 . tccttggatg cccaggatgg cgcctcgctc tcgatcagcc tcaggcaacg ttgccttgaa 60 ctgttcgtgt gctgttagca ggctctgggt ctcctccaca gagtgcacga gccacacatc 120 ctgcaggtcc tcaatagcca caatccagcc agttattgaa gggggctgcc cgccgagcaa 180 actccagctg cag 193
<210> 6 <211> 180 〈212> DNA 〈213〉人属(Homo) 〈400〉 6
Ucgttattg aatcttgttt tggttctctt gtgtggaatg cattgttctt gcUctctgg aacttgggat atgatgacaa aaatacgata tctctaaggc taattgctgt gcggatgaaa tatatttgca cgtcagtctg atcccattat gtatataaca ttaggagttg gtgcatgctc
60 120 180
权利要求
1.一种儿童运动潜力基因分析检测试剂盒，其特征在于由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成；所述的预混PCR反应液含有SYBR green I，以及与儿童运动潜力相关的ACTN3基因突变位点的扩增引物；扩增引物为包含突变位点的上游引物和下游引物，序列如下上游引物F 5-GGA GAC CCA GAG CCT GCT AAC-321bp下游引物RC 3-GCA CCG ACT AGC TCT CGC T-5 19bp下游引物RT 3-ACA CCG ACT AGC TCT CGC TC-520bp。
2. 如权利要求l所述的儿童运动潜力基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阳性对照品 有2个，分别包含如下的序列SEQ1:GCAAACTCCAGCTGCAGSEQ2:AGCAAACTCCAGCTGCAG
3.如权利要求1或2所述的儿童运动潜力基因分析检测试剂盒，其特征在于所述的阴性对 照品包含的序列为 SEQ3:TTCGTTATTG AATCTTGTTT TGGTTCTCTT GTGTGGAATG CATTGTTCTT GCTTCTCTGG AACTTGGGAT ATGATGACAA AAATACGATA TCTCTAAGGC TAATTGCTGT GCGGATGAAA TATATTTGCA CGTCAGTCTG ATCCCATTAT GTATATAACA TTAGGAGTTG GTGCATGCTC 。
全文摘要
一种用于儿童运动潜力基因分析检测的试剂盒，可以克服动作测试在原理和操作上的局限性。本试剂盒由DNA抽提试剂，预混PCR反应液，标准阳性对照品，标准阴性对照品组成。使用时以被测儿童的DNA样本为检测对象，经过样本DNA抽提后，使用试剂盒在荧光定量PCR仪上进行反应，结合反应结果进行诊断。本发明提供的儿童运动潜力测试方法简便而客观，可以给待测者更多的机会不延误开始运动生涯的最佳时期。
文档编号C12Q1/68GK101624617SQ20081004043
公开日2010年1月13日 申请日期2008年7月11日 优先权日2008年7月11日
发明者候洪杰, 汪宁梅, 穆海东, 飒 黎 申请人:上海裕隆生物科技有限公司