基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用

基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用
【专利摘要】本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为基因OsARF4在控制水稻粒长和千粒重中的应用。本发明对水稻中表达的生长素应答因子编码基因OsARF4，利用基因工程技术敲除OsARF4，改良水稻粒长及千粒重性状，从而提高产量。本发明通过设计针对OsARF4基因编码区的sgRNA，利用CRISPR?CAS9技术破坏OsARF2基因编码区，并通过分离去除T?DNA，获得非转基因水稻，此基因改良水稻植株仅在粒长和千粒重方面有明显的提高和改善，基本不改变其它农艺性状。通过比较，基因改良水稻在粒长和千粒重方面都高于其对照。本发明提供的基因及操作技术在提高作物产量方面具有明显的作用，具有很高的应用价值。
【专利说明】
基因在控制水稻粒长和千粒重中的应用
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及在水稻中敲除一种生长素应答因子基因，以提高水稻的粒长和千粒重性状。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上重要的粮食作物之一，全世界有30多亿的人口以稻米为主食L在耕地面积逐渐减少的情况下，为了满足日益增长的人口对粮食的需求，提高水稻单位产量具有重要意义。水稻产量性状属于数量性状(QTL)，由许多效应不同的基因所控制2。以籼型栽培稻PA64与特种大粒稻CW23杂交并与PA64回交构建的产量QTL近等基因系为材料，通过染色体片段叠代定位与基因组序列分析相结合的方法分离克隆了来自CW23基因组的一个控制水稻粒长及千粒重的Q T L gD，研究表明粒型D编码一个功能缺失型SK5S因(Glycogen synthase kinase)3。以野生型GSK5蛋白为诱t耳，在水稻cDNA文库中筛选与之有互作的蛋白，筛选到一个生长素应答基因0sARF4(Auxin Reponse Factor 4)。植物生长素应答因子是调节生长素响应基因表达的一类转录因子，ARFs特异性地与生长素响应基因启动子区域的生长素应答元件(Auxin Response Element，AuxRE)TGTCTC或TGTCNN序列结合，并通过与Aux/IAA蛋白(Auxin/Indole Acetic Acid proteins)和/或ARFs相互作用，调节下游基因的转录4。
[0003]水稻基因组中含有25个ARFs基因，分别位于水稻的10条染色体上5，根据ARFs蛋白中间功能域(Middle Reg1n，MR)中氨基酸组成的分析，可以将ARFs分成两类:MR区富含谷氨酰胺(Glutamine，Q)、丝氨酸(Serine，S)和亮氨酸(Leucine，L)的ARFs大多为转录激活因子;而MR区富含脯氨酸(Proline，P)，甘氨酸(Glycine，G)、丝氨酸和苏氨酸(Threonine，T)的ARFs大多为转录抑制因子5 ^RFs在生长素信号转导通路中起着重要作用，从而调控植物生长和发育的多个方面。

【发明内容】

[0004]本发明提供一种水稻生长素响应基因改良水稻粒长及千粒重性状方面的应用。
[0005]本发明提供的基因是水稻第I号染色体上的一个生长素响应基因，基因编号为 0s01g0927600(NCBI 编号)，1^0(:_0801870270(]\^1]编号)。0^7?/;^的基因组0嫩全长4264bp，共含有14个外显子，序列如SEQ ID N0.1所示(其中红色字体(加粗的)表示外显子(exon)，黑色字体表示内含子(intron))，其结构图见图UOWTM基因编码区⑶S全长为2427bp，序列如SEQ ID N0.2所示，还包括与基因编码序列相似度在90%以上的基因；
基因编码808个氨基酸，具体序列如SEQ ID N0.3所示，还包括与0sARF4蛋白相似度在90%以上的蛋白。0sARF4蛋白含有一个B3 DNA结合结构域(B3 DNA binding domain)，一个生长素响应因子域(Auxin response factor domain),一个具有转录调控功能的中间区域(Middle Reg1n)和一个Aux/IAA蛋白超家族域(Aux/IAA superfamily domain)，具体见图2所示。
[0006]本发明提供一种利用基因改良水稻粒长及千粒重性状方面的应用，具体为:设计针对基因的sgRNA，采用CRISPR-CAS9基因组编辑技术，在基因组特定位置造成碱基突变、缺失或插入;利用孟德尔分离定律在Tl代种子中通过分离而去除插入的含有CRISPR-CAS9和潮霉素筛选标记的T-DNA序列，从而获得没有外源T-DNA插入，但基因组改变的基因改良水稻植株。
[0007]本发明提供设计并合成SgRNA所需的前导序列(GuideSequence)，其序列碱基为: CC-ARF2-F2 5- GTGTGCCACCCACACAGGAGCTCG-3 24mer(SEQ ID N0.8)
CC-ARF2-R2 5- AAACCGAGCTCCTGTGTGGGTGGC-3 24mer(SEQ ID N0.9)
将CC-ARF2-F2和CC-ARF2-R2等量混合后，合成双链。具体为:在94 °C加热5min，在60 °C保持30min。将此合成的双链插入到CRISPR-CAS9载体中。
[0008]本发明提供含有以上设计的SgRNA的CRISPR-CAS9载体。
[0009]本发明提供含有以上CRISPR-CAS9载体的大肠杆菌和农杆菌工程菌。
[0010]本发明提供利用农杆菌将设计的CRISPR-CAS9载体转化到水稻品种日本晴中，并筛选得到基因改良水稻植株。具体方法如下:
(1)构建工程菌:将构建的CRISPR-CAS9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此CRISPR-CAS9载体的基因工程菌；
(2)CRISPR-CAS9载体转化水稻愈伤并获得水稻再生苗:用含有CRISPR-CAS9载体的EHA105侵染水稻愈伤组织，并于22°C培养室中共培养3天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养。经过3-4周培养后，可获得抗性愈伤，将抗性愈伤分化成小苗，种植于水稻田；
(3 )鉴定位点突变情况:设计弓I物将CRISPR-CAS9的编辑位点区域扩增出来，引物序列为:
CC-ARF2-F4: 5-GTGGAGAAGACGACTCCTACG-3 2Imer(SEQ ID N0.10)
CC-ARF2-R4: 5- AAGGAGATGCCTCCTCGGTTG-3 2Imer(SEQ ID N0.11)
PCR产物为620bp。用SacI酶切此PCR产物，若为野生型，则得到290bp和330bp两条条带;若为基因编辑过的植株，假如酶切后得到一条620bp的条带，则为纯和突变体，假如得到290bp、330bp和620bp三条条带，则为杂合突变体。进一步将620bp的PCR产物委托公司测序，确定突变类型;并在后代中筛选没有T-DNA插入，并且突变类型稳定遗传的植株。
[0011 ]本发明提供基因改良水稻在粒长和千粒重方面的应用。敲除水稻基因后，其籽粒长度和重量都比对照提高，具体见图8。基因突变体和对照日本晴稻谷粒长的统计比较见图9，千粒重见图10所示。本发明可显著提高水稻产量，具有很大的应用价值。
【附图说明】
[0012]图1基因组结构图。
[0013]图2 0sARF4蛋白结构图。
[0014]图3酵母双杂交验证0sARF4与0sGSK5的相互作用。
[0015]图4体外口1111(10￥11实验验证0841^4与08631(5的相互作用。
[0016]图5荧光素酶互补实验验证0sARF4与0sGSK5的相互作用。
[0017]图6酶切鉴定基因突变情况。泳道I是没用酶切的对照，泳道2-9为酶切的情况。其中^?/^-CC5的泳道9为全部切开，泳道2、3、4、6、7、8为部分切开，泳道5为没有切开;ARF4-CC8的泳道2、7为全部切开，泳道4、5、6、8、9为部分切开，泳道3为没有切开。
[0018]图7在^?/M-CC5和辦/M-CC8的子代中筛选没有T-DNA插入的植株。其中他/^_CC5是第12、22、25、32为没有T-DNA插入的个体;^?/M-CC8的第3、20、26、27为没有T-DNA插入的个体。
[0019]图8对照日本晴和^?/M-CC5、^?/M-CC8的稻谷长度的比较。其中从上至下依次为日本晴、A?/M-CC5 和 A?/M-CC8。
[0020]图9野生型日本晴对照和突变体稻谷长度的统计比较。
[0021 ]图10野生型日本晴对照和突变体稻谷千粒重的统计比较。
[0022]图11对照日本晴和辦/^-CC5、辦/^-CC8的株型比较。
【具体实施方式】
[0023]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0024]以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规步骤进行，所用材料和试剂均为市售商品。
[0025]实施例1:0sARF4蛋白与0sGSK5相互作用的验证
控制水稻粒长及千粒重的QTL TGW3是一个功能缺失型(??基因(Glycogen synthasekinase)，本发明称之为08?λ5?5。以野生型0sGSK5为诱饵，在水稻cDNA文库中筛选与之有互作的蛋白，筛选到一个生长素应答基因0sARF4(Auxin Reponse Factor OaOsARFA蛋白含有一个B3 DNA结合结构域(B3 DNA binding domain), 一个生长素响应因子域(Auxinresponse factordomain)，一个具有转录调控功能的中间区域(Middle Reg1n)和一个Aux/IAA蛋白超家族域(Aux/IAA superfamily domain)，具体见图2所示。为了验证0sARF4蛋白与0sGSK5的相互作用，并进一步研究0sARF4蛋白与0sGSK5相互作用的具体位置，我们将全长或从N端或C端截短的片段，分别构建在pGADT7载体上，形成AA1-808全长、ΑΑ1-336、ΑΑ341-808、ΑΑ463-808、ΑΑ593-808 等多个载体(图 3)。把以上载体和 ρ6ΒΚΤ7-?；5?5共转化到酵母菌AH109后，打点到营养缺陷培养基上。全长的0sARF4与0sGSK5有相互作用，截短的0sARF4中，AA341-808和AA463-808与GSK5也具有相互作用(图3)。
[0026]为了验证0sARF4与0sGSK5是否具有直接相互作用，我们把全长克隆到pET28a原核表达载体上，将全长克隆到pGEX-4T-l原核表达载体上。转化到原核表达菌株Rosetta(DE3)中，用0.5 mM IPTG诱导表达蛋白。用N1-NTA Agarose(Qiage)IM1IHtHis-0sARF4，用Glutath1ne-Superflow Resin(Clontech)纯化GST-GSK5。把His_ARF4和GST-GSK5体外孵育做pulldown，结果如图4所示，从结果可以看到，单独GST不能与His-ARF4共沉淀，而GST-GSK5与Hi S-ARF4共沉淀。这个实验说明GSK5和0sARF4具有直接相互作用。
[0027]为了验证GSK5和0sARF4在植物细胞中是否具有相互作用，我们用荧光素酶互补实验(split Firefly Luciferase Complementat1n Assay)验证。将全长克隆到JW771 (35S LUC-N)和JW772 (35S LUC-C)载体上，将全长0sGSK5克隆到JW771 (35S LUC-N)和JW772 (35S LUC-C)载体上，分别将以上载体和空载体转化到农杆菌EHA105中，在含卡那霉素和利福平的5 mL LB培养基中震荡培养过夜。设置合适的组合，取0.5个OD6qq的菌液混合，注射到烟草叶片中，2-3天后在LB985植物活体成像系统观察荧光，结果如图5所示。空载体组合nLUC和cLUC，以及空载体和0sARF2或0sGSK5的组合都没有荧光信号，只有含有0sARF4和0sGSK5的组合才有荧光信号。这个实验说明0sARF4和0sGSK5在植物细胞中也具有相互作用。
[0028]实施例2:用CRISPR-CAS9敲除基因改良水稻粒长和千粒重方面的应用
以下实施例采用水稻粳稻品种日本晴(sat i va L.japonica.c v.Nipponbare)为例。利用农杆菌将设计的CRISPR-CAS9载体转化到日本晴基因组中，并筛选得到基因改良水稻植株。具体方法如下:
(I) CRISPR-CAS9载体构建
设计并合成SgRNA所需的前导序列(Guide Sequence)，其序列碱基为:
CC-ARF2-F2 5- GTGTGCCACCCACACAGGAGCTCG-3 24mer(SEQ ID N0.12)
CC-ARF2-R2 5- AAACCGAGCTCCTGTGTGGGTGGC-3 24mer(SEQ ID N0.13)
将CC-ARF2-F2和CC-ARF2-R2等量混合后，合成双链。具体为:在94 °C加热5min，在60 °C保持30min。将此合成的双链插入到CRISPR-CAS9中间载体中6，并通过酶切连接到双元载体PCAMBIA1300 上。
[0029](2) CRISPR-CAS9载体转化农杆菌
将构建的CRISPR-CAS9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中，在LB平板上通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此CRISPR-CAS9载体的基因工程菌。
[0030](3)水稻转基因
A:培养基配方:
N6D固体培养基:N6基本培养基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel + 2 mg/L 2，4_D，pH5.8
N6I固体培养基:N6基本培养基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L水解酪蛋白+40g/L蔗糖+10 g/L 葡萄糖+3g/L Phytagel + 2 mg/L 2，4_D，pH5.2
N6CH固体培养基:N6基本培养基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel + 2 mg/L 2,4-D + 50 mg/L潮霉素B+300 mg/L 头孢霉素，ρΗ5.8
N6R固体培养基:Ν6基本培养基+0.1 g/L肌醇+ 2 g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖+3g/LPhytagel + 2 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA + 50 mg/L潮霉素B+300 mg/L 头孢霉素，pH5.80
[0031 ] B:水稻愈伤组织诱导:
去壳的水稻成熟种子先用70%乙醇浸泡l-2min，然后用15% NaC10(v/v)浸泡并摇晃30min，进行表面灭菌(可在摇床上进行)，然后在超净工作台上用无菌水冲洗3-4次，再将种子放在无菌滤纸上吸干水分后，放在成熟胚愈伤诱导培养基N6D上，28°C暗培养。约10-15天后，可见到从胚的位置生长出愈伤组织。
[0032]C:水稻愈伤组织的继代培养
剥下从成熟胚上长出的愈伤组织，转入同样的N6D固体培养基上，在28°C下继代培养。以后每两周继代培养一次。
[0033]D:农杆菌介导的水稻转基因方法
农杆菌的培养:在转化前一天将含有目的载体的农杆菌加入到50 mL LB + 50 mg/L卡那霉素+ 25 mg/L利福平的液体培养基中，28°C，200 rpm震荡培养12_16h至0D600=0.4_
0.6ο
[0034]水稻愈伤的收集:将培养的水稻愈伤组织在超净工作台上收集到一个灭过菌的容器中待用。
[0035]侵染菌液的准备:将新鲜培养的农杆菌加入到50mL离心管中，5000 rpm,10 min收集农杆菌。用10 mM MgS04洗一次。沉淀悬浮于N6I液体培养基(成分同N6I固体培养基，但不加phytagel)中，调整菌体浓度至OD6qq为0.5，加入AS(乙酰丁香酮)，使AS终浓度为10mM0
[0036]侵染和共培养:在收集的水稻愈伤组织中加入适量体积的农杆菌悬浮液，使菌液没过水稻愈伤组织，室温放置20min，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基，固体培养基为加入100 mM AS的N61固体培养基，24 0C黑暗培养2-3天。
[0037]除菌:将共培养后的愈伤转移至50mL的灭菌离心管，用无菌水清洗3次以上，直至洗脱液体比较清亮。倒出洗脱液后，用加入300 mg/L头孢霉素的N6D液体培养基再洗一次，倒去洗脱液后，将洗净后的水稻愈伤组织倒在一张无菌滤纸上，吸干多余的水分。
[0038]筛选:将洗过的水稻愈伤转移至N6CH固体培养基上，在28 °C暗室中培养。每2周继代一次。约4周后，可看到新鲜长出来的抗性愈伤，将这些抗性愈伤转移到新鲜的N6CH培养基上继代。
[0039]分化:将抗性愈伤转移至N6R固体培养基上，在光照培养室16h光/8h暗培养。一般经过7-10天左右有绿点出现。30-40天后绿点进一步分化出小苗。将小苗种植于水稻田。
[0040](4)鉴定目的位置突变情况
设计弓I物将CRISPR-CAS9的编辑位点区域扩增出来，引物序列为:
CC-ARF2-F4: 5-GTGGAGAAGACGACTCCTACG-3 2Imer(SEQ ID N0.14)
CC-ARF2-R4: 5- AAGGAGATGCCTCCTCGGTTG-3 2Imer(SEQ ID N0.15)
PCR产物为620bp。用SacI酶切此PCR产物，若得到290bp和330bp两条条带，则为野生型;若为基因编辑过的植株，假如酶切后得到一条620bp的条带，则为纯和突变体，假如得到290bp、330bp和620bp三条条带，则为杂合突变体。在本实施例中，酶切后的结果如图6所示，其中^?/^-CC5的第5泳道和^?/^-CC8的第3泳道是完全没有切开的。进一步将这两个样品的PCR产物委托上海杰李生物技术有限公司测序，确定突变类型，其中^?/^_CC5的突变为在目标区域少了一个T，引起移码突变，突变后的⑶S序列如SEQ ID勵.4所示(^?例-(:〇5的DNA序列，其中红色字体(加粗的)表示^?/^-CC5的编码区域)，其编码的氨基酸序列如SEQID N0.5所示;A?/^-CC8的突变为在目标区域多了一个T，也引起移码突变，突变后的⑶S序列如SEQ ID N0.6所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID N0.7所示。在^?/^_CC5和ARF4-CC8这两个植株的后代中通过分离去除T-DNA。利用T-DNA上的潮霉素筛选基因(Hy gr omy c i η )设计引物，引物序列如下所示:
Hyg-F: GCTGTTATGCGGCCATTGTC(SEQ ID N0.16)
Hyg-R: GACGTCTGTCGAGAAGTTTC (SEQ ID N0.17) 提取^?/^-CC5和A?/^_CC8这两个植株后代的基因组DNA，用以上引物PCR扩增，若有T-DNA插入，则可得到一条615bp的条带，若没有T-DNA插入，则不能扩出条带。具体实施例如图7所示。通过筛选，我们得到^?/M_CC5和^?/M-CC8子代中没有T-DNA插入，但基因突变的植株。
[0041](5)基因改良水稻在粒长和千粒重方面的考察
本发明提供的基因在改良水稻粒长和千粒重方面具有很高的应用价值。敲除水稻基因后，其籽粒长度和千粒重都比对照提高，具体见图8所示。OsARFM因突变体和对照日本晴稻谷粒长的比较见图9，千粒重见图10所示。本发明提供的基因和基因工程技术手段在不影响水稻其他农艺性状(图11)的前提下，可显著提高水稻产量，具有很大的应用价值。
[0042I 参考文献:
1.Matsumoto,T.et al.The map-based sequence of the rice genome.NatuH，793-800 (2005).2.Zuo,J.& Li， J.Molecular genetic dissect1n of quantitative traitloci regulating rice grain size.Annual Review of Genetics，48， 99 — 118(2014).3.Yoo,M.J.，Albert, V.A., Soltis , P.S.& Soltis , D.E.Phylogeneticdiversificat1n of glycogen synthase kinase 3/SHAGGY-like kinase genes inplants.BMC Plant B1logy6(2006).4.GuilfoylejT.J.The PBl domain in auxin response factor and Aux/IAAproteins: A versatile protein interact1n module in the auxin response.PlantCeim，33-43 (2015).5.Wang,D.et al.Genome-wide analysis of the auxin response factors(ARF) gene family in rice (Oryza sativa).Genei^A, 13-24 (2007).6.Feng,Z.et al.Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cassystem.Cell Research23, 1229-1232 (2013).0
【主权项】
1.水稻基因在改良水稻粒长及千粒重性状方面的应用，其特征在于，利用基因工程技术敲除水稻基因，以提高水稻的粒长和千粒重性状； 水稻的基因组DNA序列如SEQ ID N0.1所示，以及与制例基因编码序列相似度在90%以上的基因，其编码序列⑶S如SEQ ID N0.2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，基因编码的氨基酸序列如SEQIDN0.3所示，及与0sARF4蛋白相似度在90%以上的蛋白。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，设计针对0d 7?/?基因的s g R N A，采用CRISPR-CAS9基因组编辑技术，在基因组特定位置造成碱基突变、缺失或插入;利用孟德尔分离定律在Tl代种子中通过分离而去除插入的含有CRISPR-CAS9和潮霉素筛选标记的T-DNA序列，从而获得没有外源T-DNA插入、但基因组改变的基因改良水稻植株； 其中，设计并合成SgRNA所需的前导序列为:SEQ ID N0.8,SEQ ID N0.9，将两者等量混合后，合成双链;将此合成的双链插入到CRISPR-CAS9载体中。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，利用农杆菌将设计的CRISPR-CAS9载体转化到水稻品种日本晴中，并筛选得到基因改良水稻植株，具体方法如下: (1)构建工程菌:将构建的CRISPR-CAS9载体通过冻融法转化到农杆菌菌株EHA105中，通过卡那霉素和利福平筛选，获得含有此CRISPR-CAS9载体的基因工程菌； (2)CRISPR-CAS9载体转化水稻愈伤并获得水稻再生苗:用含有CRISPR-CAS9载体的EHA105侵染水稻愈伤组织，并于22°C培养室中共培养3天，再用液体培养基洗去农杆菌后，将水稻愈伤放置在含有合适抗生素的筛选培养基上培养;经过3-4周培养后，获得抗性愈伤，将抗性愈伤分化成小苗，种植于水稻田； (3)鉴定位点突变情况:设计引物将CRISPR-CAS9的编辑位点区域扩增出来，引物序列为..SEQ ID N0.10、SEQ ID N0.11，PCR产物为620bp;用SacI酶切此PCR产物，若为野生型，则得到290bp和330bp两条条带;若为基因编辑过的植株，假如酶切后得到一条620bp的条带，则为纯和突变体，假如得到290bp、330bp和620bp三条条带，则为杂合突变体； 进一步，将620bp的PCR产物测序，确定突变类型；并在后代中筛选没有T-DNA插入、并且突变类型稳定遗传的植株。
【文档编号】C12N15/82GK105950633SQ201610430815
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年6月16日
【发明人】刘建祥, 陆孙杰
【申请人】复旦大学